全 文 ：收稿日期:2004-12-22初稿;2005-06-21二改稿
　＊上海市科技兴农项目 “落羽杉的快速繁殖技术和苗木生产(2001)第 1-5号”
作者简介:周　音(1962-)女,硕士 ,副研究员 ,目前研究方向:林木生物技术。联系电话:(021)62208660-3079
　上海农业学报　2005 , 21(3):21 ～ 25
　Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:1000-3924(2005)03-21-05
三种试剂对东方杉
(Taxodium mucronatum×Cryptomeria fortunei)
愈伤组织抑制褐变的影响＊
周　音1 , 张建军1 , 张智奇1 , 顾佳清1 , 沈烈英2 , 竺唯杰1
潘士华2 , 叶增基2 , 王　军3 , 唐雪元3 , 沈根华3
(1 上海市农业科学院林木果树研究所,上海 201106;
　2 上海市林业站 ,上海 200072;
3上海市松江区林业站 ,上海 201600)
摘　要:应用“311-B”回归最优设计研究抗坏血酸 、亚硫酸钠 、柠檬酸对东方杉愈伤组织褐化率的影响。得
出培养 14d时的回归方程为 Y 2=0.688+0.586X 1-0.211 X2+0.523X 3+0.481X 21+0.612 X 22+1.312X 23+0.
633 X 1X 2+0.075 X1 X 3-0.978X 2X 3 , 其 Ryy=0.9822﹡﹡ , 愈伤组织褐化率与试剂处理呈极显著相关。结果表
明:(1)3 种试剂单独使用时对愈伤组织褐化抑制效果与培养时期有关 , 在培养初期抑制褐化效果为柠檬酸>抗
坏血酸>亚硫酸钠。随培养时间延长到 14d 时 ,抗坏血酸与柠檬酸的效果逐渐减弱或消失 , 而亚硫酸钠的作用
最为明显 ,褐化率降到 21%, 使用浓度为 0.438g·L -1 。(2)在培养期间 3 种试剂配合使用对愈伤组织褐化抑制
有明显的交互作用 ,培养 14d 时 , 褐化率降到 8%, 抗坏血酸 、亚硫酸钠 、柠檬酸三者配合使用最佳浓度分别为 0.
25、0.25 和 5g·L-1 。各种试剂对东方杉愈伤组织褐化抑制效应与其化学性质有关。
关键词:东方杉;组织培养;愈伤组织;褐化;回归最优设计
中图分类号:S722.34　　　　文献标识码:A
东方杉(Taxodium mucronatum ×Cryptomeria fortunei)是我国著名林木育种专家叶培忠教授 1963
年用柳杉花粉对墨西哥落羽杉进行授粉杂交 ,经过近 40年的努力育成的我国特有的新树种[ 1] 。东方杉抗
风 、耐湿且耐盐碱 ,是一种在上海地区极为适生的绿化造林树种 ,对上海地区的绿化造林和生态建设具有
重大意义 。东方杉不结籽 ,在林地上也未见次生苗 ,种源缺乏 ,树龄过高 ,繁殖困难是其推广应用的主要障
碍。目前虽通过扦插繁殖获得了一批种苗 ,但繁殖速度仍较慢 ,迫切需要通过探索新途径和新方法加快该
树种的繁殖和利用。笔者通过组织培养进行东方杉快繁[ 2] ,但在组织培养时愈伤组织的褐化非常严重 ,甚
至死亡。目前研究认为褐化的产生是培养组织中的多酚氧化酶被激活 ,催化酚类物质生成棕褐色的酚类
物质 ,逐渐扩散到培养基中 ,抑制其它酶的活性 ,以至培养物受到毒害[ 3] 。在克服植物组织培养褐变的措
施中 ,除了选择适宜的外植体及最佳培养基外 ,人们多采用抗氧化剂处理 ,常用的抗氧化剂有抗坏血酸 、柠
檬酸 、亚硫酸钠 、PVP[ 4 ～ 6]和 8-羟基喹啉[ 7]等 。有关东方杉愈伤组织褐化抑制的研究目前尚未见报道。前
人在研究组织培养抑制褐化的物质及浓度时 ,大多采用单因素多水平设计 ,实验处理庞大 ,获得的信息少
而单一 ,费时费工。“311-B”最优回归设计是一种多快好省的复合试验方法 ,在进行多因素多水平设计时
可采用最少处理实验方案 ,缩小实验规模 ,减小剩余自由度 ,提高实验效率 ,不仅研究出各因素的单独效
应 ,且能研究出各因素间的连应[ 8] ,过去主要在化肥等其它农业实验中应用 。作者曾在生菜组织培养中采
用“311-B”最优回归设计研究了 3种生长调节物质对生菜不定芽再生的影响 ,得到良好结果[ 9] 。为了探讨
降低褐化的配方 ,本实验采用多因素多水平“311-B”最优回归设计方法对 3种常见的 、作用机理不同的两
