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绣线菊再生体系的建立



全 文 :北方园艺2016(08):89~92 ·生物技术·
第一作者简介:王大庆(1969-),男,博士,研究员,现主要从事农业
经济等研究工作。E-mail:183189637@qq.com.
收稿日期:2016-02-14
DOI:10.11937/bfyy.201608025
绣线菊再生体系的建立
王 大 庆,张   娇
(黑龙江省农垦经济研究所,黑龙江 哈尔滨150036)
  摘 要:以金山绣线菊的茎尖、茎段、叶片、叶柄为外植体,以 MS培养基为基本培养基,在初
代、继代增殖和生根培养等不同阶段通过添加不同种类和浓度的激素进行对比试验,建立了适
宜金山绣线菊组织培养的再生体系。结果表明:诱导愈伤组织培养基为:MS+1.0mg/L 6-BA
+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2,4-D,愈伤组织诱导不定芽培养基为:MS+0.8mg/L TDZ+
0.10mg/L NAA,生根培养基为:1/2MS+0.25mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,腋芽增殖培养基
为:MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA。
关键词:金山绣线菊;组织培养;再生体系;优化
中图分类号:S 682.1+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)08-0089-04
  金山绣线菊(Spiraea×bumalda‘Golden Mound’)
属蔷薇科绣线菊属灌木,产于河南、陕西、山东、江苏、浙
江等省,喜光也稍耐阴,不耐寒冷和干旱,耐修剪,且萌
芽萌蘖能力强,生态适应性一般。枝繁叶茂,复伞房花
序,花瓣粉红色,花期长,观赏性很强,是一种有很高应
用和观赏价值的园林植物。我国绣线菊属植物资源丰
富,也相继有学者对粉花绣线菊、绣球绣线菊等属内其
它品种进行了研究,但是目前很少开展对金山绣线菊的
深入研究工作[1-2]。1978年报道了日本绣线菊的组织培
养和快繁体系[3-4];之后的中科院昆明植物研究所等几
个单位先后报道了椭圆叶绣线菊、粉花绣线菊等变种的
组培与快繁技术应用研究情况[5-8];萤雅茹等[9]研究得出
了柳叶绣线菊由腋芽到成苗的各阶段培养基配方;张立
    
磊等[10]以MS培养基为基本培养基,初步建立了金叶绣
线菊组培快繁模式,可见对于金山绣线菊组织培养的研
究不深入;刘慧民等[11]的研究表明,金山绣线菊是绣线
菊家族中抗寒性和生态适应性都较弱的品种,因此,研
究构建金山绣线菊的组织培养再生体系可为金山绣线
菊进行分子生物学方面的研究(转基因、基因克隆、基因
沉默等)奠定理论基础[12-14]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料选取东北农业大学园艺试验站温室和室
外露地栽培的金山绣线菊植株。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的选择与消毒 4—5月选择晴朗无风天
气的上午,分别采集温室和露地栽植长势良好的金山绣
线菊当年新生枝的茎段、茎尖、叶片和叶柄作为外植体,
不定芽途径的外植体选择温室和室外露地栽培的生长
  
Abstract:The anther of Chinese cabbage and B5medium were used to study the efect of adding diferent concentrations of
sucrose,agar,2,4-D,6-BA,potato and the culture time in weak light on the formation of vitrification and browning at
embryo and seedling growth stage.The results showed that the rate of vitrification was increased by adding 2,4-D and
lower concentration of sugar to medium at embryo growth stage.At seedling growth stage,the rate of vitrification and
browning was inhibited by the longer culture time in natural light,the rate of vitrification was 52.00%,37.50%,23.91%
and 22.92%respectively,and the rate of browning was 20.00%,14.58%,8.69%and 8.33%respectively in the culture
time of 3,5,7and 9days.There was extremely remarkable diference among 3,5and 7days;the higher concentrations of
sucrose,agar,and potato had inhibition to the formation of vitrification;formation of vitrification was promoted by 6-BA,
and the higher concentrations,the higher rate of vitrification.Besides the culture time in weak light,the efect of other
factors on the rate of browning was little in al the culture stage.
