全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 3期，第 567-573页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.3, 567-573
研究报告
Research Report
蜻蜓凤梨 AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化
张学全 1,2 张静 2,3 李志英 2 雷明 2 徐立 2*
1海南大学农学院,海口, 570228; 2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南热带作物基因资源与种质创制重点开放实验
室,儋州, 571737; 3华中农业大学植物科学技术学院,武汉, 430070
*通讯作者, xllizhiying@vip.163.com
摘 要 本研究以蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料，利用 RACE技术克隆到跟生长素输出载体同源的基
因，命名为 AfPIN。序列比对分析表明：AfPIN推测的氨基酸序列含有 PINs的 IM (internalization motif)保守结
构和一个高度保守的生长素输出载体(auxin efflux carrier, AEC)蛋白结构域，与番茄(Solanum lycopersicum)、
豌豆(Pisum sativum)、芥菜(Brassica juncea)、小麦(Triticum aestivum)的 PIN同源性分别为 67%、67%、60%和
67%。本研究构建了 CaMV-35S-GUS-AfPIN表达载体，利用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，通过 GUS染色和
PCR检测，结果表明表达载体构建成功并成功转入拟南芥中。本研究已从蜻蜓凤梨中成功的克隆出 AfPIN、
构建了 CaMV-35S-GUS-AfPIN表达载体并转化到拟南芥中，为研究 AfPIN的基因功能和乙烯诱导凤梨科植
物开花机理奠定基础。
关键词 蜻蜓凤梨, AfPIN克隆,表达载体,拟南芥转化
Constructing of Plant Expression Vector and Genetic Transformation of
AfPIN from Aechmea fasciata
Zhang Xuequan 1,2 Zhang Jing 2,3 Li Zhiying 2 Lei Ming 2 Xu Li 2*
1 College of Agriculture Hainan University, Haikou, 570228; 2 Institute of Tropical Crop Genetic Research, Chinese Academy of Tropical Agricul-
tural Sciences, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Genetic Research and Germplasm Enhancement in Southern China,
Danzhou, 571737; 3 College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070
* Corresponding author, xllizhiying@vip.163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.000567
Abstract Aechmea fasciata as experiment materials, the auxin efflux carrier-like gene PIN was cloned from it
by RACE and was named as AfPIN. By using alignment analysis, the deduced amino acid sequence contained an
IM (Internalization motif) domain and an auxin efflux carrier domain which were highly conserved in PINs. The
deduced protein of AfPIN had 67%, 67%, 60% and 67% sequences identity with PIN in Solanum lycopersicum,
Pisum sativum, Brassica juncea and Triticum aestivum, respectively. The expression vector CaMV-35S-GUS-AfPIN
was constructed and transferred it in Arabidopsis by Agrobacterium mediated method. Through GUS assay and
PCR test show that the CaMV-35S-GUS-AfPIN expression vector was successful constructed and it had been
successfully transferred in Arabidopsis. The experiment results may lay foundation of the study on gene function of
AfPIN and role of ethylene induced Bromeliaceae plants flowering.
