全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:1787-1790
文章编号:1001-6880(2012)12-1787-04
收稿日期:2012-05-24 接受日期:2012-10-18
基金项目:国家大学生创新性实验计划(101029504)
* 通讯作者 Tel:86-510-85917795;E-mail:mchyang2008@ yahoo． com． cn
高速逆流色谱制备玫瑰红景天中的三种酚性化合物
马朝阳1* ，傅倩云2，栾 霄1，黄 超1
1江南大学食品学院;2 江南大学医药学院，无锡 214122
摘 要:采用高速逆流色谱方法(HSCCC，High-speed Counter-current Chromatography)同时分离三种玫瑰红景天
酚性化合物。玫瑰红景天提取物经聚酰胺吸附多酚后经硅胶柱分级得预分离样品，采用正己烷∶ 乙酸乙酯∶ 甲
醇∶水(4∶ 5∶ 4∶ 5，v /v /v /v)组成的两相溶剂系统对预分离样品进行分离纯化，一次进样 150 mg，一次色谱分离得
到化合物 1:68． 5 mg、化合物 2:8． 5 mg、化合物 3:45． 5 mg，纯度都超过 98%。通过 ESI-MS、1H NMR对其结构进
行鉴定化合物 1 为没食子酸(Gallic acid) ，化合物 2 为没食子酸甲酯(Methyl gallate) ，化合物 3 为山奈酚
(Kaempferol)。结果表明利用 HSCCC可以成功分离三种酚性化合物，分离效果好，产品纯度高。
关键词:高速逆流色谱;酚性化合物;玫瑰红景天
中图分类号:Q946． 889 文献标识码:A
Isolation of Phenolic Compounds from Rhodiola rosea by
High-speed Counter-current Chromatography
MA Chao-yang1* ，FU Qian-yun2，LUAN Xiao1，HUANG Chao1
1Jiangnan University，School of Food Science and Technology;
2Jiangnan University，School of Medicine and pharmaceutics，Wuxi 214122，China
Abstract:A high-speed counter-current chromatography (HSCCC)method was used to separate three phenolic com-
pounds from Rhodiola rosea． The sample was pre-separated by polyamide column and followed by silica column chroma-
tography． Further separation was applied on the pre-separated sample by HSCCC using a solvent system consisting of
hexane-ethyl acetate-methanol-water at a ratio of 4∶ 5∶ 4∶ 5． By one run，68． 5 mg of compound 1，8． 5 mg of compound 2，
and 45． 5 mg of compound 3 were obtained from 150 mg of the pre-separated sample． The purities of the three isolated
compounds were all higher than 98% ． By ESI-MS and1H NMR analyses，these compounds were identified as gallic acid
(1) ，methyl gallate (2)and kaempferol (3)． The results showed that the HSCCC is an effective technique for the sepa-
ration of three phenolic compounds with high purity．
Key words:HSCCC;phenolic compounds;Rhodiola rosea
玫瑰红景天(Rhodiola rosea)在中国和东欧国家
是一种有名的传统药用植物，具有去疲劳、增强学习
和记忆、兴奋中枢神经系统、提高工作效率、耐缺氧、
改善睡眠、预防高原病、抗癌等多种生理功能［1］，目
前是一种很受欢迎的药食两用“适应原”植物。多
酚是其抗氧化活性成分。目前对玫瑰红景天酚性成
分分离的主要方法是多步柱色谱［2，3］，其主要的缺
点是分离过程复杂、回收率低、大量消耗有机溶剂。
近来，高速逆流色谱(HSCCC)作为一种现代分离技
术可以很好弥补柱色谱技术的缺陷，在天然活性成
分的分离上正得到越来越广泛的应用。
HSCCC是 20 世纪 80 年代初期发展起来的一
种连续高效的液-液分配色谱分离技术。由于不使
用固态支持介质，避免了因不可逆吸附引起的样品
损失、失活变性等现象，具有样品无损失、无污染、高
效、快速等优点。目前，高速逆流色谱已被广泛应用
于天然药物成分的分离制备和中药的分析鉴定中，
应用 HSCCC 可以分离纯化黄酮、生物碱、皂苷等有
效成分［4］。同时具有制备量大，分离效果好，速度
快等优势。
