全 文 ：制备薄层(CHCl3-MeOH-H2O=3∶1∶0.1 展开),得
一淡黄色结晶(薄层检测为单一圆点),该结晶与已
知物芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照 , TLC 中 Rf 值
一致 ,测混合 mp不下降 , IR图谱一致。
4　讨　论
化合物 Ⅰ:白色结晶性粉末(MeOH), mp 140 ～
141℃。EIMS 给出分子离子峰 m/ z:681(M +),结
合1H-NMR , 13C-NMR确定分子式 C42H83O5N 。根
据该化合物的分子式 ,计算其不饱和度为 2 。化合
物Ⅰ的 IR谱吸收峰提示:该化合物含有羟基和氨
基(3 310 ,3 210 cm-1)、双键(1 640 cm-1)、酰胺羰
基(1 620 cm-1)[ 5] 、氨基(1 540 cm-1)和反式双键
(960 cm-1)。该化合物的红外光谱(3 220 , 1 620 ,
1 540 cm-1)和分子离子峰 681 ,均证明该化合物为
酰胺醇类化合物 。
1H-NMR谱提示:该化合物含有长的脂肪链 ,
而且该脂肪链中包含 34 个 CH2 结构片段 , 同
时 , 1H-NMR谱中还给出 6 个连氧或连氮碳上质子
的信号(δ4.53 ,4.49 , 4.18 ,3.60 ,3.50 , 3.40各 1个
H),两个双键上质子的信号:δ5.38(2H , m),在低场
区还给出酰胺质子的信号:δ7.34(1H , d , J=9.0
Hz)。该化合物的13 C-NMR 给出一个羰基信号
(δ173.5)、2个双键信号:δ130.20和δ129.60 ,4个
连氧碳的信号(δ60.6 , 71.2 , 71.2 , 74.7)和一个连
氮碳的信号(δ51.5)。根据以上分析 ,表明化合物 Ⅰ
为一个神经鞘胺醇类化合物[ 9] 。
通过对其各个碎片离子峰进行归属 ,确定羟基
的取代位置在 2 ,3 ,4 ,2′位 。其主要碎片离子峰 355
为氨基α裂解形成的离子 。对化合物 I 的 EIMS 中
各个碎片离子的归属(表 1),确定该化合物 Ⅰ的结
构为 2′, 1 , 3 , 4-四羟基-二十一酰-2-(6-烯)-二十一
胺 。通过与文献报道的已知化合物(2S ,3S , 4R)-N-
[ (2′R)-hydro xytet racosanoate-1 , 3 , 4-t rihydroxy-2-
amino-octadeca-6-ene的光谱数据进行对照[ 9] ,我们
发现化合物 I 的1H-NMR中 2 ,3 , 4 ,2′位质子的化学
位移值和偶合常数与对照物的 2 , 3 ,4 , 2′位质子的
化学位移和偶合常数相互一致 。因此 ,我们确定化
合物 I的立体结构为 2′R , 2S ,3S , 4R构型。通过以
上分析 ,确定化合物 Ⅰ为 2′, 1 , 3 , 4-四羟基-二十一
酰-2-(6-烯)-二十一胺 ,该化合物为一个新化合物 ,
T LC检测发现其存在于原植物中 ,我们将其命名为
雪莲鞘胺醇(xuelianceramide)。
致谢:中国医学科学院药物研究所代测核磁共振谱和质谱。
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(收稿日期:2001-09-25)
高寒藏药白花假龙胆的组织培养研究
霍丽云1 ,郑晓建2(1.山东教育学院生化系 ,山东济南 250013;2.山东大学生命学院 ,山东济南 250100)
作者简介:霍丽云 ,女 ,副教授 Tel:(0531)6401265
摘要:目的　研究不同条件对愈伤组织诱导 、继代和分化的影响 ,探讨白花假龙胆的无性快速繁殖的可能性。方法　用白花
假龙胆的胚轴 、幼叶及未成熟种子诱导愈伤组织并再生植株。结果　选用 MS , B5 和 N 6 3 种培养基 , 其中以附加 2 , 4-D(2 , 4-
二氯苯氧乙酸)3.0 mg·L-1+KT(激动素)1.0 mg·L-1的MS 培养基诱导率最高;以附加 6-(6-苄基腺嘌呤)BA 0.5 mg·L-1+
NAA(萘乙酸)0.2 mg·L-1的 MS 培养基分化苗频率最高;以附加 2 , 4-D 2.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1的 MS 培养基愈伤组
织的生长最好。结论　外植体 、培养基 、激素 、培养条件等对愈伤组织诱导 、继代和分化均有明显影响。
关键词:白花假龙胆;组织培养
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中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-2494(2002)06-0415-04
Studies on tissue culture of Gentianella albifpra
HUO Li-yun1 , ZHENG Xiao-jian2(1.Department of Biochemistry , Shandong Education College , J inan 250013 , China;2.