Keywords Aechmea fasciata, AfPIN cloning, Expression vector, Arabidopsis transformation
收稿日期：2014-12-30 接受日期：2015-02-10 网络出版日期：2015-03-10
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2852
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央级基本科研业务费(1630032014018)共同资助
蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)别名斑粉菠萝，原产
于巴西，为凤梨科萼凤梨属植物。凤梨科植物可自然
开花，也可诱导开花。自然开花一般要求植株达到生
理成熟期且在短日、低温环境下才能发生。在激素诱
导凤梨科植物开花中，乙烯利诱导凤梨科植物开花
效果较好(梁东成和黄万和, 2005)。在栽培过程中，为
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1提取蜻蜓凤梨总 RNA的电泳
注: M: DL2000 marker; 1: 根的总 RNA; 2:茎尖的总 RNA; 3:
心叶的总 RNA
Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from
Aechmea fasciata
Note: M: DL2000 marker; 1: The total RNA of roots; 2: The total
RNA of stem apicals; 3: The total RNA of centre leaves
图 2 AfPIN的克隆及 AfPIN编码区序列全长电泳
注: M: DL2000 marker; A: 3RACE; B: 5RACE; C: AfPIN编码
区序列全长
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of AfPIN cloning and full
length of AfPIN encoding sequences
Note: M: DL2000 marker; A: 3RACE; B: 5RACE; C: Full
length of AfPIN encoding sequences
满足市场需求，提高其经济价值和观赏价值，利用外
源乙烯及其类似物进行凤梨科植物催花已经成为一
项关键的农业生物技术(信彩云和李志英, 2009)，但
乙烯诱导凤梨科植物开花的分子机理尚不清楚。
生长素主要包括内输载体 AUX/LAX 家族、外
输载体 PIN蛋白家族和 ABCB/PGP蛋白家族，它们
在植物的营养生长和生殖生长过程中扮演着多重角
色，尤其是对植物的顶端优势、花序和叶序的发育、
主根和侧根以及不定根的发生、向性生长、维管组织
分化等起着重要的作用 (邹纯雪和门淑珍, 2013)。生
长素在植物中分布的差异是通过生长素运输蛋白调
节生长素的极性运输导致的(Balzan et al., 2014)，而
生长素的极性运输与花的形成和发育有关(Miyamo-
to et al., 1999)。在植物营养生长向生殖生长转变时，
一些生长素输出载体定位到植物的茎尖分生组织和
花序分生组织(Forestan et al., 2012)，单独使用生长素
影响花芽的分化(Peeters et al., 1991)，表明生长素的
输出载体与植物的开花有关。生长素极性运输也和
乙烯相关基因的表达有关(Kuhn et al., 2014)。从凤梨
中克隆到乙烯合成过程中的关键酶 ACACS2，将其转
入凤梨植物中使其沉默，外源乙烯诱导时其开花延
迟(Trusov and Botella, 2006)，表明内源乙烯诱导凤梨
科植物开花。生长素处理凤梨研究表明生长素能促
使内源乙烯的产生，从而间接地诱导了凤梨科植物
开花(Burg and Burg, 1966)，但对于外源乙烯诱导凤
梨科植物开花，生长素输出载体 AfPIN 如何响应外
源乙烯或参与调控外源乙烯诱导凤梨科植物开花
尚不清楚。
本研究利用 RACE技术从蜻蜓凤梨中克隆出一
个跟生长素输出载体 PIN同源的基因，将其命名为
AfPIN，并构建 CaMV-35S-GUS-AfPIN表达载体，通
过农杆菌介导法转化拟南芥。GUS和 RNA转录后分
子检测表明重组的过表达载体已成功转入拟南芥并
且能过表达。本研究从蜻蜓凤梨中已成功克隆到
AfPIN并且转入拟南芥中，为进一步验证 AfPIN在模
式植物拟南芥中的功能奠定了基础。
1 结果与分析
1.1蜻蜓凤梨根、茎、叶总 RNA的提取质量
本研究提取蜻蜓凤梨根、茎尖、心叶的总 RNA，
经核酸蛋白分析仪测定其纯度 OD260/280 的比值为
