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蜻蜓凤梨FLD同源基因的克隆及表达分析



全 文 :分子植物育种,2013年,第11卷,第3期,第371-378页
MolecularPlantBreeding,2013,Vol.11,No.3,371-378
研究报告
ResearchReport
蜻蜓凤梨 FLD同源基因的克隆及表达分析
罗轩 1,2丛汉卿 1,2李丽 2* 李新国 1*
1海南大学园艺园林学院,热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海口,570228;2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究
所,农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室,儋州,571737
*通讯作者,chenli907@163.com;lixinguo13@163.com
摘 要 FLOWERING LOCUS D (FLD)是植物自主开花途径花发育基因,在植物营养生长向生殖生长转变的
过程中起重要的调控作用。本研究利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)
花发育基因 FLD的类似基因 AfFLD。序列分析比对表明,AfFLD所推测的氨基酸序列包含有LSD1-LIKE亚
家族两个高度保守的结构域:SWIRM结构域和胺氧化酶结构域,该蛋白与玉米、拟南芥的FLD蛋白的同源
性分别为72%和73%。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了乙烯处理不同时间 FLD基因的表达模
式,结果表明乙烯处理不同时间的各组中,处理后1d时 FLD的表达量达到最高值,其中表达量最高为0h
的2.5倍。本结果为开花自主途径中相关基因对乙烯处理后的响应机理的研究提供理论基础。
关键词 蜻蜓凤梨,乙烯处理,FLD,自主途径
CloningandExpressionAnalysisofFLDHomologou GenefromAechmea
fasciata
LuoXuan1,2CongHanqing1,2LiLi2* LiXinguo1*
1 KeyLaboratoryofProtectionand Development Utilization ofTropical Crop Germplasm Resources,MinistryofEducation,CollegeofHorticullture
and Landscape Architecture, Haikou, 570228; 2 Key Laboratory for Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Agriculture,
TropicalCropsGeneticResourceInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculture,Danzhou,571737
*Correspondingauthors,chenli907@163.com;lixinguo13@163.com
DOI:10.3969/mpb.011.000371
Abstract FLOWERING LOCUS D (FLD)-likegenesinvolvedintheautonomouspathwayplaysanimportantrole
intheregulatingthefloratransitioninplant.TheFLD-likegenenamedAfFLDwasclonedfromAechmea fasciata
byRT-PCRandrapidamplificationofcDNAends(RACE).Byusingalignmentanalysis,thededucedaminoacid
sequence contained two domains: SWIRM domain and amine oxidase domain, both of which were highly
conservedinLSD1-LIKEproteinfamily.ThededucedproteinofAfFLDhad72%and73%identicalt homologs
encodeAtFLD inArabidopsis thaliana andZmFLD inZea mays, respectively. The expression patterns ofAfFLD
geneduringthetreatmentofethylenewereinvestigatedbyquantitativereal-timePCR(qRT-PCR).Resultsshowed
that the expression ofAfFLD reached the highest level on one day after ethylene processing, which the highest
amount of expression 2.5 times than un-treatment (0 h). The results of this study would provide a research
foundationforunderstandingtheregulationmechanismofkeyenzymesoftheautonomousfloweringpathway.