类抗氧化剂抗坏血酸 、柠檬酸及亚硫酸钠进行研究 ,探讨它们对东方杉愈伤组织褐化直接产生的各自影响
及交互作用。本文报道该项研究结果。
1　材料 与方 法
1.1　材　料
供试材料为取自上海市浦东新区川沙林场等处 30年生东方杉当年生顶芽 、侧芽和茎段。
1.2　方　法
1.2.1　愈伤组织诱导和培养
取30 年生东方杉当年生枝条用自来水冲洗后 , 切取顶芽 、侧芽和茎段 , 放入加有 2 滴吐温 20
(Tween20)的 10%次氯酸钠(NaClO)溶液消毒 30min ,用无菌蒸馏水冲洗 5 ～ 8次 ,吸干 ,剪成 3 ～ 5mm 小
段 ,接种于改良 MS培养基上 ,附加 NAA1mg·L-1 +CH1000mg·L-1+谷氨酰胺 500mg·L-1+蔗糖 3%+
琼脂 0.7%, pH6.0 ,在(25±1)℃黑暗中培养 。培养 30d后 ,取开始褐化的愈伤组织分别接于加有抗坏血
酸 、亚硫酸钠 、柠檬酸的上述培养基上 ,每皿接 10块愈伤组织 ,3种抗氧化剂的浓度和配方按“311-B”最优
回归设计 。培养 4d和 14d后分别统计各处理愈伤组织的褐化率 。
1.2.2　“311-B”最优回归设计
采用 3因素 5水平 11个处理的最优回归设计复合试验 ,简称“311-B”最优回归设计 ,确定抗坏血酸 、
亚硫酸钠 、柠檬酸 3因素 5水平试验处理 ,各试药的上水平(最大剂量)参照国内外有关资料确定 ,分别为
0.5 , 0.5 , 10g·L-1 ,下水平(最低剂量)为零。因素水平与药剂浓度见表 1。根据“311-B”设计结构矩阵确定
11个处理组合 ,增设 12处理作为对照 ,不施药 。各处理的施药配方见表 2 。
表 1　水平编码与浓度
Table 1　Coding level and concentration
水平
Level
抗坏血酸
Ascorbic acid
编码(X 1)
Coding
g·L -1
亚硫酸钠
S odium sulf ite
编码(X 2)
Coding
g·L -1
柠檬酸
Cit ric acid
编码(X 3)
Coding
g·L -1
1 　　-2.106 　　　0 　　-2.106 　　　0 　　　-2.45 　　　0
2 -0.751 0.062 -0.751 0.062 -1 0
3 0 0.250 0 0.250 0 5
4 0.751 0.438 0.751 0.438 1 10
5 2.106 0.777 2.106 0.777 2.45 17.25
表 2　实验方案
Table 2　Experimental plan
处理号
No.of
t reatment
抗坏血酸(Ascorbic acid)
编码(X 1)
Coding
g·L -1
亚硫酸钠(S odium sulf ite)
编码(X 2)
Coding
g·L -1
柠檬酸(Cit ric acid)
编码(X 3)
Coding
g·L -1
1 　　　0 　　 0.250 　　　0 　　 0.250 　　　2.45 　　 17.25
2 0 0.250 0 0.250 -2.45 0
3 -0.751 0.062 2.106 0.777 1 10
4 2.106 0.777 0.751 0.438 1 10
5 0.751 0.438 -2.106 0 1 10
6 -2.106 0 -0.751 0.062 1 10
7 0.751 0.438 2.106 0.777 -1 0
8 2.106 0.777 -0.751 0.062 -1 0
9 -0.751 0.062 -2.106 0 -1 0
10 -2.106 0 0.751 0.438 -1 0
11 0 0.250 0 0.250 0 5
12 　　　- 0 　　　- 0 　　　- 0
22 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　21卷
2　结果 与分 析
本实验中的褐化率是生长受到抑制的褐化愈伤组织块数占接种愈伤组织块数的百分比 ,用 Y 表示 。
通过“311-B”回归分析 ,结果表明 ,3种抗氧化剂对东方杉愈伤组织褐化率均有明显的抑制作用。各试剂
的抑制褐化效果 ,在培养初期(4d)为柠檬酸>抗坏血酸>亚硫酸钠 ,而培养 14d时亚硫酸钠作用最为明
显;3种试剂配合使用也有明显的交互作用 ,可使褐化率降到 8%(表 3)。