1.9~2.0，浓度为 350~800 ng/μL。通过 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测(图 1)，各组织的总 RNA两条带清晰，条
带完整，符合后续试验的要求。
1.2 蜻蜓凤梨 AfPIN 基因的克隆及编码区序列全长
的获得
本研究通过对蜻蜓凤梨转录组数据的分析得到
一个 AfPIN的片段，据此设计引物，利用 RACE技术
分别获得 AfPIN的 3端序列 1 323 bp (图 2A)和 5端
序列 560 bp (图 2B)，经拼接得到 AfPIN的 RACE理
论全长，根据生物信息学分析获得完整的开放阅读
框，然后设计含有表达载体酶切位点的引物进行
PCR扩增，并经过电泳检测得到预期的条带(图 2C)。
测序结果跟 RACE结果比对完全一致，证明已获得
AfPIN的编码区序列全长。
1.3蜻蜓凤梨 AfPIN的生物信息学分析
1.3.1阅读框、序列理化性质及保守区预测分析
蜻蜓凤梨AfPIN基因RACE理论全长为 1797bp，
568
图 3 AfPIN同源性多序列比对分析
注:框内为 Auxin Efflux Carrier (AEC)保守结构域; IM: NPXXY保守结构; Sl:番茄, NP001234220.1; Ps:豌豆, AAO38045.1; Bj:
芥菜, CAC67457.1; Ta:小麦, AAS19858.1; Af:蜻蜓凤梨
Figure 3 Alignment analysis of AfPIN homologous sequence
Note: ColumAuxin Efflux Carrier (AEC) conserved domain; IM: NPXXY conserved domain; Sl: Solanum lycopersicum, NP001234220.1;
Ps: Pisum sativum, AAO38045.1; Bj: Brassica juncea, CAC67457.1; Ta: Triticum aestivum, AAS19858.1; Af: Aechmea fasciata
其中开放阅读框 (open reading frame, ORF)编码区
序列为 990 bp，推测编码 329个氨基酸(图 3)。通过
ProtParam软件预测其分子质量为 34.5 kD，等电点
(pI)为 8.54，带负电荷的氨基酸为 24 (Asp+Glu)，带正
电荷的氨基酸为 26 (Arg+Lys)，蛋白不稳定指数为
39.08，是一类典型的稳定蛋白；通过 SignalP 4.1
Server软件对信号肽有无进行预测，未发现有信号肽
的存在，故推测其为一类非分泌蛋白；利用 NCBI的
蜻蜓凤梨 AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化
Constructing of Plant Expression Vector and Genetic Transformation of AfPIN from Aechmea fasciata 569
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4 AfPIN推测的蛋白跨膜区预测(A)和疏水性分析(B)
Figure 4 Predict of transmembrane segments (A) and the hydro-
phobic cluster analysis (B) for deduced AfPIN protein
图 5 PMD19T-AfPIN克隆载体及 CAMV-35S-GUS-AfPIN过表
达载体酶切电泳
注: M1: DL15000 marker; M2: DL2000 marker; 1,2: CAMV-35-
S-GUS-AfPIN XbalⅠ+KpnⅠ双酶切; 3,4: PMD19T-AfPIN Xbal
Ⅰ和 KpnⅠ双酶切
Figure 5 Agarose gel electrophoresis of the PMD19T-AfPIN
clone vector and the CAMV-35S-GUS-AfPIN expression vector
double enzyme digestion
Note: M1: DL15000 marker; M2: DL2000 marker; 1,2: CAMV-
35S-GUS-AfPIN XbalⅠ+KpnⅠ double enzyme digestion; 3,4:
PMD19T-AfPIN by XbalⅠand KpnⅠ double enzyme digestion
Conserved domains对其进行分析，发现在 C端有一个
AEC (the Auxin Efflux Carrier Family)蛋白结构域。
1.3.2同源性比对及基因结构分析
通过 DNAMAN比对分析结果显示，AfPIN推测
的蛋白序列跟 GENBANK上注册登记的番茄(Solan-