Keywords Aechmea fasciata,Ethylenetreatment,FLD,Au onomousfloweringpathway
收稿日期:2012-12-11 接受日期:2013-03-04 网络出版日期:2013-03-16
URL:http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1175-mp opa
基金项目:本研究由农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金(KFKT-2011-06)资助
植物开花转变是植物个体发育和后代繁衍的中
心环节,受内源信号和外部生长环境的综合调控。
在双子叶模式植物拟南芥中,该转变主要是由光周
期途径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径进行
调控(夏志强等,2007;郑永胜等,2012)。虽然较双子
叶植物而言,单子叶植物在开花转变过程中涉及到
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
图2FLD保守结构域分析
注:A:SWIRM结构域;B:胺基氧化酶结构域
Figure2AnalysistheconserveddomainofFLD
Note:A:SWIRMdomain;B:Amineoxidasedomain
的基因及其调控模式虽有所不同,但是已有研究证
明,光周期途径、春化途径、自主开花途径在单子叶
植物中也有存在,例如小麦,水稻和二穗短柄草等
(Winichayakul et al., 2005; Higgins et al., 2010; Dong
etal.,2012)。
FLD (FLOWERING LOUCUS D)是自主途径中的
一个功能基因,在植物中编码一个与人的组蛋白赖氨
酸去甲基化酶1(lysine-specificdemethylase1,LSD1)
同源的蛋白,参与 FLC (FLOWERING LOCUS C)组蛋
白的去甲基化和去乙酰化修饰(Heetal.,2003;Jiang
et al., 2007; Liu et al., 2007; B覿urle nd Dean, 2008),
通过沉默花发育抑制因子 FLC,促进其下游基因如
SOC1和 FT的表达,从而启动花原基的发育(Michaels
andAmasino,2001;Hepworthetal.,2002;Helliwellet
al.,2006)。尽管双子叶植物如拟南芥的自主开花途径
已基本清楚,但单子叶植物相应途径的调控作用及涉
及到的各基因的序列和功能都是未知的。
凤梨科(Bromeliaceae)植物为单子叶多年生草本
植物。凤梨自然开花一般发生在短日和低夜温的环
境,然而,只要达到其生理成熟阶段,周年都可开花
(刘海涛,2004,广东科技出版社,pp.75-77)。由于凤梨
花期的不确定性给生产种植者们带来了很大的经
济损失,利用乙烯或其衍生物促进开花成为凤梨商
业化种植中最关键的技术之一(信彩云和李志英,
2009)。有报道表明乙烯及其信号途径中的某些基因
可能通过影响植物花发育途径中相关基因的表达而
参与了开花调控(Achard et al., 2007; Wuriyanghan
et al., 2009),在乙烯诱导凤梨开花过程中,自主途径
中相关基因是否做出响应并参与调控和如何调控的
机理目前尚不清楚。
因此,研究凤梨自主开花途径相关基因对进一
步揭示凤梨科植物花发育调控机理及丰富单子叶植
物开花调控理论具有重要意义。本研究对自主途径
的重要基因 FLD进行了克隆和序列分析,同时分析
了蜻蜓凤梨茎尖的 FLD基因在乙烯处理不同时间后
的表达量的变化,为进一步研究 FLD基因及自主途
径中其它相关基因的调控机理奠定基础。
1 结果与分析
1.1 蜻蜓凤梨 FLD 基因的全长的克隆
通过RACE-5和 RACE-3扩增分别得到目的
片段,经过纯化回收并测序,RACE-5长度为843bp,
RACE-3长度为996bp(图1)。将测序结果与原有EST
序列拼接,获得 FLD基因的完整序列。根据所拼接的
序列设计全长引物进行PCR扩增,电泳检测,在预期
范围获得了特异条带(图2)。经测序后与拼接的序列
进行比对,结果完全一致,故最终确定了 FLD 的
cDNA全长序列。
1.2 蜻蜓凤梨 FLD 基因的生物信息学分析
1.2.1阅读框和序列理化性质分析
蜻蜓凤梨 FLD基因序列长度为2878bp,开放
阅读框(openreadingframe,ORF)长度为2181bp,编
图1FLD克隆电泳图
注:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1:RACE-5PCR
扩增;2:RACE-3PCR扩增;3:FLD全长PCR扩增
Figure 1 The results of FLD RACE and full length PCR ampli-
fication
Note: M1: DL2000 marker; M2: DL15000 marker; 1: RACE-5
amplification;2:RACE-3amplification;3:FLDfulllengthPCR
amplification
372
蜻蜓凤梨 FLD同源基因的克隆及表达分析