表 3　抗坏血酸 、亚硫酸钠及柠檬酸对东方杉愈伤组织褐变的影响
Table 3　Effects of Ascorbic acid , Sodium sulfite and
Citric acid on the browning of the calli of Taxodium mucronatum×Cryptomeria for tunei
处理号
No.of
t reatment
浓度(g·L -1)
Concent ration
抗坏血酸
Ascorbic acid
亚硫酸钠
Sodium sulfi te
柠檬酸
Cit ric acid
愈伤褐变数 皿
Brow n calli Pet ri dish
4d 14d
褐变率(%)
Percentage of browning
4d 14d
1 　　 0.250 　　 0.250 　　 17.25 　　　3.4 　　　9.3 　　　 34 　　　 93
2 0.250 0.250 0 8.0 7.9 80 79
3 0.062 0.777 10 3.5 2.3 35 23
4 0.777 0.438 10 2.0 6.7 20 67
5 0.438 0 10 5.0 7.2 50 72
6 0 0.062 10 6.5 6.6 65 66
7 0.438 0.777 0 7.6 7.4 76 74
8 0.777 0.062 0 2.8 3.2 28 32
9 0.062 0 0 5.4 3.2 54 32
10 0 0.438 0 3.0 2.1 30 21
11 0.250 0.250 5 2.3 0.8 23 8
12 0 0 0 10.0 10.0 100 100
应用“311-B”回归分析程序进行数据处理得出褐化率与抗坏血酸(X 1)、亚硫酸钠(X 2)及柠檬酸
(X 3)的回归方程如下:
Y 1 =2.205-0.356X 1 -0.088X 2 -0.653X 3 +0.098X 21 +0.572X 22 +0.585X 23 +0.569X 1 X 2 -
0.479X 1 X 3 -0.566X 2 X 3
Y 2 =0.688+0.586X 1 -0.211X 2 +0.523X 3 +0.481X 21 +0.612X 22 +1.312X 23 +0.633X 1 X 2 +
0.075X 1 X 3 -0.978X 2 X 3
Y 1 为接种 4d的统计结果 , Y 2 为接种 14d的统计结果。
采用相关系数 Ryy 和 X2 检验相结合的判断法进行检验。结果表明 ,回归方程 Y 1 的 Ryy =0.9726﹡﹡,
远大于R 0.01(10)=0.708 ,达到相关极显著水准 , X2=0.6113 ,远小于 X 0.05(10)=18.3 ,差异不显著 ,即计算值
与实际值相吻合 ,此回归式能反映实际情况;Y 2 的 Ryy =0.9822﹡﹡ ,远大于 R0.01(10)=0.708 ,达到相关极显
著水准 , X2 =0.6717 ,远小于 X20.05(10)=18.3 , 差异不显著 ,即计算值与实际值相吻合 ,此回归式能反映实
际情况 ,以上说明此二回归方程均具有实际意义。
从回归方程 Y 1 的一次项可以看出 , X 1 、X2 、X 3 的偏回归系数均为负值 ,表明抗坏血酸 、亚硫酸钠及柠檬
酸均对东方杉愈伤组织褐化有直接良好的抑制作用 。偏回归系数的具体数据显示:b3>b1 >b2 ,表明柠檬酸
的作用大于抗坏血酸 ,亚硫酸钠的作用最小。该结果与胡风庆等[ 4] 对东北红豆杉的研究结果相似。再从交
互项则可看出 ,抗坏血酸与柠檬酸 ,亚硫酸钠与柠檬酸之间还具有较明显的交互作用 ,说明它们的配合使用
可以抑制愈伤组织的褐化 。而抗坏血酸与亚硫酸钠之间的交互作用为正值 ,说明此二者的配合使用对褐化
无抑制作用 。再过 10d ,各处理愈伤组织的褐化抑制情况发生了变化。从回归方程 Y 2 的一次项可以看出 ,
X 2 的偏回归系数仍为负值 ,表明经过一段时间后亚硫酸钠的抑制褐化作用有所增强 ,而 X1 和 X 3 的偏回归
系数变为正值 ,说明抗坏血酸与柠檬酸抑制褐化作用已经减弱甚至于消失。这一结果与顾之中等[ 5] 在水稻
上的结果相一致。抗坏血酸与柠檬酸在培养前期降低褐化率的效应最好 ,但随培养期延长其效应逐渐降低
或消失。而从交互项可以看出 ,只有亚硫酸钠与柠檬酸之间还具有明显的抑制褐化作用。而抗坏血酸与柠
