全 文 ：收稿日期:2004-01-18初稿;2004-06-17二改稿。
　＊上海市科技兴农项目“落羽杉的快速繁殖技术和苗木生产(2001)第 1-5号” 。
作者简介:周　音 ,女 , 1962年 4月出生 ,硕士 ,副研究员 ,目前研究方向:林木生物技术。
＊＊通讯作者。
　上海农业学报　2004 , 20(3):11 ～ 14
　Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:1000-3924(2004)03-11-04
东 方 杉 不 定 芽 的 高 频 率 分 化 研 究＊
周　音1)　张智奇1)　刘金鹏1)　顾佳清1)　张建军1)＊＊
沈烈英2)　竺唯杰2)　潘士华2)　叶增基2)　王　军3)　唐雪元3)　沈根华3)
(1)上海市农业科学院林木果树研究所 ,上海 201106;
2)上海市林业站 ,上海 200072;　3)上海市松江区林业站 ,上海 201600)
摘　要　以 30 年生东方杉的当年生顶芽 、侧芽和茎段作为外植体 , 采用组织培养方法对不定芽的分化 、增
殖及伸长进行了研究。结果表明:该项东方杉组织培养的最佳基本培养基为改良 MS 培养基。在改良 MS 培养
基中加入了 BA 10mg L可高频率诱导其不定芽的分化;增殖系数达 6.52。 芽伸长培养基为附加恶霉灵(hy-
mexzal ,HMI)50mg L 的改良 MS 培养基。
关键词　东方杉;组织培养;不定芽诱导;快速繁殖
中图分类号:S791;S791.31;S791.34;Q813.1+3　　　　文献标识码:A
落羽杉属树种原产于北美洲东部及墨西哥 ,有墨西哥落羽杉(Taxodium mucronatum)、落羽杉(T .
dist ichum var.imbricarium)和池杉(T .distichum)三个种 ,均于上个世纪初引种至我国[ 1] 。目前 ,落羽
杉和池杉已成为我国平原地区的主栽树种。早年引进的墨西哥落羽杉 ,现仅存一株在东南大学(原南京工
学院)校园内。1963年 ,我国著名林木育种专家叶培忠教授用柳杉花粉对南京工学院内的墨西哥落羽杉
进行授粉杂交 ,得到三个球果 ,出苗 12株 , 1967年从中选出 5株 ,用嫩枝扦插繁殖了第一批种苗 ,前后经
过近 40年的努力终于育成了我国特有的东方杉(Taxodium mucronatum ×Cryptomeria fortunei)新树
种[ 2 , 3] 。上海于上世纪 70年代初从南京引进了约 300株该种树 ,分别种植于川沙 、松江等地 ,并进行了观
察 、试种和繁殖 。现在川沙林场保存着一片东方杉种质资源林 ,约 2000株 。经专家考证认为 ,这可能是世
界上现存的最大东方杉林地[ 4] 。目前该树种在我国已极稀少 。
东方杉生长快 , 30年左右树龄的最大胸径达 62.5cm 。该树种树形优美 ,落叶期极短 ,呈半常绿状态 ,
抗风 、耐湿且耐盐碱 ,是一种在上海极为适生的绿化造林树种 。上海地处长江入海口 ,有大面积的低湿地
和盐碱地迫切需要适宜树种加以绿化改造 ,故东方杉的挖掘利用和开发研究 ,对上海的绿化造林和生态建
设具有重大意义 。东方杉不结籽 ,在林地上也未见次生苗 ,缺乏种源 ,树龄过高 ,繁殖困难是其推广应用的
主要障碍 ,目前虽已通过扦插繁殖获得了一批种苗 ,但繁殖速度仍较慢 ,迫切需要通过探索新途径和新方
法加快该树种的繁殖和利用。目前国内外尚无东方杉组织培养的报道。本项研究拟以东方杉的嫩枝和芽
作外植体 ,探索东方杉组织培养的激素配比和培养条件 ,并对影响其不定芽分化 、增殖和伸长的若干因素
进行研究 。本文报道其结果。
1　材料 与方 法
1.1　材　料　供试材料为取自上海浦东新区川沙林场等处东方杉(约 30年树龄)的当年生顶芽 、侧芽和
茎段 。
1.2　方　法
1.2.1　外植体的取材及预处理　分别在春秋两季的晴天取样 ,保湿 ,尽快带回实验室 ,以防组织失水。取
回的材料先用自来水冲洗数小时 ,再用白猫牌洗洁精进行清洗去污。之后将枝条放在含有 BA 1mg L 的
蒸馏水中 ,对枝条先进行预培养 ,使其抽枝。
1.2.2　外植体的消毒　待预培养的枝条顶芽和腋芽伸长数毫米后 ,切下其顶芽和腋芽及嫩绿的茎段作为
外植体 ,弃去老枝条。外植体用纱布包裹后在自来水中冲洗数小时 ,再放入加有两滴吐温-20(Tween-20)
的次氯酸钠(NaClO)溶液消毒。为确定最佳消毒浓度及所需消毒时间 ,设计试验如下:消毒液浓度为 3%,
5%, 7%, 10%;消毒时间为 10 ,15 ,20 ,30 ,40min;倒去消毒液 ,用无菌蒸馏水冲洗 5 ～ 8次;再用消毒纱布
吸干外植体表面水分 ,供接种用。
1.2.3　基本培养基的选择　选择 MS 、B5 、White 、WS和改良 MS五种培养基为基本培养基 ,附加 3%蔗
糖 ,0.7%琼脂粉 ,pH 调至 6.0。将消过毒的外植体(切除下端被消毒剂杀伤的组织)接种于不加任何激素
的培养基上。培养一个月后观察其在各基本培养基上的生长情况。
1.2.4　芽的诱导与增殖　根据以上试验确定改良 MS 培养基为基本培养基 ,分别添加 BA 0.5 , 1 , 2 , 5 ,