Keywords:Chinese cabbage;anther culture;vitrification;browning
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·生物技术· 北方园艺2016(08):89~92
健壮的金山绣线菊植株上带饱满腋芽的茎段,将其放入
烧杯中加入洗洁精在流水下冲洗30~45min后,在无菌
操作台中进行外植体表面灭菌。将外植体放到75%乙
醇中灭菌20~30s,无菌水冲洗2次;将外植体放到加有
2滴吐温的升汞溶液中灭菌5~7min,无菌水冲洗2~
3次;再将外植体放到2%NaClO溶液中消毒30~40s,
再用无菌水冲洗3次;将外植体用无菌滤纸吸干表面水
分,将叶片切割成0.5cm×0.5cm带有主脉的方块,茎
段和叶柄切成1.0~1.5cm长,准备接种。
1.2.2 愈伤组织途径 愈伤组织的诱导采用在预试验
中对愈伤组织诱导效果最好的培养基:MS+1.0mg/L
6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2,4-D,将灭过菌切
割完成的外植体接种到上述培养基中,每种外植体接种
15瓶,每瓶3株,每处理重复3次;10d后观察并记录各
外植体愈伤组织的萌发量及比例;3周后对比筛选出最
适宜的诱导愈伤组织外植体。不定芽分化和增殖培养
在无菌条件下,将金山绣线菊愈伤组织接种到愈伤组织
增殖培养基中:MS+1.0mg/L 6-BA+0.03mg/L
NAA,7d后将增殖的愈伤组织接种到含有不同浓度
TDZ和NAA的诱导分化不定芽的培养基中;附加TDZ
浓度分别为0.8、1.0、1.2mg/L,NAA浓度为0.05、
0.10、0.15mg/L,配成9组培养基配方,2周后观察记录
并统计不定芽诱导率,筛选出最佳诱导分化不定芽培养
基激素配方。生根培养为将长到3cm左右的芽接种到
添加有不同浓度6-BA和NAA的1/2MS培养基上诱导
生根,分别添加6-BA浓度为0、0.25、0.50mg/L和NAA
浓度设置为0.5、1.0、2.0mg/L,观察不同激素浓度对幼
芽生根的影响,2周后记录各培养基配方生根数量及比
例,选出最佳生根培养基。
1.2.3 腋芽途径 将灭过菌的茎段切割成长1.0~
1.5cm含有饱满腋芽的茎段,分别接种到添加激素浓
度6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L和NAA 0.1、0.2、0.3mg/L
的9组培养基中,每处理接种15瓶,每瓶3个茎段。每
处理重复3次。7d后统计萌芽展叶量,15d后统计生
长量。对比筛选出腋芽萌动的最适浓度。诱导生根培
养与愈伤组织途径诱导生根相同。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织途径的优化
从表1可知,在附加1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L
NAA+2.0mg/L 2,4-D的MS培养基中,不同外植体都
表现出较高的诱导率,而茎尖在8d左右出现浅白黄色
致密的愈伤组织,并且分化出芽,可见茎尖的诱导效果
最佳,可达到90%,明显高于茎段、叶柄和叶片。试验
的9个不同配方对不定芽分化的影响情况如表2所
示,添加0.8mg/L TDZ+0.10mg/L NAA和添加
1.0mg/L TDZ+0.10mg/L NAA的培养基的诱导率都
很高,但是添加1.0mg/L TDZ+0.10mg/L NAA的培
养基中诱导出的芽有明显的玻璃化现象,综合考虑诱导
率及芽的生长情况,最佳诱导分化不定芽培养基为MS+
0.8mg/L TDZ+0.10mg/L NAA。表3表明,9组不同
激素配比的培养基中,附加0.25mg/L 6-BA+1.0mg/L
NAA和0.25mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA的培养基中
生根率较高,而附加0.25mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA
培养基中生根数量和根长明显好于后者,因此最佳诱导
生根培养基为MS+0.25mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。
表1 不同部位外植体对愈伤
组织诱导的影响
  Table 1 Efect of diferent parts of explants on calus induction
外植体
Explant
愈伤组织诱导率