um lycopersicum)、豌豆(Pisum sativum)、芥菜(Brassica
juncea)、小麦(Triticum aestivum)的氨基酸比对具有较
高的同源性，分别为 67%、67%、60%和 67% (图 3)。
AfPIN推测的蛋白序列在羧基端 183~187氨基
酸(amino acids, aa)有一个 PINs的 IM (Internalization
motif)保守结构(图 3)，C端有四个跨膜区(图 4A)分
别是：185~202 aa、214~235 aa、255~276 aa 和 304~
322 aa。在 AfPIN蛋白的 N端有一个亲水区，C端有
一个疏水区(图 4B)。
1.4 蜻蜓凤梨 AfPIN基因表达载体构建
将构建好的 PMD19T-AfPIN克隆载体和植物表
达载体 CaMV-35S-GUS-AfPIN分别提取质粒，再分
别用 XbalⅠ和 KpnⅠ进行双酶切，酶切结果(图 5)所
示有两条带分别是 2 000 bp以上和 990 bp的目的基
因片段，将目的基因条带切割、回收，与相同酶切位
点酶切开的表达载体 CAMV-35S-GUS 进行连接，
转化到 DH5α，挑取单克隆，用 AfPIN-SEN-KpnⅠ和
AfPIN-ANT-XbalⅠ引物(表 1)做 PCR扩增验证，提取
CaMV-35S-GUS-AfPIN 重组质粒，再用 XbalⅠ和
KpnⅠ进行双酶切验证(图 5)，酶切两条带分别为
CAMV-35S-GUS 14 902 bp和目的基因片段 990 bp，
表明 CAMV-35S-GUS重组质粒表达载体构建成功。
1.5 Af PIN转基因植株的分子验证
提取拟南芥植株的总 RNA(图 6)反转录成 cDNA，
利用特异引物为 AfPIN-SEN-KpnⅠ和 AfPIN-ANT-X-
balⅠ (表 1)进行 PCR，对野生型拟南芥(阴性对照)和
转 CAMV-35S-GUS-AfPIN植株进行检测。PCR检测
结果表明，阴性对照没有扩增出目的条带，转基因植
株能扩增出 AfPIN的条带(图 7)，说明 CAMV-35S-G-
US-AfPIN已转入拟南芥中并且已在 RNA中表达。
1.6转基因植株 GUS检测
利用 CAMV-35S-GUS-AfPIN 表达载体上的
GUS报告基因，对野生型拟南芥(对照)和转基因拟南
芥进行 GUS染色，结果显示转基因植株 CAMV-35S-
GUS-AfPIN表达载体上的 GUS报告基因能正常表达
而野生型拟南芥中没有蓝色显示(图 8)，说明 CAMV-
35S-GUS-AfPIN已转入拟南芥中并且能正常表达。
2讨论
生长素在植物的生长发育和形态建成过程中发
挥着重要作用，如分生组织细胞分裂、伸长和分化，胚
胎发育，根茎的向性生长，顶端分生组织过渡到开花
570
图 6拟南芥叶片总 RNA
注: 1~3:对照野生型拟南芥植株; 4~9:转 CAMV-35S-GUS-Af-
PIN拟南芥
Figure 6 Total RNA extracted from Arabidopsis plants
Note: 1~3: Comparision wild type Arabidopsis plants; 4~9: Tran-
sferred CAMV-35S-GUS-AfPIN in Arabidopsis plants
图 7对照和转基因植株的 PCR检测
注: M: DL2000 marker; 1~3:野生型拟南芥植株(对照); 4~9:转
CAMV-35S-GUS-AfPIN拟南芥
Figure 7 PCR test for comparison Arabidopsis plants and trans-
genic Arabidopsis plants
Note: M: DL2000 marker; 1~3: Wild type Arabidopsis plants
(Comparison); 4~9: Transferred CAMV-35S-GUS-AfPIN in Ar-
abidopsis plants
图 8野生型拟南芥(A)和转基因拟南芥(B) GUS检测分析
Figure 8 The verification of wild type Arabidopsis (A) and trans-
genic Arabidopsis (B) by GUS assay and analysis
表 1 AfPIN基因克隆及荧光定量 PCR所用引物
Table 1 The primers for gene cloning and PCR test in this research
引物功能
Primer function
RACE-3克隆
Cloning of 3RACE
RACE-5克隆
Cloning of 5RACE
克隆载体插入片段检测
To detect fragment inserted in a cloning vector
AfPIN编码区克隆