233 期　周　音等:三种试剂对东方杉(Taxodium m ucronatum×Cryptomeria fortunei)愈伤组织抑制褐变的影响
檬酸 ,抗坏血酸与亚硫酸钠之间抑制褐化的交互作用已消失。
3　结论与 讨论
褐化是植物尤其是木本植物组织培养过程中一大难题。在建立外植体时 ,切口附近的细胞受到伤害 ,
“分割效应”被打破 ,酚类化合物与多酚氧化酶接触后经其催化迅速氧化成褐色的醌类物质和水 ,醌类物质又
会在酪氨酸酶等酶的作用下与外植体中的蛋白质发生聚合 ,进一步引起其它酶系统失活 ,导致组织代谢活动
紊乱 ,生长停滞而死亡[ 10] 。目前研究认为多酚氧化酶抑制剂对抑制褐化的产生有明显的作用 ,在多酚氧化酶
抑制剂中一类是影响氧化酶活性的物质 ,如抗坏血酸 ,能将该酶的 Cu2+还原成 Cu+[ 11] ,又如柠檬酸可作为络
合剂与从多酚氧化酶上解离下来的铜离子作用形成络合物 ,降低酚酶的活性;而且二者均为酸化剂 ,都可降
低体系 pH ,以减弱酚酶活力。而亚硫酸钠 ,亚硫酸氢钠[ 12] 等与前一类抑制剂作用机理不同 ,它们影响酚类化
合物与酶结合的部位 ,属于另一类褐化抑制剂。还有人认为亚硫酸盐是一种广泛的多功能抑制剂 ,阻止酶促
褐变和非酶促褐变 ,控制微生物生长 ,作为漂白剂 、抗氧化剂或还原剂 ,执行其它不同技术功能 。
实验选择了两类不同作用机理的 3种抗氧化剂 ,结果表明 ,在培养前期抗坏血酸 、柠檬酸和亚硫酸
钠单独使用均对东方杉愈伤组织的褐化有抑制作用 ,降低褐化率的效应以柠檬酸>抗坏血酸>亚硫酸钠 ,
而抗坏血酸与柠檬酸 ,亚硫酸钠与柠檬酸之间还具有较好的交互作用。但培养阶段不同 , 3种抗氧化剂的
抑制有效性程度也不尽相同 ,如柠檬酸与抗坏血酸在培养前期降低褐化率的效应最好 ,但随培养期延
长其效应却逐渐降低或消失 ,而亚硫酸钠在培养前期降低褐化率的效应稍差 ,但培养中后期却发挥了最
大效应。至于不同抗氧化剂对东方杉愈伤组织抑制褐变最大效应时期变化的原因 ,可能与抗氧化剂本身
的化学性质(如酸碱性 ,稳定性等)有关 ,而亚硫酸钠为碱性 ,其 pH 为 9 ,使培养体系 pH提高 ,培养基 pH 值
的变化可引起酚类物质与多酚氧化酶结合部位的改变[ 12] 。两类抑制剂的应用引起培养基 pH 值变化
不同 ,势必对多酚氧化酶的抑制作用时间也会不同 ,有关这一点还需进一步研究。就稳定性而言 ,抗坏血
酸与柠檬酸极易分解 ,稳定性比亚硫酸钠差得多 ,它们在培养前期降低褐化率的效应较为显著 ,而后期
作用则下降或消失。此外 ,还可能与愈伤块内部的代谢变化及抗氧化剂本身与愈伤代谢活动的相互作用
等因素有关 ,有待进一步研究。
综上所述 ,由于抗坏血酸 、柠檬酸与亚硫酸钠的化学性质 ,作用机理及发挥作用的时间各不同 ,为保证东
方杉愈伤组织的褐变能被更有效地控制 ,最好选取 3种抗氧化剂配合使用 ,相互取长补短 ,使培养前期与后
期均能有效地减少褐化产生。在本实验“311-B”11个处理中 ,3种抗氧化剂配合使用的以第 11号处理为最
佳 ,处理 14d时褐化率仅为 8%,其配比浓度为抗坏血酸0.25g·L-1+亚硫酸钠 0.25g·L-1 +柠檬酸 5g·L-1;
其次是第 3号处理 ,处理 14d时褐化率为 23%,配比浓度为抗坏血酸 0.062g·L-1+亚硫酸钠 0.777g·L-1+
柠檬酸 10g·L-1 。抗氧化剂单独使用的以 10号处理为最好 ,亚硫酸钠单独使用浓度为0.438g·L-1 ,处理 14d
时褐化率为 21%,此可能与亚硫酸钠的化学稳定性及其广泛的多功能抑制作用有关。
参　考　文　献
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24 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　21卷
Effects of 3 Anti-browning Reagents on the Browning of the
Calli of Taxodium mucronatum×Cryptomeria fortunei
ZHOU Yin
1 , ZHANG Jian-jun1 , ZHANG Zhi-qi1 , GU Jia-qing1 , SHEN Lie-ying2 , ZHU Wei-jie1