目前还没有使用 HSCCC 方法分离玫瑰红景天
酚性化合物的报道。本研究的主要目的是形成一种
简单有效的 HSCCC 方法同时纯化玫瑰红景天提取
物中的三种酚性化合物。
DOI:10.16333/j.1001-6880.2012.12.020
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
样品的提取及 HSCCC 分离的试剂(正己烷、乙
酸乙酯、乙醇、甲醇)均为分析纯;水为二次蒸馏水;
UPLC流动相为色谱纯试剂;玫瑰红景天提取物(西
安小草科技有限公司)。
1． 2 仪器与设备
TBE-300A 高速逆流色谱仪(上海同田生化技
术有限公司) ;KTA泵系统配有紫外吸收检测器和
分步收集器(瑞士通用电气医疗集团) ;HX-1050 恒
温循环器(北京博医康实验仪器有限公司) ;WA-
TERS ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪(美国沃
特世公司) ;BC-202B旋转蒸发仪(上海贝凯生物化
工设备有限公司) ;DL-360B 超声波清洗器(上海之
信仪器有限公司) ;TOF-MS质谱仪(沃特世公司，美
国)。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 溶剂系统的选择
本实验使用 UPLC法来测定三种红景天多酚样
粗品中各组分的分配系数 K 值，来确定用于高速逆
流色谱分离的两相溶剂体系。测定方法如下:配得
不同比例的溶剂体系 10 mL，加入 2． 5 mg 玫瑰红景
天样品超声溶解后静置 2 h，分别取上下相溶液 2． 5
mL浓干，分别用 10 mL乙醇溶解后取 1 mL 溶液进
行 UPLC 测定，测得上下相的峰面积为 A1 和 A2。
分配系数 K 则按下式计算:K = A1 /A2。选取待分
离组分的 K值为 0． 2 ～ 5，且不同相邻组分 K 值之
比大于 1． 2 的两相溶剂体系作为高速逆流色谱分离
过程中的两相溶剂体系。
1． 3． 2 样品前处理
称取红景天粗品 65． 00 g，水溶解后以 1 BV /h
上装有 1L聚酰胺树脂的层析柱(5． 6 × 60 cm)富集
酚性化合物，上样结束后，用 1． 5 BV 水洗柱除去不
被吸附的成分，然后用 95%乙醇洗脱，洗脱物浓干
得 7． 83 g酚性化合物，最后过装有 250 mL 的硅胶
柱(3． 5 × 50 cm) ，收集 650 mL乙酸乙酯-甲醇(16∶
1，v /v)洗脱物，浓干得 2． 38 g 固形物，用于 HSCCC
分离。
1． 3． 3 制备两相溶剂系统和样品溶液
将正己烷、乙酸乙酸、醋酸、水(体积比 4∶ 5∶ 4∶ 5)置
于分液漏斗中，充分振摇后静置 24 h，将上相和下相
分开，超声脱气 20 min 后使用。取 150 mg 的前处
理后的固形物溶于 15 mL 上相流动相作为进样样
品。
1． 3． 4 HSCCC分离
用泵将固定相(上相)以 25 mL /min 的流速泵
入 HSCCC分离柱，固定相充满色谱柱后，打开主机，
转速定为 800 rpm，以 3 mL /min 的流速泵入流动相
(下相) ;待整个系统建立动态平衡后(1． 5 h) ，流速
调为 1． 5 mL /min，由六通进样阀进样，进行 HSCCC
分离。分离过程中根据紫外检测图谱，接收目标成
分，检测波长为 280 nm。收集到的各部分样品溶
液，用旋转蒸发仪蒸干真空干燥得相应的固体成分。
1． 3． 5 UPLC-TOF-MS分析
将收集到的红景天多酚各组分进行 UPLC-TOF-
MS分析，分析条件:采用 UPLCTM BEH C18色谱柱
(100 mm × 2． 1 mm，1． 7 μm) (Waters，USA) ，流动
相为乙腈(0． 1%，v /v)-甲酸水溶液，梯度洗脱程序
如下，0 ～ 8 min，5% ～ 40%乙腈;8 ～ 12 min，40% ～
100% 乙腈。流速 0． 3 mL /min，紫外检测波长 280
nm，柱温 35 ℃，进样量 1 μL。
质谱条件如下:离子源为 ESI，分析模式为负离
子模式。脱溶剂温度 400 ℃，离子源温度 100 ℃，锥
孔气体流速 50 L /Hr，毛细管电压 3000 V，样品锥孔
电压 20． 0 kV，提取锥孔电压 4． 0 kV，捕获气体流速
1． 5 mL /min，载气流速 24 mL /min。质谱扫描范围
m/z 100 ～ 1000。
1． 3． 6 三种化合物1H NMR谱测定
将三种化合物溶于氘代试剂中，其中化合物 1
和化合物 2 溶于氘代甲醇，化合物 3 溶于氘代氯仿
中，在 400MHz 的 Avance 核磁共振仪(Bruker，瑞
士)上测定氢谱，以四甲基硅烷(TMS)为内标物。
2 结果与讨论
2． 1 流动相的选择
成功的 HSCCC分离很大程度上依赖寻找合适
的溶剂系统，可以提供理想的分配系数 K 值，实际
的 K值一般落在 0． 2 ～ 5 的范围内。参考 Ito 方
法［5］，由于所要分离的组分可以溶于乙酸乙酯，所
以溶剂系统的筛选从乙酸乙酯-水(1∶ 1，v /v)开始，
此时三种目标成分的 K 值偏大(表 1) ，说明主要分
配在上相，作为 HSCCC溶剂系统不合适。溶剂系统
的搜寻偏向脂溶性更强的溶剂体系-正己烷∶乙酸乙
酯∶甲醇∶ 水(1∶ 1 ∶ 1 ∶ 1，v /v /v /v) ，而此时的 K 值又
太小，目标成分很快洗出分离效果差。溶剂系统的