Cloning of the encode sequence
引物名称
Primer name
GSP1-AfPIN-3-out
GSP2-AfPIN-3-in
GSP1-AfPIN-5-out
GSP2-AfPIN-5-in
M13-R
M13-F
AfPIN-SEN-KpnⅠ
AfPIN-ANT-XbalⅠ
引物序列(3-5)
Primer sequence (3-5)
CGTCGTTTAGCAACAGCAG
GCTTCAACACGCCGACTTCT
GTAGAAGTCGGCGTGTTGAA
CTGCTGCTGTTGCTAAACG
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
GGGGTACCCCGACTTCTACACCATGGTCAACG
GCTCTAGAGCCGGAGTCCAACAGCAATAGA
RACE克隆技术首次从蜻蜓凤梨中克隆出跟生长素
运输相关的基因，命名为 AfPIN。PIN是一种典型跨膜
运输蛋白，PIN1和 PIN2在 N端和 C端有两个跨膜
区，中间有一个亲水区(Galweiler et al., 1998)，而 PIN5
缺少了中间的疏水区(Mravec et al., 2009)并且在 C端
都有一个 IM保守结构(刘凤栾等, 2014; Pavel et al.,
2009)。本研究对 AfPIN推导的蛋白进行结构分析表
明，在 C端有一个跨膜区和一个 IM保守结构，N端
有一个亲水区，故推测 AfPIN跟其它 PINs一样都涉
及跨膜运输且有相同的保守结构。通过同源性比对
分析表明，AfPIN编码的氨基酸跟其它 PINs蛋白具
有较高的同源性，并都有一个共同的保守结构域
(AEC)。由此对 AfPIN推导的蛋白结构和同源性分析
表明，AfPIN很可能是凤梨中的 PIN基因。将构建的
CAMV-35S-GUS-AfPIN 重组表达载体转入拟南芥，
通过 GUS染色和分子检测表明，AfPIN已成功转入
拟南芥中并且能正常表达。
在乙烯调控植物开花时，需要生长素的参与共
同起作用(van Doorn and Kamdee, 2014)，并且生长素
间接参与了乙烯诱导凤梨开花(Burg and Burg, 1966)。
本研究为蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata) AfPIN的功能鉴
定和系统研究乙烯诱导凤梨科植物开花分子机理
奠定了基础。
等。在顶端分生组织，生长素运输载体 PIN在叶原基和
花原基表皮层造成生长素含量局部最大值(OConnor et
al., 2014)，表明生长素输出载体 PIN与花芽形成有关。
本研究通过转录组数据的分析得到一个跟 PIN
同源的生长素输出载体基因片段，以此为基础，利用
蜻蜓凤梨 AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化
Constructing of Plant Expression Vector and Genetic Transformation of AfPIN from Aechmea fasciata 571
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3材料与方法
3.1材料与主要试剂
蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)，选择生长健壮，整
齐一致的大株(株龄 18~20片叶, 11-14个月)，剥去
外围叶片，选取根、茎尖、心叶为材料，液氮速冻放入
采样管，-80℃保存。蜻蜓凤梨由中国热带农业科学
院品种资源研究所离体库，农业部华南热带作物基
因资源与种质创制重点开放实验室提供。
克隆载体 PMD-19T和大肠杆菌 DH5α感受态、
T4 连接酶、rTaq、dNTPs、PrimescriptⅡTM RT-PCR Kit
购自 TaKaRa公司；SMARTTMRACE cDNAAmplific-
ation Kit购自 Clontech公司；农杆菌 EH105菌株、拟
南芥种子、植物表达载体 CAMV-35S-GUS由本实验
保存。硫酸卡那霉素(Kanamycin, Kana)，潮霉素(Hygr-
omycin, Hyg)，利福平(Rifampicin, Rif)购自生工生物。
3.2总 RNA的提取及 cDNA的反转录
蜻蜓凤梨总 RNA的提取采用 CTAB大量法(郝
宏刚等, 2012)。5-RACE和 3-RACE第一条链 cDNA
的合成详见 SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit
说明书。普通 PCR第一条链 cDNA的反转录方法详
见 PrimescriptⅡTM RT-PCR Kit说明书。
3.3 AfPIN基因的克隆与序列分析
根据本实验室对蜻蜓凤梨的转录组数据分析得
到一个跟 PIN同源的基因 AfPIN，据此设计 RACE引