10 ,15mg L;ZT 0.5 ,1 ,2 ,5 ,10 ,15 mg L;2ip 0.5 , 1 , 2 , 5 ,10 , 15 mg L 等生长激素 ,观察不定芽的分化情
况 ,以确定最佳激素种类及浓度。接种 40d后统计芽分化情况 ,计算增殖系数。
1.2.5　芽的伸长　为了促进芽的伸长 ,选用恶霉灵(hymexzal ,简称 HM I)、IBA 和 GA 3 三种生长调节剂
进行试验 ,均设 6个浓度 ,分别为 0.5 ,1 ,5 ,10 , 50 ,100 mg L。一个月后统计芽伸长结果 。
上述试验的光照度均为 1500 ～ 2000 lx 、光照时间为 16h d;温度为(25±1)℃。每月继代一次。
2　结果 与分 析
2.1　外植体的选择　针叶树的组织培养 ,一般选择胚轴 、子叶作为外植体 ,但由于东方杉未见结籽 ,故无
法采用 。因现存树木树龄都过高(30 年以上),所以取当年生枝条作为外植体 。用茎尖进行快繁时 ,一般
要抑制主轴发育 ,促进腋芽大量萌动 ,从而提高增殖系数。根茎处的萌蘖含有幼年型的芽 ,因此比成熟芽
具有更大的增殖潜力 ,选择距离根系近的萌条效果更好[ 5] 。另外 ,久晴后的采样效果比阴雨天好 ,特别是
暴露在强烈阳光下的枝条 ,污染较轻[ 6] 。
2.2　取材时间的确定　外植体的取材时间影响不定芽的再生频率及再生时间 。为确定最佳取材时间 ,我
们分别于春季和秋季进行了取样对比试验 ,结果(表 1)表明 ,在相同处理条件下 ,用改良 MS 培养基附加
BA 10mg L 作增殖培养基 ,无论是芽的再生时间还是增殖率 ,春天取材的效果均好于秋天 。这与 P.K.
Gupta在 Advances in biotechnology of conifers一文中所述一致[ 6] 。Altman等研究表明离体条件下芽休眠
期长短和萌动的时间与自然条件下十分相似[ 7] 。由于季节原因 ,植物组织在秋季将逐步进入休眠期 ,而春
季正是休眠后期即将萌动的时候 ,因此东方杉组培取样以春季更为合适。
表 1　取材时间对芽再生及增殖的影响
Table 1　Effects of sampling time on regeneration and multiplication of buds
取材日期
Sampling time
芽再生时间(d)
Time of bud regeneration
芽平均数 瓶
M ean bud number per f lask
增殖系数＊
Multiplication coeffi cient
春天(Sp ring)
　　　　
4月 10日(Apri l 10) 7～ 8 32.6 6.52
4月 20日(Apri l 20) 7～ 8 32.6 6.52
5月 7日(May 7) 8 32.5 6.50
秋天(Autum n)
　　　　
9月 12日(Sept.12) 20～ 25 18.1 3.61
9月 23日(S ept.23) 20～ 25 18.5 3.70
10月 15日(Oct.15) 30 18.0 3.60
＊增殖系数=增殖芽数 原接种芽数(Multiplication coeffi cient=mult iplicat ion buds inoculated shoots)。
2.3　取材部位的确定　取自植株不同部位的外植体对组织培养的成功与否起重要作用 ,现对顶芽 、侧芽
和茎段的分化能力统计如下(在相同试验条件下 ,改良 MS 培养基附加 BA 10mg L)。
试验结果(表2)表明 ,顶芽和侧芽分化能力与生长势都较强 ,是作为外植体首选材料 ,而茎段分化能
表 2　不同部位外植体的生长情况
Table 2　Growth state of explants from different positions
外植体
Explant
存活外植体平均数 5瓶
Number of surviving
explants 5 flasks
存活率(%)
Survival
rate
生长情况
Grow th state
芽平均数 瓶
Mean bud number
per f lask
增殖系数
Mult iplication
coef ficient
顶芽
Terminal bud
25.0 100 分化多 ,生长快
Differentiat ing more , grow ing quick 32.6 6.52
侧芽
Lateral bud
25.0 100 分化多 ,生长快
Differentiat ing more , grow ing quick 32.6 6.52
茎段
S tem
12.5 50 分化少 ,生长缓慢
Differentiat ing less , grow ing slow 12.5 2.50
12 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　20卷
力与生长势均不及顶芽和侧芽 。
2.4　外植体的消毒　外植体的消毒较难把握 ,枝条及叶柄由于多皱褶 ,不易消毒彻底 ,即使接种数周后仍
会有污染产生。所以在消毒前宜先剪去枝条和叶柄 ,仅留下顶芽 、腋芽和嫩绿的茎段 ,在清水下冲洗 5 ～
6h ,再用次氯酸钠消毒。实验结果表明 ,以 10%次氯酸钠消毒 30min效果为最好 ,外植体基本无污染 ,存
活率也高 。消毒 40min的虽无污染 ,但外植体很难存活。