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搜寻在此基础上往脂溶性稍弱的溶剂系统［6，7］正己
烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶ 5∶ 4∶ 5) ，此时目标成分的
K值落在合适的范围说明可以作为 HSCCC 分离的
溶剂系统。
表 1 溶剂系统的选择
Table 1 Selection of solvent system
溶剂系统种类
Types of solvent system
比例
Ratio
分离模式
Separation model K1 K2 K3
乙酸乙酯∶水
(ethyl acetate ∶ water) 1∶ 1
反相
Reverse 2． 68 4． 15 6． 17
正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水
(hexane :ethyl acetate :methanol :water) 1∶ 1∶ 1∶ 1
反相
Reverse 0． 06 0． 11 2． 04
正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水
(hexane ∶ ethyl acetate ∶ methanol ∶ water) 4∶ 5∶ 4∶ 5
反相
Reverse 0． 28 0． 46 3． 21
2． 2 高速逆流色谱分离结果
在制备 HSCCC分离过程中，进样量被优化，当
进样量在 80 ～ 150 mg范围内没有流动相和分辨率
的损失，进一步增加进样量时会导致流动相的流失
使分离失败，因此进样量选 150 mg。在分离过程
中，由于化合物 3 的分配系数较大，意味着长的洗脱
时间。所以当化合物 1 和化合物 2 洗脱出来 175
min钟后，流动相流速从开始的 1． 5 mL /min 采用增
大到 3． 0 mL /min，从而减小化合物 3 的出峰时间。
三种化合物分离的 HSCCC色谱图如图 1 所示。150
mg样品经 HSCCC分离后得到化合物 1:68． 5 mg、化
合物 2:8． 5 mg、化合物 3:45． 5 mg，根据 UPLC 中峰
面积比例可以得到它们的纯度分别达到 99． 1%、
98. 5%、99． 4%。三种化合物的 UPLC色谱图如图 2
所示。
2． 3 三种化合物的结构鉴定
三种化合物的质谱数据(图 3)和1H NMR 数据
如下:
化合物 1:C7H5O5，［M-H］
-169． 0124 (error:5． 5
ppm) ;1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ;7． 08 (2H，s，
H-2，6)。
图 1 分离三种化合物的 HSCCC色谱图
Fig. 1 HSCCC chromatography of pre-treated Rhodi-
ola rosea extract
图 2 粗分离样品及纯化的三种化合物的超高效液相色谱
图，其中图 A为粗分离样品，化合物 1(图 D)为没食
子酸、化合物 2(图 C)为没食子酸甲酯、化合物 3(图
B)为山奈酚
Fig. 2 UPLC chromatograms of the pre-treated crude extract
(A) ，the purified compound 1 (D) ，compound 2 (C)
and compound 3 (B)
化合物 2:C8H7O5，［M-H］
-183． 0293(error:5． 5
ppm) ;1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ:7． 06 (2H，s，
H-2，6) ，3． 90 (2H，s，-CH3)。
化合物 3:C15H9O6，［M-H］
-285． 0399(error:5． 2
ppm) ;1H NMR (400 MHz，CDCl4)δ:8． 11 (2H，d，J
= 8． 7 Hz，H-2’，6’) ，6． 93 (d，J = 8． 7 Hz，H-3’，
5’) ，6． 40 (1H，J = 2． 0 Hz，H-6) ，6． 19 (d，J = 2． 0
Hz，1H)。
基于以上数据，三种化合物鉴定为没食子酸
9871Vol. 24 马朝阳等:高速逆流色谱制备玫瑰红景天中的三种酚性化合物
(Gallic acid)［8］，没食子酸甲酯(Methyl gallate) ，山
奈酚(Kaempferol)［9］。
图 3 三种化合物的电喷雾质谱图，化合物 1:没食子酸;
化合物 2:没食子酸甲酯;化合物 3:山奈酚
Fig. 3 ESI-MS spectra of three separated constituents，com-
pound 1:Gallic acid;compound 2:Methyl gallate;
compound 3:Kaempferol
3 结论
本文应用高速逆流色谱分离玫瑰红景天酚性化
合物，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶ 5 ∶ 4 ∶ 5，v∶ v∶ v
∶ v)作为制备型逆流色谱分离的溶剂系统，分离得
到 3 个酚性化合物，单体化合物的纯度经高效液相
色谱检测均高于 98%。将 HSCCC 与常规柱色谱分
离方法相结合，可以提高分离效率，在天然活性成分
的分离纯化方面有广阔的应用前景。
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