PAN Shi-hua2 , YE Zeng-ji2 , WANG Jun3 , TANG Xue-yuan3 , SHEN Gen-hua3
(1 Forestry and Pomology Research Institute ,
Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 201106 , China;
2
Shanghai Forestry Station , Shanghai 200072 , China;
3
Songjiang Forestry Station , Shanghai 201600 , China)
Abstract:The anti-browning effects of ascorbic acid , sodium sulfite and citric acid on the browning of the calli of
Taxodium mucronatum ×Cryptomeria fortunei were studied by optimal regressive designs.The regressive equation
w hen cultured for 14d was Y 2 =0.688+0.586X1 -0.211X 2 +0.523X 3 +0.481X21 +0.612X22 +1.312X 23 +
0.633X 1 X2 +0.075 X1 X 3 -0.978 X 2 X 3.Ry=0.982﹡﹡ ,There was obvious correlation between browning rate and
using of 3 kinds of reagents.The results showed:(1)The anti-browning effect of each reagent on callus was related to
the cultural period.The effect sequence of anti-brow ning was citric acid>ascorbic acid>sodium sulfite when cultured
for 4d.The effects of ascorbic acid and citric acid decreased and disappeared gradually when cultured for 14d , but the
effect of sodium sulfite was more effective than others.The percentage of browning of sodium sulfite was 21%, its
suitable concentration was 0.438 g·L-1.(2)The interactive effect of three kinds of reagent was obvious during cultur-
al period.The percentage of brow ning was 8%when cultured 14d , the best suitable concentration of three reagents
combination w as ascorbic acid 2.5 g·L-1 , sodium sulfite 2.5 g·L-1 , citric acid 5 g·L-1 .The anti-brow ning effect of
each reagent on callus was related to its chemical character.
Key words:Taxodium mucronatum × Cryptomeria fortunei;Tissue culture;Callus;Browning;Optimal
regressive designs
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电　　话:(021)62208660-3175　　E-mail:xx6@saas.sh.cn
253 期　周　音等:三种试剂对东方杉(Taxodium m ucronatum×Cryptomeria fortunei)愈伤组织抑制褐变的影响