物，用于扩增 3-RACE的引物 GSP1-AfPIN-3-out和
GSP2-AfPIN-3-in (表 1)，扩增 5-RACE的引物 GP1-
AfPIN-5-out和 GSP1-AfPIN-5-in (表 1)，AfPIN 的
PCR扩增参照张鲲等(2011)方法。
将 RACE-PCR 扩增的条带切割、回收、连接到
PMD-19T，通过 M13-F和 M13-R通用引物 (表 1)
PCR验证后送 Invitrogen测序公司测序，将测序结果
拼接，利用 ORF寻找编码区序列，据此设计引物
AfPIN-SEN-KpnⅠ和 AfPIN-ANT-XbalⅠ(表 1)普通
PCR 扩增 AfPIN 编码区序列(cDNA sequence, cds)，
将测序结果跟 RACE-PCR 拼接的结果比对，得到
AfPIN cds全长。
3.4 AfPIN的生物信息学分析
利用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/go-
rf.html)上的 ORF finder (Opening reading frame finder)
查找 AfPIN的开放阅读框；利用 DNAMAN推测 Af-
PIN的氨基酸序列，将推测的氨基酸序列通过 NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 的 Blastp 进行同源性
序列比对，下载跟 AfPIN 同源性较高的序列；利用
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp-
sb.cgi)上的 Conserved domains对同源性比对的序列
进行保守结构域的分析；利用 SignalP 4.1 Server软件
进行信号肽的预测；利用 ExPASy服务器中 ProtScale
(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)对
蛋白的疏水性分析；AfPIN 序列的理化性质用 Prot
Param软件(http://www.expasy.org/tool/protparam.html)
分析；用 TMPred进行跨膜区预测。
3.5 CAMV-35S-GUS-AfPIN表达载体构建
CAMV-35S-GUS15μL，XbalⅠ1μL，KpnⅠ1μL，
10×MBuffer 5 μL，补无菌水 50 μL，37℃酶切 8 h，1%
的琼脂糖凝胶电泳检测，割胶，回收；PMD-19T-AfPIN
10 μL，XbalⅠ 1 μL，KpnⅠ 1 μL，10× M Buffer 3 μL，
补无菌水 30 μL，37℃酶切 8 h，1%的琼脂糖凝胶电
泳检测，割胶，回收目的条带。酶切 CAMV-35S-GUS
3 μL，酶切回收的 AfPIN 5 μL，T4连接酶 1 μL，10×
T4 Buffer 1 μL，共 10 μL体系，16℃过夜连接，转化
DH5α，涂板 LB+100 μg/mL kana，挑单克隆，PCR检
测，提取质粒转化 EH105，-80℃保存菌液。
3.6拟南芥的遗传转化
取-80℃保存的含有 CAMV-35S-GUS-AfPIN重
组质粒的农杆菌菌液，按照杨彩云等(2009)方法对拟
南芥进行侵染以及转基因种子的筛选和验证。
3.7 GUS染色液的配制及观察
GUS染色液的配制参照单曙光等(2011)方法。利
用 Nikon数码体式显微镜观察 GUS染色情况。
作者贡献
张学全是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成实验结果分析和论文写作；张静和雷明参与
本研究的实验设计，实验结果分析；李志英参与论文
的修改；徐立是项目的构思者及负责人，指导实验设
计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并
同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央
级基本科研业务费(1630032014018)共同资助。感谢
中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、农
业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室
572
蜻蜓凤梨 AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化
Constructing of Plant Expression Vector and Genetic Transformation of AfPIN from Aechmea fasciata
提供各项实验条件。
参考文献
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