CloningandExpressionAnalysisofFLDHomologou GenefromAechmea fasciata
6 h、1 d和 2 d,经 3次重复实验之后,用 qRT-PCR
检测了各处理后lh、6h、1d和2d茎尖分生组织中
AfFLD基因的相对表达量的变化。数据用SAS9.0软
件统计单因子方差分析,多重比较用Ducan法进行差
异显著性检验,结果用平均值±标准误(x±SE)表示。
结果表明:(1)去离子水对照组 AfFLD在0h~1d
内表达量无显著变化,而在2d时表达量显著提高,
为0h的1.6倍;(2)乙烯处理1h组在乙烯处理1h后
表达量呈现下降的趋势,在处理1h和6h两个时间
点显著(P<0.05)降低了 AfFLD 基因的相对表达量,
6 h后表达量逐渐提高,到1d后表达量恢复到与0h
相同水平;(3)乙烯处理6h、1d、2d三组变化趋势一
致,与对照组相比在1d时显著(P<0.05)提高了 AfFLD
基因的表达量,而1d后表达量都有所下降,其中乙
烯处理6h组在处理后1d相对表达量为所有处理
组中最大,为0h的2.5倍(图5)。
2 讨论
植物自主开花途径是调控花发育的重要内源途
径,它通过感受植物体内部的发育状态,并与环境信
号相互作用,在一定时期促进开花(He,2012)。在拟南
芥中已经相继克隆到七个与自主途径相关的基因
FCA、FY、FLD、FPA、FVE、LD 和 FLK,它们通过自身
的染色质修饰或RNA修饰功能,组成不同的调控亚
途径(subpathway),协同作用于花发育抑制因子 FLC
来控制花发育的起始,对植物花发育起重要的调控
作用(SherrieandRichard,1996;Marquardtetal.,2006;
Jiang et al., 2008)。Liu等发现自主途径中 FCA 和
FPA 在很大程度上是通过 FLD 而行使调控 FLC 表
达的功能的(Liuetal.,2007;B覿urleandDean,2008),
而且 LD基因也更多地起着冗余的辅助 FLD调控基
因表达的作用(VeleyandMichaels,2008)。除了参与
调控花发育过程,自主途径中的这些基因可能还行
使着不依赖 FLC的调控植物其它生长发育的功能。
拟南芥自主途径基因双突变体的研究表明,相对野
生型而言,双突变株(fpa fld)不仅开花时间明显推迟,
植株的生长速率、叶绿素含量和育性也表现显著降
低的趋势(VeleyandMichaels,2008)。可见,FLD在植
物生长发育尤其花发育调控中起着重要的作用。
乙烯在植物生长发育过程中以及在应对多种环
境胁迫的防御反应中起着重要的调控作用,其发挥
作用的分子机制在以拟南芥为主的双子叶植物中得
到了系统研究,与此相比,人们对单子叶植物中乙烯
作用机制,尤其是在参与调控植物花发育方面的相
码 727个氨基酸。用 Protparam预测其分子量为
78.734kD,等电点(PI)为6.40,带正电荷的氨基酸68个
(Arg+Lys),带负电荷的氨基酸73个(Asp+Glu),蛋白
不稳定系数为44.54,是不稳定蛋白。通过SignaIP4.0
进行预测,未发现有信号肽,故预测 FLD蛋白为非分
泌蛋白。TMHMM跨膜区预测分析表明该蛋白无跨
膜区,非膜蛋白。利用predictprotein预测 FLD蛋白的
二级结构:α-螺旋(Alphahelix)占21.3%,延伸链(Ex-
tendedstrand)占12.4%,环状结构(loops)占66.3%。
1.2.2保守区域分析
通过ConservedDomains分析 FLD蛋白。在N
端,含有一个SWIRM保守结构域参与蛋白质互作
(图2),该结构域存在于染色体蛋白中,并由85个氨
基酸残基组成一个 α-螺旋。在C端,含有一个胺基
氧化酶的结构域(AminoOxidase)(图2),该结构域同
时含有 FADBinding结构域和底物结合结构域,两
者共同构成胺氧化反应的中心。
1.2.3同源性比较及基因家族系统进化树分析
DNAMAN分析表明,FLDcDNA推导的氨基酸
序列与玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)
的 FLD蛋白有较高一致性,分别为72%和73%(图3)。
通过BLAST比对发现 FLD、LDL1、LDL2、LDL3蛋白
它们含有相同的保守结构域,属于 LSD1蛋白亚家族
中一员,即 FLD与 LDL1、LDL2、LDL3是同源基因。
为了研究蜻蜓凤梨中 FLD基因的进化关系,对
Genbank收录的不同植物来源的 FLD 基因以及其
同源基因序列利用 Clusta X进行多重比对,再用
MEAG5.0中的邻位相连法(Neighbor-joining)构建进
化树(图4)。其中包括蜻蜓凤梨1个家族成员(AfFLD),
大豆(Glycine max) 3个成员(GmLDL1~GmLDL3),蒺
藜苜蓿(Medicago truncatula)1个成员(GmLDL),葡萄
(Vitis vinifera)3个成员 (VvLDL1~VvLDL3),拟南芥
(Arabidopsis thaliana)三个成员(AtLDL1, AtLDL2, At-
FLD),短柄草(Brachypodium distachyon)3个成员(Bd-
LDL1~BdLDL3),玉米(Zea mays) 1个成员(ZmFLD)。
除此之外还有4个与 FLD高同源性(70%以上)的未