2.5　基本培养基的确定　为确定最适合外植体生长的培养基 ,对 5种常用培养基进行了试验 ,结果见表
3。在杉类树木的组织培养中 ,常选用无机盐浓度较低的White 和WS 培养基。如日本的 Isikaw a H 用
WS 培养基对日本柳杉的下胚轴和茎段进行培养 ,可明显地提高愈伤组织的分化能力 ,其效果优于无机盐
较高的 MS培养基[ 8] 。Chalupa V用WS 培养基培养欧洲云杉下胚轴和针叶片段 ,得到不定芽 ,并用 1 2
浓度 LS培养基使其发育 ,得到小植株[ 9] 。而对本试验中的东方杉而言 ,却是以无机盐离子浓度较高的改
良 MS培养基为好 。对 MS培养基加以改良后 ,培养效果较为理想 。其它培养基均不如改良的 MS 培养
基。说明不同种的杉树对培养基的要求不同 。
表 3　外植体在不同培养基上的生长情况
Table 3　Growth state of explants in different mediums
培养基(Medium) 生长状况(State of growth)
MS 生长缓慢 ,植株黄(Growing slow , plants being yellow)
改良(Modif ied)MS 生长快 ,植株浓绿(Growing quick , plants being st rong green)
B5 生长缓慢 ,植株变黄(Growing slow , plants yellow ing)
White 生长不良 ,植株变黄(Being undergrow n , plants yellowing)
WS 生长中等 ,植株较黄(Growing moderate , plan ts being rather yellow)
2.6　细胞激动素对芽增殖的影响　为找出适宜东方杉芽分化的细胞激动素种类和浓度 ,进行了以 BA 、
ZT 和 2ip三种激素 6个浓度的芽分化试验 ,结果(表 4)表明 ,BA对东方杉芽的分化有明显作用 ,而 ZT 和
2ip几乎无作用 。40d后统计芽增殖系数 , BA不同浓度对东方杉芽的增殖影响结果列于表4。统计分析表
明 ,BA 不同浓度间差异极为显著 ,其中以 5号处理(10mg L)为最好 ,不仅芽分化数量多 ,增殖系数大(平
均达 6.52 ,少数几株达到 15以上),而且分化时间早 ,生长快;1 、2 、3号处理分化少 ,生长慢;4号处理虽然
随着浓度的提高芽分化情况有所改善 ,但也不如 5号处理;6号处理的分化时间与增殖系数虽与 5号处理
相同 ,但芽生长慢 ,表明 BA浓度过高芽的生长受到了抑制 ,总的情况不如 5号处理好 。
表 4　不同浓度 BA对东方杉芽增殖的影响
Table 4　Effects of di fferent concentrations BA on regeneration and multiplication of buds
编号
No.of
t reatment
BA(mg L)
芽平均数 瓶
Mean bud number
per flask
增殖系数
Multiplication
coeffi cient
分化和生长情况
State of dif ferentiation
and grow th
分化开始时间
First di ff erent iation
t ime(d)
1 　　0.5 　　　5.57E 1.11 分化少 ,生长慢(Dif ferentiating less , grow ing slow) 30
2 1 9.67D 1.93 分化少 ,生长慢(Dif ferentiating less , growing slow) 30
3 2 12.0C 2.40 分化少 ,生长慢(Dif ferentiating less , growing slow) 25
4 5 15.4B 3.08 分化较多 ,生长较快(Dif ferentiating more , grow ing quick) 25
5 10 32.6A 6.52 分化多 ,生长快(Dif ferentiating more , growing quick) 15
6 15 32.6A 6.52 分化多 ,生长受抑制(Dif ferentiating more , grow ing very slow) 15
LSD 0.05 = 0.37 , LSD 0.01 = 0.53
2.7　生长调节剂对芽伸长的影响　虽然用 BA 10mg L 处理能增殖较多的芽 ,但这些芽不能伸长 ,为了促
进芽的进一步伸长 ,用HM I 、IBA(吲哚丁酸)、GA3(赤霉素)三种生长调节剂 6个浓度的芽伸长试验 ,一个
月后统计芽伸长的结果表明 ,三种生长调节剂中以 HM I效果最好 ,GA 3 与 IBA不起作用 。HM I不同浓度
对芽伸长的影响结果列于表 5。
从中可以看出 , HM I 对东方杉芽的伸长有明显影响 , 且影响程度与 HM I 浓度有密切关系 。
在 0.5 ～ 50mg L范围内芽的长度与叶色同 HMI 使用浓度呈正相关(相关系数 r =0.9869%＊＊),
如 5号处理(50mg L)芽长度为最长 ,叶色也最浓 。但浓度提高到 100 mg L时芽的长度反而不如 50 mg L