School of Life Science , Shandong University , J inan 250100 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the influence of different cultivation conditions on the induction , maintenance and differentia-
tio n of the calli.METHODS　Calli and the regenerative plants w ere induced from young leaves , immature seeds and hypocotyl of gen-
tianella albifora Ma.RESULTS　Three kinds of media , MS , B5 and N 6 were used in the experiment.Calli w ere induced w ith the
highest frequency onto MS media containing 3 mg·L-1 2 , 4-D and 1 mg·L-1 KT.The regenerated plants were obtained with the
highest frequency on MS medium containing 0.5 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 NAA.CONCLUSION　The induction ,maintenance
and differentiation o f the calli were affected significantly by the basic media and compound of 2 , 4-D and KT in the media and cultiva-
tio n conditions.
KEY　WORDS:Gentianella albi fpra;tissue culture
　　藏药植物———白花假龙胆(Gent ianella albi f-
pra Ma.)系龙胆科(Gentianaceae)植物 ,在青海省生
长于海拔 2 200 ～ 3 600 m 的高寒地区 ,一年生草
本 ,全草入药 ,有清热解毒 ,舒肝利胆之功效 ,与同科
植物川西獐牙菜(Swert ia mussotii Franch)及抱茎
獐牙莱(Swertia franchetiana H .Smith)同等入
药[ 1] 。可用于治疗黄胆型肝炎 ,病毒型肝炎。1995
年以来 ,我们搜集了青海省专治肝炎的多种藏药材 ,
这些植物生长在雪线附近 ,难以引入低海拔地区种
植 ,因此对它们进行组织培养具有重要价值。本文
首次报道了白花假龙胆的无性系建立及培养结果 。
1　材料和方法
1.1　愈伤组织诱导
供试材料为野生品种白花假龙胆 ,采自青海省
海北州 。外植体:未成熟种子(未形成种皮 、2 mm
左右 、白色)及由未成熟种子萌发的幼叶和胚轴。接
种时 , 将未成熟种子置于 0.25%升汞溶液中 10
min ,无菌水冲洗 3次 ,分别转入诱导培养基和无激
素 MS培养基上萌发出苗 ,待种子出苗后 ,切取 2 ～
3 mm 小段的胚轴和 0.5 mm 大小的幼叶于诱导培
养基上。培养基以 MS 为基本培养基[ 2] ,还试用了
B5 ,N6 2 种培养基[ 2] , 附加不同激素浓度组合(表
1)。蔗糖 3%,琼脂 0.8%,PH 5.8 ,在 137.3 kPa压
力下灭菌 20 min , 温度(25 ±2)℃,光强 1 000 ～
1 200 lx ,每日光照 10 h 或黑暗下培养。
1.2　愈伤组织继代
愈伤组织继代 6次日龄为 30 d 时 ,转至 MS 和
B5培养基上 ,激素组合为 2 , 4-D(2 , 4-二氯苯氧乙
酸)3.0 mg·L-1 +K T(激动素)0.5 mg·L-1 ,每种
接种 10瓶按文献[ 3]的方法 ,培养 30 d后 ,测定愈
伤组织鲜重 ,取平均值(g·瓶-1)。其它不同激素组