确定功能基因,分别为:水稻(Oryza sativa Japonica
Group Os04g0560300,OsJG)、大麦(Hordeum vulgare
hypotheticalprotein,HvHP)、高粱(Sorghum bicolorhy-
potheticalprotein,SbHP)、三角叶杨(Populus trich ocar-
pahypotheticalprotein,PtHP)。
1.3 乙烯诱导 FLD 基因表达 RealtimePCR 检测
分别对蜻蜓凤梨进行乙烯利灌心处理 0、1 h、
373
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
关研究却少有报道。乙烯在不同物种花发育调控过
程中行使的功能有很大差异。研究表明乙烯能激活
赤霉素途径基因 DELLAs的活性,DELLA蛋白积
累后抑制了花分生组织决定基因 LFY和 SOC1表达
而使拟南芥开花推迟(Achardetal.,2007)。在水稻中,
乙烯受体OsETR2可能通过激活光周期途径中 OsGI
和 RCN1的表达延迟其花芽分化,乙烯与其受体结
合后能使受体活性钝化并启动开花(Wuriyanghan et
al., 2009)。
本研究利用蜻蜓凤梨茎尖转录组测序获得的
图3蜻蜓凤梨,拟南芥,玉米 FLD氨基酸序列比对
注:框A:SWIRM保守结构域;框B:AminoOxidase保守结构域
Figure3ThealignmentofaminoacidsequenceofA FLD,AtFLDandZmFLD
Note:ColumA:SWIRMconserveddomin;ColumB:AminoOxidaseconserveddomin
374
图5乙烯处理后不同时间 FLD基因表达量变化
注:不同字母表示同组不同采样时间相对表达量Ducan法多重比较差异显著(p<0.05)
Figure5TherelativeexpressionchangesofFLDgen treatedwithethyleneatdifferenttime
Note: Different letters indicate significant difference (p<0.05) in different sampling time of the relative expression by Ducan multi
comparativeanalysis
图4蜻蜓凤梨 FLD基因与已知 FLD基因及其基因家族的系统进化树
Figure4The phylogenetic tree based on alignmentofnucleotide amongAechmea fasciata FLD gene and some publishedFLD gene
andtheirgenefamily
FLD同源基因片段设计引物,通过RACE技术首次
从凤梨科植物中克隆了自主开花途径相关基因
FLD,并从生物信息学角度对该基因特性方面进行了
介绍。蛋白序列分析表明,克隆的 AfFLD编码的氨基
酸与拟南芥或单子叶植物玉米中相应蛋白均具有较
高的同源性,证明了所克隆的 FLD基因的准确性。
蜻蜓凤梨 FLD同源基因的克隆及表达分析
CloningandExpressionAnalysisofFLDHomologou GenefromAechmea fasciata 375
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
AfFLD蛋白含有LSD1-LIKE亚家族两个高度保守
的结构域:SWIRM(Swi3p/Rsc8p/Moira)结构域和胺
氧化酶(amineoxidaselike,AOL)结构域。其中,SWI-
RM结构域是蛋白—蛋白相互作用基序;胺氧化酶结
构域又分为FAD结合结构域和底物结合结构域,两
者共同构成催化活性中心(AravindandIyer,2002;Shi
et al., 2004)。基于LSD1-LIKE核苷酸序列构建的
进化树分析表明,LSD1在植物中的同源基因 FLD与
LDL3聚为一类,LDL1和 LDL2各自聚为一类,各类
群中单子叶植物和双子叶植物又被分为不同的两类。
凤梨与禾本科的水稻、玉米、二穗短柄草、高粱和大
麦的同源性较高,但又与禾本科明显分为2类,结果
表明其变异与物种的演化关系是一致的。通过对蜻
蜓凤梨茎尖分生组织的 AfFLD 基因在乙烯处理不
同时间的表达模式进行分析,表明凤梨 AfFLD基因
对乙烯处理做出了响应,表达量发生了变化,其中表
达量最高为0h的2.5倍。
通过对蜻蜓凤梨自主开花途径重要基因 AfFLD
的研究,有助于进一步理解 FLD类似基因在植物开
花乃至其他生长发育途径中的作用,为阐明凤梨成
花的分子机制和乙烯诱导凤梨开花的调控过程提供
理论基础。
3材料与方法
3.1材料和主要试剂
实验材料为2年生蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata),
取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究
所实验基地温室。选取无病虫害,株型大小、长势
一致植株。
AxyPrep总 RNA小量制备试剂盒购自于爱思
进生物技术(杭州)有限公司;rTaq酶、DL2000maker、
DL15000marker、pMD18-TVector、PrimeScripeRTTM
