全 文 ：中国农学通报 2011,27(12):187-190
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
原生质体是指已去除细胞壁的细胞，具有完整细
胞的生理特性，它不仅可以作为一个单细胞系统来研
究细胞的生长发育过程，包括细胞壁的再生、细胞分
裂和分化等 [1]，还能进行导入外源基因、病毒侵染等
操作[2]，因此被广泛应用于植物中如基因表达、启动子
分析、种质改良等多个研究领域[3-6]。而获取大量的活
性原生质体则是其上述研究应用所要求的关键技术指
标。原生质体常用的提取法为双酶酶解法，主要包括
酶液水解及洗液纯化2个步骤。前人对原生质体分离
的研究主要集中于酶液中各组分的优化组合[7-9]，而对
洗液的研究报道较少。然而洗液在原生质体分离过程
中，不仅有去除酶液、细胞碎片和纯化原生质体的作
用，而且在一定时间内有保存原生质体的功能，因此洗
液对原生质体的数量与活力有重要影响。WI、W5和
MMg是3种配置方法简单、较多用于原生质体分离的
洗液[10-11]，三者因配置成分不同在维持原生质体稳定性
上具有一定差异。孙琳琳[12]曾认为WI洗液可能更有
基金项目：本研究由湖南省教育厅科学研究项目(09K051)。
第一作者简介：赵严伟，女，1987年出生，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向细胞生物物理。通信地址：410128湖南农业大学生命科学楼湖南省植物
激素重点实验室，Tel：0731-84635620，E-mail：galio10@yahoo.cn。
通讯作者：李合松，男，1955年出生，湖南衡阳人，教授，学士，生物物理点硕士导师，主要从事生物物理研究。通信地址：410128湖南农业大学生物科
学技术学院，Tel：0731-84635620，E-mail：hesongli@yahoo.com.cn。
收稿日期：2011-03-10，修回日期：2011-05-11。
洗液对拟南芥叶原生质体分离的影响
赵严伟，黄志刚，李合松
（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128）
摘 要：原生质体分离过程中洗液对原生质体的纯化和保存起着重要的作用。本试验通过比较30 h内
WI、W5、MMg 3种洗液中原生质体数量与活力的变化以及分析不同浓度CaCl2处理WI、W5、MMg后对
原生质体的影响，选择出获得最多活性原生质体数量的洗液。结果表明，WI在维持质膜稳定性上较有
优势，而W5则更有利于保持原生质体活力且30 h后得到的活性原生质体最多，较适宜在短期内保存原
生质体；CaCl2处理洗液对原生质体活力无显著影响，且其对原生质体数量的影响取决于CaCl2处理浓度
及洗液种类，MMg洗液在补充0~50 mM CaCl2后原生质体数量呈上升趋势。
关键词：原生质体；洗液；CaCl2
中图分类号：Q25 文献标志码：A 论文编号：2011-0604
The Influence of Washing Buffer on Isolation of Arabidopsis thaliana Mesophyll Protoplasts
Zhao Yanwei, Huang Zhigang，Li Hesong
(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)
Abstract: Washing buffer plays an important role in protoplasts purification and storing when protoplasts
isolated. The study compared yiled and viability change of protoplasts in washing buffer of WI, W5 and MMg in
30 h, analyzed the influence of CaCl2 with different concentration on protoplasts in WI, W5 and MMg to get the
suitable washing buffer for the highest viable protoplasts. The results indicated that WI was better at
maintaining plasma membrane, while W5 was better on keeping viability, after 30 h W5 got the highest viable
protoplasts population which was good for storing protoplasts in a short period; CaCl2 treatment showed little
influence on protoplasts viability and its population improving effect depended on its concentration and the
washing buffer type, there was a uptrend of viable protoplasts in MMg when treated with 0-50 mM CaCl2.