处理 ,芽的基部还产生了褐化 , 各处理中以 5 号处理为最佳。另外我们还发现 , 在培养基中同时加入
BA 10mg L 和 HM I 50mg L 可使外植体同时达到分化和伸长的效果 。迄今 ,还未得到生根苗 ,实验正在
进行 。
133 期　　　　　　　　　　　　　　周　音等:东方杉不定芽的高频率分化研究
表 5　HMI不同浓度对东方杉芽伸长的影响
Table 5　Effects of different concentrations HMI on elongation of buds
编号
No.of
t reatment
HMI(mg L) 叶色Leaf color
平均芽长度(mm 月)
Mean shoot length(mm month)
编号
No.of
t reatment
HMI(mg L) 叶色Leaf color
平均芽长度(mm 月)
M ean shoot length(mm month)
1 0.5 绿(Green) 5.17e 4 10 浓绿(S t rong green) 8.33b
2 1 绿(Green) 6.33d 5 50 浓绿(S t rong green) 10.40a
3 5 绿(Green) 7.23c 6 100 绿褐(Green , brow n) 6.53d
LSD 0.05 = 0.54 , LSD 0.01 = 0.76。
3　结　论
3.1　东方杉的外植体以当年生的顶芽与侧芽为最好 ,取材时间春天好于秋天。外植体的消毒以 10%次
氯酸钠 30min为佳。
3.2　改良的 MS培养基为最佳培养基;WS培养基次之。说明无机盐浓度较高的培养基更有利于东方杉
的生长。
3.3　BA对东方杉芽的分化有明显促进作用;而 ZT 、2ip对其均无作用 。BA 浓度以 10mg L 为最佳。增
值系数达 6.52。
3.4　HMI 能明显促进东方杉芽的伸长;而GA3 与 IBA 不起作用 。HM I的最佳浓度为 50mg L。
参　考　文　献
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HIGH FREQUENCY DIFFERENTIATIONOF ADVENTITIOUS
BUDS INDUCED FROM Taxodium mucronatum×Cryptomeria fortunei
Zhou Yin
1)　Zhang Zhiqi1)　Liu Jinpeng1)　Gu Jiaqing1)　Zhang Jianjun1)
Shen Lieying
2)　Zhu Weijie2)　Pan Shihua2)　Ye Zengji2)
Wang Jun
3)　Tang Xueyuan3)　Shen Genhua3)
(1)Forestry and Pomology Research Insti tute ,
Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 201106;
2)
Shanghai Forestry S tat ion , Shanghai 200072;　3)Songjiang Forestry Station , Shanghai 201600)
Abstract　The current terminal buds , lateral buds and stems of 30-year-old Taxodium mucronatum ×
Cryptomeria fortunei were used as explants , and through tissue culture the dif ferent iation , multiplication and
elongation of the adventitions buds were studied.The results show ed that the best minimal medium for the
explants of Taxodium mucronatum ×Cryptomeria fortunei was the modified MS medium .The modified MS
medium supplemented w ith 10mg L BA could induce the dif ferentiation of the adventitious buds high-f re-
quently , and the multiplication coefficient reached 6.52.The appropriate medium for the elongation of the
adventi tious buds w as the modif ied MS medium supplemented wi th 50mg L hymexzal(HM I).
Key words　 Taxodium mucronatum ×Cryptomeria fortunei;Tissue culture;Inducing adventitious
buds;Rapid propagation
14 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　20卷