ReagentKit、SYBRPremixExTaqTMⅡ购于宝生物生
物工程(大连)有限公司;SMARTTMRACEcDNAAm-
plificationKit购于Clone ech公司、胶回纯化回收试
剂盒购于OMEGA。
3.2材料处理
(1)用 ρ=400 mg/L的乙烯利10 mL灌心处理蜻
蜓凤梨,分别处理0h、1h、6h、1d和2d后倒净,并
用去离子水冲洗。对应上述处理设计去离子水灌心
处理为对照组,处理组和对照组均设三次重复;(2)
取处理后1h、6 h、1 d和2 d的茎端分生组织,用去
离子水洗净后液氮迅速冷冻,放入-80℃超低温冰
箱中备用。
3.3 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
用 AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取菠萝
茎尖总 RNA。cDNA第一链参照 PrimeScripe RTTM
ReagentKit说明书合成。
3.4 FLD 的克隆与序列分析
根据对蜻蜓凤梨茎尖转录组基因文库中基因片
段的筛选,得到1个与FLD同源的cDNA片段。5-
RACE和3-RACE扩增参照张鲲等(2011)方法。将
上述5-RACE和3-RACE结果进行拼接得到 FLD
基因的理论全长。根据拼接后序列设计其扩增全长
的引物M-F和M-R(表1)。PCR扩增后送于生物公
司测序,得到该基因的cDNA全长。
3.5 FLD 生物信息学分析
利用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行
引物功能
Primerfunction
RACE5克隆
CloningofRACE5
RACE3克隆
CloningofRACE3
FLD全长克隆
CloningofthefulllengthofFLD
荧光定量内参引物
TheprimerofactinofRT-PCR
荧光定量FLD引物
TheprimerofFLDofRT-PCR
引物名称
Primername
P1:FLD-RACE5-out
P2:FLD-RACE5-in
P3:FLD-RACE3-out
P4:FLD-RACE3-in
FLD-S
FLD-AS
Actin-F
Actin-R
FLD-F
FLD-R
引物序列(5-3)
Primersequence(5-3)
TTATTTGCCCCCTCCATTCTC
CCGACCCTCCAAGACGACA
ATCTTAGCAGAAAGTGTCGGAG
AAATAAAAGTGGAAAGAAGCCC
ACACGAGGAGGAGGTGAGAGAA
AGAAAACCGTTATTCATAGCCGA
GAGCAGCATGAAGATCAAGG
CATCTGCTGGAAAGTGCTGA
AGAAGCCCCTCAACGAACAC
TCGGCCAAAAATGACAGAAA
表1基因克隆及实时定量PCR所用引物
Table1Theprimersforgenecloningandreal-timePCRusedinthisresearch
376
序列的查找和同源性比较,利用NCBI的ORF分析
基因的最大阅读框,并结合Blastp结果推测全长基
因编码的氨基酸序列,采用Protparam(http://web.e-
xpasy.org/protparam/)进行编码蛋白的理化性质的分
析;采用 SignaIP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/)进行信号肽分析;使用 TMHMM (http://w-
ww.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区分析;
使用 predictprotein (https://www.predictprotein.org/lo-
gin)进行蛋白质二级结构的预测;利用(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)ConservedD-
omains对 FLD保守区域进行分析;利用DNAMAN
进行基因同源性比较;利用ClustaX和MEAG5.0进
行 FLD系统进化树的构建。
3.6 乙烯诱导不同时间 FLD 基因表达分析
利用Primer5.0引物软件设计 FLD基因定量分
析引物,以 β肌动蛋白为内参基因设计引物,引物序
列见表1。利用Takara公司的SYBRPremixEXTaq TM
(PerfectRealTime)试剂盒进行qRT-PCR。反应体系
参照说明书为10μL,扩增条件为:95℃1min;95℃
5 s,60℃ 30 s,40个循环。通过软件 PikoReal Soft-
ware2.0进行实验数据的分析,试验设3次重复。
作者贡献
罗轩是本研究的实验设计和实验研究的执行
人;丛汉卿参与部分实验设计与执行,罗轩完成试验
结果分析并完成论文初稿的写作;李新国和李丽是
项目的构思者和负责人,指导实验设计,数据分析,
论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由农业部热带作物种质资源利用重点开
放实验室开放基金(KFKT-2011-06)资助。
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