合的愈伤组织鲜重按同法测定 ,培养条件同上。愈
伤组织每月继代 1次 ,进行转移培养 。培养细胞生
长量以细胞鲜重的增长倍数表示。即接种后若干
天 ,细胞鲜重与接种时细胞鲜重之比 。
1.3　愈伤组织分化
将继代培养 6次后的愈伤组织转入分化培养基
上 。分化培养基为附加 6-BA(6-苄基腺嘌呤)0.5
mg·L -1+NAA(萘乙酸)0.2 mg·L-1的 MS 培养
基 。壮苗培养基为 1/2 MS+0.1 mg·L-1 NAA ,培
养条件同上 。
2　结果与讨论
2.1　愈伤组织的诱导
培养 1周后 ,胚轴切段的两端切口处膨大;10 d
左右 ,未成熟种子整体膨大或先出苗再从幼叶和胚
轴处整体膨胀;4 周左右 ,幼叶从叶脉周围处膨胀 ,
开始形成愈伤组织 。
影响愈伤组织诱导率的因素　①培养基:在同
样附加 2 , 4-D 3 mg·L -1+KT 1 mg·L-1的 MS ,B5 ,
N6 3 种培养基上 ,未成熟种子 、幼叶和胚轴均诱导
出愈伤组织 ,但 3种培养基对不同外植体诱导愈伤
组织的频率有一定差异 , 见表 1 。从表 1 可见 ,以
MS培养基中最好 ,B5 次之 ,N6 较差。表明挑选合
适的培养基对愈伤组织诱导是必要的。 ②外植体:
白花假龙胆不同外植体在 MS ,B5 , N6 上愈伤组织诱
导率不同 ,见表 2。总的情况是 ,容易产生愈伤组织
的部位 ,无论在哪一种培养基上 ,诱导率都较高 。如
胚轴的愈伤组织产生频率达 90.1%,愈伤组织生长
·416· Ch in Pharm J , 2002 June , Vol.37 No.6 　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2002年 6月第 37卷第 6期
旺盛 。相反 ,不容易产生愈伤组织的部位 ,无论在哪
一种培养基上 ,诱导率都较低 ,如幼叶的愈伤组织诱
导只有 11.5%。生长势较弱。白花假龙胆未成熟
种子产生的愈伤组织不仅数量多 ,而且质地好 ,生长
迅速 。结果表明 ,胚轴最易诱导 ,其次是未成熟种
子 ,叶片最难诱导。 ③激素组合:试验结果表明以
MS基本培养基添加不同激素组合 ,胚轴 、未成熟种
子和幼叶都诱导出愈伤组织。单加生长素(2 , 4-D)
的培养基 I 形成愈伤组织较少 ,同时使用 2 , 4-D 和
KT 的培养基Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ, Ⅴ不但愈伤组织诱导率高 ,
生长也较快 ,其中以培养基 IV 诱导率最高 。同时
添加 NAA和 6-BA 培养基的愈伤组织诱导率也很
高 ,但愈伤组织易长出不定根。
表 1　不同培养基愈伤组织的诱导率
Table 1　F requency of calli induced from different media
培养基 外植体 接种数 出愈数 愈伤组织诱导率/ %
MS+2.4-D3.0+KT1.0 胚轴 60 54 90
未熟种 128 102 79.7
幼叶 52 6 11.5
B5+2.4-D3.0+KT1.0 胚轴 54 45 83.3
未熟种 81 58 71.8
幼叶 43 4 9.3
N6+2.4-D 3.0+K T1.6 胚轴 52 36 69.2
未熟种 75 37 49.3
幼叶 21 2 49.5
表 2　不同激素愈伤组织的诱导率
Tab 2　Frequency of calli induced from different hormone
代号 培养基附加激素 未成熟种子接种数 出愈数 诱导率
胚轴
接种数 出愈数 诱导率
幼叶
接种数 出愈数 诱导率
Ⅰ 2.4-D3.0 23 12 52.2 18 2 11.1 65 32 49.2
Ⅱ 2.4-D1.0+KT2.0 40 31 77.5 26 2 7.7 72 49 68.1
Ⅲ 2.4-D2.0+KT1.0 42 34 81.0 38 4 10.5 90 67 74.4
Ⅳ 2.4-D3.0+KT1.0 60 54 90.1 52 6 11.5 128 102 79.7
Ⅴ NAA0.5+6-BA0.2 38 34 89.5 36 4 11.1 75 58 77.3