Key words: protoplast; washing buffer; CaCl2
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利于保存转化后的原生质体，Yoo等[10]曾提出洗液中
适当补充Ca2+可能有利于提高原生质体产率，但目前
还未见系统对洗液进行比较的研究。本试验在前人研
究基础上，以拟南芥叶片为试材，系统分析WI、W5、
MMg 3种洗液、原生质体不同保存时间和补充不同浓
度Ca2+等处理对原生质体数量与活力的影响，旨在筛
选出最佳的原生质体保存洗液及应用技术体系，为后
续的原生质体应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis accessions:
Col-0）种子经 4℃春化处理 3天，播种于培养基质（营
养土:蛭石=1:3）中，光照培养箱培养。培养条件为：温
度 22℃，光/暗周期 12 h/12 h，湿度 70%。取生长 35天
丛生叶片的第7、8、9片平展叶为试验材料。
1.2 试剂
（1）酶解液：20 mM MES（pH 5.7）中加入1.5%（w/v）
纤维素酶 R-10（Yacult Honsha Co.，Tokyo，Japan）与
0.4%（w/v）离析酶 R-10（Yacult Honsha Co.，Tokyo，
Japan)，0.4 M甘露醇，20 mM KCl，10 mM CaCl2及
0.1%（w/v）BSA，0.45 μm滤膜过滤。
（2）WI缓冲液：0.5 M甘露醇，4 mM MES（pH
5.7），20 mM KCl。0.45 μm滤膜过滤。
（3）W5 缓冲液：154 mM NaCl，25 mM CaCl2，
5 mM KCl，2 mM MES（pH 5.7），5 mM葡萄糖。0.45 μm
滤膜过滤。
（4）MMg缓冲液：4 mM MES（pH 5.7），0.4 M甘露
醇，15 mM MgCl2。0.45 μm滤膜过滤。
1.3 原生质体的分离
待拟南芥叶片宽至 1~2 cm时，取叶片，纵切成 1~
2 mm宽的细条后转移至酶解液中，材料鲜重（g）:酶液
体积（mL）为 1:15。25℃黑暗静置条件酶解 4 h，25℃
恒温摇床上 60 r/min震荡游离 30 min，释放分离的原
生质体。
1.4 原生质体纯化
酶解结束后，酶解液经 200目细胞筛过滤。滤液
1000 r/min（0.1 RCF）离心 2 min，取沉淀悬浮于洗液
中，洗涤 3次（1000 r/min×1 min），获得较纯净的原生
质体。血球计数板计数，0.01%中性红检测原生质体
活力[11]。
2 结果与分析
2.1 保存时间对不同洗液中原生质体数量的影响
WI、W5、MMg是3种可用于洗涤及短期（≤24 h）
保存原生质体的缓冲液 [1]。酶解结束立即加入WI、
W5、MMg将原生质体稀释至一定浓度。分别在WI、
W5、MMg稀释液中吸取106个原生质体，比较这106个
原生质体在WI、W5、MMg中随时间变化的数量变化。
从图 1可知，6 h后，3种洗液中保存的拟南芥叶
肉细胞原生质体数量均开始出现不同程度的下降，
WI中下降趋势较平缓。24 h内，WI、W5、MMg中原
生质体数量下降率分别为 3.0%、4.5%和 7.0%；而在
30 h后，原生质体数量分别为初始时的 96.0%，91.5%
和90.0%。
2.2 保存时间对不同洗液中活力原生质体数量的影响
对从WI、W5、MMg中吸取的 106个原生质体分
别在洗液中静置0、6、12、18、24、30 h后进行活力统计，
并比较有活力的原生质体数量。从表 1可知，原生质
体在W5洗液中保存时活力随时间下降得较缓慢，初
始活力为94.1%，30 h后降低了4.0%，W5与MMg中原
生质体活力30 h后分别降低了8.1%和9.4%，且在检测
的各个时间段，有活力原生质体数量是均是W5>WI>
MMg。
2.3 CaCl2处理对不同洗液中原生质体产量的影响
以CaCl2为Ca2+来源，酶解结束后用分别补充 0、
10、20、30、40、50 mM CaCl2溶液的WI、W5、MMg洗液
清洗纯化原生质体。分析同样条件下分离的原生质体
在补充 0、10、20、30、40、50 mM CaCl2溶液的WI、W5、
MMg洗液中清洗纯化后数量是否有变化。每个处理
3个重复。
从图 2可知，WI和W5中的原生质体数量分别在
补充 10 mM CaCl2和 20 mMCaCl2溶液后开始下降，而
MMg中的原生质体数量在CaCl2溶液补充范围为 0~
50 mM 时一直处于上升趋势，其最高值分别为
(4.05 ± 0.30) × 106、 (3.80 ± 0.21) × 106 及
(3.60±0.17)×106个。
8.50
9.00
9.50
10.00
10.50
0 6 12 18 24 30
保存时间/h
原
生
质
体
数
量
/10万
W5 WI MMg
图1 保存时间对不同洗液中原生质体数量的影响
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赵严伟等：洗液对拟南芥叶原生质体分离的影响