Calus inducing rate
/%
产生愈伤组织的时间
The time of producing the calus
/d
茎尖 90  8
茎段 78  10
叶柄 72  13
叶片 68  14
  表2 不同激素浓度对不定芽分化的影响
  Table 2 Efect of diferent hormone concentrations on
the diferentiation of adventitious bud
处理Treatment
TDZ
/(mg·L-1)
NAA
/(mg·L-1)
增殖个数
Mulipulation
number
增殖倍数
Mulipulation
multiple
0.8  0.05  29.5  2.95
0.8  0.10  53.2  5.32
0.8  0.15  34.7  3.47
1.0  0.05  40.8  4.08
1.0  0.10  56.3  5.63
1.0  0.15  43.4  4.34
1.2  0.05  38.9  3.89
1.2  0.10  27.6  2.76
1.2  0.15  23.2  2.32
  表3 不同激素浓度对幼苗生根的影响
  Table 3 Efect of diferent hormone concentrations on
rooting of seedlings
处理Treatment
6-BA
/(mg·L-1)
NAA
/(mg·L-1)
生根率
Rooting rate
/%
根长
Root length
/cm
0  0.5  69.31  1.48
0  1.0  72.54  1.62
0  2.0  75.08  1.75
0.25  0.5  72.35  2.08
0.25  1.0  90.87  2.64
0.25  2.0  84.56  2.31
0.50  0.5  68.79  1.62
0.50  1.0  71.36  1.73
0.50  2.0  73.67  1.90
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北方园艺2016(08):89~92 ·生物技术·
2.2 腋芽途径的优化
由表4可以看出,不同激素浓度对芽的增殖影响很
大,当6-BA和NAA浓度比值为10时,增殖倍数较高。
而且低浓度的6-BA可以促进芽的分化,而当提高浓度
时,增加产生丛生芽的比例也会抑制节间生长,有效抑
制苗徒长。MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA和
MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基中的萌芽
情况显著好于其它培养基,而后者的萌芽展叶情况和萌
芽伸长量都更好一些,所以选择MS+2.0mg/L 6-BA+
0.2mg/L NAA的培养基进行增殖培养。生根培养与
愈伤组织诱导途径的生根培养结果相同。
  表4 不同激素浓度对腋芽萌发的影响
  Table 4  Efect of diferent hormone concentration on axilary bud germination
处理Treatment
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1)
7d萌芽展叶情况
Condition of the bud after 7days
15d萌芽伸长量
Growth quantity of the bud after 15days
0.5  0.1  4株展2叶,1株展1叶 1.67
0.5  0.2  2株展2叶 1.58
0.5  0.3  2株展2叶,1株展1叶 1.62
1.0  0.1  1株展3叶,8株展2叶,2株展1叶 2.08
1.0  0.2  4株展2叶 1.73
1.0  0.3  5株展2叶,1株展1叶 1.71
2.0  0.1  3株展1叶 1.42
2.0  0.2  2株展3叶,10株展2叶,3株展1叶 2.31
2.0  0.3  3株展2叶,3株展1叶 1.56
  注:1.腋芽萌发;2.愈伤组织形成;3.不定芽再生;4.不定芽增殖;5.腋芽增殖;6.生根培养。
Note:1.Axilary bud germination;2.Calus formation;3.Adventitious bud regeneration;4.Adventitious buds proliferation;5.Axilary bud proliferation;
6.Rooting culture.