　　上述资料表明 ,诱导假龙胆的愈伤组织 ,培养基
内添加生长素是必要的 ,而且以 2 ,4-D浓度较高诱
导效果更好 。这种结果与 Yamada 等的报道一
致[ 4 ～ 5] 。K T 能提高愈伤组织诱导频率 ,而且可改
善愈伤组织质量 ,有利于致密愈伤组织的诱导 。可
见 ,兼用生长素和 KT 增效作用很明显 。这一结果
与一些报道不一致[ 6] ,但与 Flick 等[ 7]的报道一致 。
看来 ,能否有效的脱分化而产生愈伤组织 ,培养基中
激素种类及浓度配比得当是最重要的。
2.2　愈伤组织的继代培养
2.2.1　愈伤组织细胞的生长动态　将愈伤组织细
胞团接种在新鲜 MS继代培养基上 ,随着培养时间
的延长 ,细胞数量在不断改变 ,呈一定的规律性。本
实验中假龙胆愈伤组织细胞生长数量的改变基本呈
S 曲线 。愈伤组织细胞生长的各个时期大体为:延
迟期 5 ～ 10 d ,对数生长期 10 ～ 15 d ,减慢期约在 20
d左右 ,生长 25 ～ 30 d后进入静止期。其中 ,对数生
长期细胞数目迅速增加 ,细胞体积增大 ,单位时间细
胞的增长速度达到高峰 。进入静止期后 ,颜色由浅
黄色逐渐变成棕褐色或灰白色。此时 ,如不及时转
移愈伤组织 ,细胞易变褐而死亡 。愈伤组织增殖倍
数与培养天数之间的关系见图 1 。
2.2.2　影响愈伤组织生长的因素　白花假龙胆愈
伤组织继代培养半年后 ,在含 2 ,4-D 2.0 mg·L -1 +
KT 0.8 mg·L-1的培养基上生长的情况见表 3。结
果表明 , MS培养基比 B5 培养基更适于其愈伤组织
图 1　增殖倍数与培养时间的关系
Fig 1　Relation of multiple of increase versus time of cultivation
表 3　培养基对愈伤组织生长的影响.n=10
Tab 3　Effect of different media on grow th calli.n=10
培养基 接种量/g·瓶-1 月增殖量/ g·瓶-1 增殖倍数/倍·月-1
MS 0.2 1.9 9.5
B5 0.2 1.3 6.5
的生长。在 MS 培养基上愈伤组织颜色多为黄色 ,
少数为浅黄色或白色质地变硬。
将不同处理下培养 1个月的愈伤组织称重 ,见
表 4 ,可以看出 ,在 2 ,4-D 2.0 mg·L-1+KT 0.2 mg
·L-1的处理下 ,愈伤组织增殖最慢;在 2 , 4-D 2.0
mg·L-1+KT 0.8 mg·L-1时愈伤组织的增殖最快 ,
同时瘤状愈伤组织的增殖效果也最好 。表明 K T 对
愈伤组织生长有促进作用;当 0.2 mg·L-1的 NAA
分别同 0.4 mg·L-1的 6-BA 和 0.2 mg·L-1的 KT
组合时 ,生长速度均明显降低 ,分化出大量不定根 ,
说明 NAA 有利于根的分化 ,而 2 , 4-D 则有利于愈
伤组织的生长。这种结果符合根发生的一般规律。
2.3　愈伤组织的分化
·417·中国药学杂志 2002年 6月第 37卷第 6期　　　　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2002 J une , Vol.37 No.6
表 4　不同激素组合对愈伤组织生长的影响
Tab 4　Effect of different hormone on g rowth calli
培养基/mg·L-1 增殖倍数 愈伤组织生长情况
MS+2 , 4-D1.0+KT0.2 3.27 多数浅黄色 ,较疏松
MS+2 , 4-D1.0+KT0.4 8.76 多数浅黄色 ,较紧密。有颗粒状
　结构
MS+2 , 4-D2.0+KT0.2 2.1 多数灰褐色 ,非常疏松
MS+2 , 4-D2.0+KT0.8 9.5 黄色 ,多为颗粒状结构 ,较紧密
MS+NAA0.2+KT0.4 2.5 黄色 ,有粒根分化(平均4.4 条/
　瓶),疏松
MS+NAA0.4+6BA0.2 2.3 浅黄色 ,疏松 、分化不定根
　　在含 6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的
MS培养基上挑选 200 块未成熟种子 、胚轴和幼叶