2.4 CaCl2处理对不同洗液中活力原生质体数量的影
响
分析同样条件下分离的原生质体在分别补充 0、
10、20、30、40、50 mM CaCl2的WI、W5、MMg洗液清洗
纯化后原生质体活力是否有变化，并分析有活力的原
生质体数量在不同浓度CaCl2处理后的差异。每个处
理3个重复。
表2表明，在3种洗液中补充0~50 mM CaCl2后对
原生质体活力并无显著影响，最高活力增加率分别为
0.9%（WI），0.4%（W5）及 1.1%（MMg）。随处理CaCl2
浓度变化，WI、W5、MMg 3种洗液中有活力原生质体
数量变化趋势不一，其最高值分别为(3.78±0.19)×106
（10 mM）、 (3.62 ± 0.16) × 106 （20 mM）、
(3.28±0.16)×106（50 mM）个。
3 结论与讨论
高活性的原生质体是各种以原生质体为材料的研
究成功的基础，而以往对原生质体分离的探讨主要集
中于酶液组分，对洗液关注较少。本试验系统比较不
同洗液保存时间及洗液CaCl2处理对原生质体的影响，
有助于填补在原生质体分离体系中洗液研究的空白，
同时为得到高活性的原生质体提供技术参考。
原生质体分离过程中洗液对原生质体的纯化和保
存起着重要的作用，WI、W5、MMg 3种洗液在保持原
生质体活力与数量上作用有差异。本试验结果表明
WI中原生质体能较好地保持其完整性，与孙琳琳[12]将
转化后的原生质体在WI和W5中培养的比较结果一
致。表明WI确实在维持原生质体完整性上有优势，
这可能与WI中醇类与离子型渗透压稳定剂的混合使
用有关，表明 2种渗透压稳定剂混合使用更有利于维
持渗透压平衡及膜的稳定；而MMg中原生质体数量
明显的下降则可能是由于Mg2+替代了K+或Ca2+引起
的，表明K+或Ca2+对稳定质膜是必需的。W5则更有利
于维持原生质体活力。这可能是由于W5中含有的葡
表1 保存时间对不同洗液中有活力原生质体数量影响
保存时间/h
0
6
12
18
24
30
活力原生质体数量/10万
W5
9.41 (94.1%)
9.41 (94.1%)
9.27 (93.6%)
9.07 (92.8%)
8.71 (91.2%)
8.26 (89.5%)
WI
9.27 (92.7%)
9.26 (92.6%)
9.00 (91.4%)
8.73 (90.0%)
8.57 (88.4%)
8.18 (85.2%)
MMg
8.93 (89.3%)
8.92 (89.2%)
8.56 (87.8%)
8.22 (86.1%)
8.01 (84.0%)
7.56 (80.9%)
注：括号内为原生质体活力。下同。
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
0 10 20 30 40 50
处理CaCl2浓度/mM
原
生
质
体
数
量
/100万
WI W5 MMg
图2 CaCl2处理对不同洗液中原生质体数量的影响
CaCl2处理浓度/mM
0
10
20
30
40
50
活力原生质体数量/10万
W5
3.28 (93.7%)
3.53 (94.0%)
3.62 (94.0%)
3.39 (94.1%)
3.14 (94.0%)
2.92 (94.0%)
WI
3.73 (92.1%)
3.78 (92.3%)
3.70 (92.5%)
3.47 (92.5%)
3.27 (92.6%)
2.83 (92.8%)
MMg
2.70 (90.0%)
2.76 (90.5%)
2.95 (90.8%)
3.09 (91.0%)
3.19 (91.0%)
3.28 (91.0%)
表2 CaCl2处理对不同洗液中活力原生质体数量影响
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萄糖成分为原生质体提供了营养引起的[13]，表明原生
质体能够吸收洗液中的葡萄糖分子作为能量分子且原
生质体活力维持需要为其提供糖源。笔者试验数据显
示在MMg中补充0~50 mM CaCl2后，原生质体数量呈
上升趋势，表明CaCl2处理MMg对提高原生质体产率
有效，与Yoo等[10]的预测一致，这可能与Ca2+在植物细
胞抗逆境中的作用有关 [14]；但在WI和W5中，处理
CaCl2浓度分别升至20 mM CaCl2和30 mM CaCl2后,原
生质体数量反而下降，这可能是与WI和W5自身离子
浓度有关，过高的离子浓度破坏了渗透压平衡或者过
高的Ca2+浓度使Ca2+cyt升高，引起微管骨架解聚最终导
致原生质体解聚[15]。以上结果表明CaCl2处理洗液对
原生质体数量提高效应取决于CaCl2溶液处理浓度及
洗液种类。同时CaCl2处理对原生质体活力影响不明
显，表明Ca2+可能与原生质体活力无关。
本试验只选择了目前通用的W5、WI和MMg洗液
作为研究对象，为选择出最合适的洗液应扩大研究对
象，同时在研究Ca2+处理洗液对原生质体的影响时，后
续需要补充Ca2+抑制剂的处理作为阴性对照，以明确
其功能。
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