图1 金山绣线菊组织培养不同时期形态
Fig.1 Form of Spiraea×bumalda‘Golden Mound’in diferent tissue culture phase
3 讨论与结论
采样时间应选择在初春4、5月份,此时金山绣线菊
结束了休眠期开始萌动,长出鲜嫩的枝梢,温室中的植
株在这段时间长势也相对较好,更有利于无性繁殖,而
夏季细菌滋生速度快,组培苗的污染率也相对较高,而
冬季属于休眠期,分生效果最差,因此取材时间选在初
春,这与JACOBSSON等[15]的试验结果相一致。
由于试验材料本身特点,腋芽被芽鳞包裹,而芽鳞
上有致密的绒毛,将会影响表面灭菌的效果,因此在次
氯酸钠溶液中加入2滴吐温,吐温是一种表面活性剂和
分散剂,有助于将叶片和有芽鳞包裹的腋芽张开充分灭
菌。同时,在接种时将不同外植体分别接种,防止交叉
感染细菌和霉菌[16-17]。
在愈伤组织途径中,诱导愈伤时很容易出现褐化现
象,叶片容易皱缩,组培苗长势弱,很难进行下一步的继
代操作。针对这个问题可以通过采用最佳培养基、添加
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防褐剂、黑暗培养、调低温度、尽量缩短继代周期等方法
来尽量减轻和避免。
“玻璃化”是指植物在进行组织培养过程中,常会出
现试管苗叶或嫩梢呈现透明或半透明状态,植株矮小肿
胀生长缓慢,叶片皱缩失绿且易碎的现象。植物在出现
玻璃化现象后,很难继续扩繁和增殖培养,移栽也会难
以成活,这会严重降低组培的效率。因此总结出应对措
施有:在培养过程中,培养室的光照强度要保证在
1 600lx以上[18];降低培养基中外源激素的浓度尤其是
6-BA浓度,并且降低培养基中的水势可以有效减少玻璃
化苗的出现[19];采用适宜的温度,换用通透性良好的封
口膜增加透气性都有助于降低玻璃化苗出现的概率[20]。
组培苗在继代培养过程中,随着增殖系数的提高,
长出的芽往往会出现生长势减弱、纤细弱小、很难生根
和移栽成功。这个问题同样也影响着木本植物的组织
培养,该试验中通过选择适宜的细胞分裂素和生长素的
种类及不同浓度配比,可以同时满足增殖和壮苗的不同
要求。高浓度的生长素和低浓度的细胞分裂素的组合
有利于形成壮苗。因此,在以丛生芽方式进行增殖时,
适当降低培养基中6-BA等细胞分裂素的浓度,并增加
NAA等生长素的浓度,并且提高C/N比值等方式来达
到壮苗培养的目的。
该试验初步建立了金山绣线菊再生体系,4种不同
的外植体中,茎尖的诱导率最高,明显好于茎段、叶柄
和叶片,诱导愈伤组织最佳培养基为 MS+1.0mg/L
6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2,4-D;愈伤组
织诱导不定芽最佳培养基为 MS+0.8mg/L TDZ+
0.10mg/L NAA;最佳生根培养基为1/2MS+0.25mg/L
6-BA+1.0mg/L NAA;最佳诱导腋芽增殖培养基为
MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA。
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Study on the Establishment of Regeneration System of Spiraea×bumalda
WANG Daqing,ZHANG Jiao
(Economic Research Institute of Heilongjiang Province Agricultural Reclamation,Harbin,Heilongjiang 150030)
Abstract:The stem apex,stem,leaves and petiole of Spiraea×bumalda‘Golden Mound’were taken as explants for
tissue culture in vitro.Diferent species and concentrations of hormones were added to MS medium during the diferent
periods of first,subculture and rooting culture for establishing of regeneration system suitable for tissue culture of
Spiraea×bumalda‘Golden Mound’.The results showed that,medium for calus induction was MS+1.0mg/L 6-BA+
0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2,4-D,medium for adventitious bud induction was MS+0.8mg/L TDZ+0.10mg/L
NAA,medium for rooting was 1/2MS+0.25mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,medium for axilary bud proliferation was
MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA.
Keywords:Spiraea×bumalda‘Golden Mound’;tissue culture;regeneration system;optimization
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