所诱导的愈伤组织进行分化培养 ,结果表明未成熟
的种子 、胚轴和幼叶愈伤组织均可再生绿苗 ,但再生
苗频率不同见表 5。从表 5可见 ,未成熟种子的分
化苗频率最高(41.9%),而幼叶仅为 10 %。继代培
养时间对愈伤组织分化苗频率也有影响。随着继代
时间的增加 ,分化苗频率也逐渐降低 ,并且畸形苗比
例增高 。及时把 1 ～ 2 cm 高的小苗转移到壮苗培养
基上 ,可获得健壮小苗 。小苗长至 6 ～ 7 cm 高时 ,便
可移栽于花盆。关于分化 ,Gautheret认为是受特殊
物质决定的 ,分化能力的丧失是由于在培养过程中
耗尽了在原有母体组织中存在的与分化有关的物
质 。许智宏[ 8] 认为植物激素在分化中有着明显的
调节作用 ,它们以直接或间接的方式影响基因的活
性 。分析白花假龙胆愈伤组织分化再生能力的降
低 ,可能与外源激素的种类和浓度有关。同时 ,内源
激素是否平衡也可能直接影响到愈伤组织的分化。
表 5　外植体和继代时间对愈伤组织分化苗的影响
Tab 5　Effect of different explant and subculture on differentiated calli
继代时间/月 未成熟种子愈伤组织转移块数 分化苗块数 分化苗频率/ %
胚轴愈伤组织
转移块数 分化苗块数 分化苗频率/ %
幼叶愈伤组织
转移块数 分化苗块数 分化苗频率/ %
1 200 82 41.0 200 72 36.0 200 21 10.5
6 200 70 35.0 200 65 32.5 200 19 9.5
12 200 42 25.0 200 38 19.0 200 5 2.5
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(收稿日期:2001-07-06)
高山红景天多糖 RSA的分离纯化和组成分析
汉丽萍1 ,梁忠岩2 ,张丽萍2 ,汉丽梅3 ,宫汝醇1 ,马晓红1(1.通化师范学院生物系 ,吉林 通化 134002;2.东北师范大学生命科学
学院 ,吉林 长春 130024;3.沈阳农业大学牧医学院 ,辽宁沈阳 110161)
摘要:目的　从高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bo r.)根状茎中提出水溶性粗多糖 RSP(Rhodiola sachalinensis polysac-
caride)。从粗多糖中分离出均一多糖并研究其单糖组成。方法　酸性乙醇分级 ,得 RS-Ⅲ(Rhodiola sachalinensis polysaccaride
Ⅲ), 脱蛋白 ,脱色 , DEAE-Sephadex A-25 柱层析纯化 , 得一级分 RSA(Rhodiola sachalinensis polysaccaride A),比旋光度法 , 柱层
析等方法检验纯度 , PC 和 GC测其单糖组成。结果　RSA 为均一级分 ,单糖组成为:Ara, Rha , Xy l , Glc , Gal , GalA , 摩尔比依次
为 1.00∶3.23∶0.26∶0.34∶0.84∶10.24。结论　RSA 为酸性杂多糖 ,相对分子质量约为 50 000。
关键词:高山红景天;多糖;酸性杂多糖
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-2494(2002)06-0418-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目(939870172)
作者简介:汉丽萍 ,女 ,硕士 ,讲师 Tel:(0435)3960852 E-mail:hanliping66@163.net
Purification and composition analysis of a polysaccharide RSA from Rhodiola sachalinensis A.Bor.
·418· Ch in Pharm J , 2002 June , Vol.37 No.6 　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2002年 6月第 37卷第 6期