全 文 ：3 种假单胞菌CaCl2法感受态细胞制备及转化条件
*
赵摇 峰1,2 摇 张摇 颖1**摇 李摇 慧1 摇 史荣久1 摇 韩斯琴1
( 1中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 110016; 2中国科学院大学, 北京 100049)
摘摇 要摇 假单胞菌因其生境和代谢类型的多样性,在污染环境修复、生物转化、生物防治等领
域具有广阔的应用潜力;外源基因的导入是假单胞菌遗传改造的重要环节,而感受态细胞的
制备和转化方法的建立是导入外源基因的重要方法学基础.本研究以从石油污染土壤中分离
筛选的假单胞菌属的 3 个菌株 Pseudomonas putida TS11、P. stutzeri DNB、P. mendocina JJ12 为
对象,通过 3 因素 4 水平正交实验设计,研究了不同 CaCl2浓度、热激时间及复苏时间对不同
假单胞菌感受态细胞制备及转化效率的影响.结果表明: CaCl2浓度是影响假单胞菌转化效率
的最主要因素(P<0. 05),且在制备感受态细胞之前用无菌蒸馏水多次洗涤菌体细胞,转化率
明显提高. 3 种假单胞菌的 CaCl2转化优化条件分别为:100 mmol·L-1 CaCl2,热激 3 min,复苏
1. 5 h;50 mmol·L-1 CaCl2,热激 6 min,复苏 1. 5 h;75 mmol·L-1 CaCl2,热激 4. 5 min,复苏
0郾 5 h.在上述转化条件下,3 种假单胞菌的外源质粒转化效率均达到 105 个转化子·滋g-1
DNA水平.
关键词摇 假单胞菌摇 CaCl2转化摇 正交试验设计摇 转化效率
*国家自然科学基金项目(31070102)和大庆油田有限责任公司项目资助.
**通讯作者. E鄄mail: yzhang@ iae. ac. cn
2012鄄07鄄03 收稿,2012鄄12鄄31 接受.
文章编号摇 1001-9332(2013)03-0788-07摇 中图分类号摇 Q785摇 文献标识码摇 A
CaCl2 鄄heat shock preparation of competent cells of three Pseudomonas strains and related
transformation conditions. ZHAO Feng1,2, ZHANG Ying1, LI Hui1, SHI Rong鄄jiu1, HAN Si鄄
qin1 ( 1 Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering, Institute of Applied
Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 2University of Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100049, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(3): 788-794.
Abstract: Pseudomonas, due to its diversity in habitat and metabolic type, makes it have broad
prospects applying in bioremediation, bioconversion, and biocontrol, while the introduction of exog鄄
enous gene is the key link to genetically modified Pseudomonas. The preparation and transformation
of competent cells are the important methodological basis of the introduction of exogenous gene. In
this paper, three Pseudomonas strains (P. putida TS11, P. stutzeri DNB, and P. mendocina JJ12)
isolated from a petroleum鄄contaminated soil were taken as the recipient strains, and a three鄄factor
and four鄄level orthogonal experiment was conducted to investigate the effects of CaCl2 concentration,
heat shock duration, and recovery duration on the preparation and transformation efficiency of the
strains competent cells. The results showed that CaCl2 concentration was the most important factor
affecting the transformation efficiency (P<0. 05), and the transformation efficiency was improved
markedly when the Pseudomonas cells were repeatedly washed with sterile distilled water before the
preparation of competent cells. When the P. putida TS11 cells were treated with 100 mmol·L-1 of
CaCl2, heat鄄shocked for 3 minutes at 42 益, and incubated for 1郾 5 hours at 30 益, the P. stutzeri
DNB cells were treated with 50 mmol·L-1 of CaCl2, heat鄄shocked for 6 minutes, and incubated for
1郾 5 hours, and the P. mendocina JJ12 cells were treated with 75 mmol·L-1 of CaCl2, heat鄄
shocked for 4. 5 minutes, and incubated for 0. 5 hours, the transformation efficiency of exogenous
plasmids in the three strains all achieved 105 cells·滋g-1 DNA.
Key words: Pseudomonas; calcium chloride transformation; orthogonal experimental design; trans鄄
formation efficiency.
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 3 月摇 第 24 卷摇 第 3 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Mar. 2013,24(3): 788-794
摇 摇 假单胞菌是一类广泛分布于土壤、淡水、海水等
生境中的革兰氏阴性无芽孢杆菌,代谢类型多
样[1],在环境污染修复[2-4]、生物转化[5]和生物防
治[6]等领域具有重要的研究和应用价值,尤其在污
染环境的生物修复方面,广泛用于多环芳烃、石油、
农药等有机污染物的降解,水体富营养化治理以及
重金属污染的处理.有研究表明,假单胞菌除了识别
本身的启动子外,还对大肠杆菌(Escherichia coli)的
某些强启动子(如 lac、tac)有很强的识别能力,有利
于异源基因在假单胞菌中的高水平表达[7];假单胞
菌属的一些代表种,如恶臭假单胞菌(Pseudomonas
putida)KT2440[8]、施氏假单胞菌(P. stutzeri) ZoBe鄄
ll[9]、门多萨假单胞菌(P. mendocina)NK鄄01[10],都
已完成全基因组测序,其遗传背景已比较清楚.更重
要的是,假单胞菌广泛的温度、pH 生长范围和多样
的营养代谢类型,是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacil鄄
lus subtilis)等模式菌株无法比拟的[11-12] . 这些特性
不仅使假单胞菌成为异源基因克隆与表达的优良宿
主,也使得对假单胞菌进行遗传改良,将其应用于各
种复杂的污染环境生物修复成为可能.
目前报道的将外源基因导入假单胞菌的方法主
要为电转化[13-14]和接合转移[15-16] . 但是,电转化方
法需要专门的仪器设备,制备的感受态细胞不稳定,
重复性差,需要低离子强度和高电压,且电击时条件
剧烈,大部分细胞会因电击而死亡.接合转移方法是
通过带有特殊基因的质粒将外源基因引入假单胞菌
细胞内,但是需要细胞与细胞间的有效接触,转化频
率低,且普通质粒的应用受到限制.
Mandel和 Higa[17]于 1970 年最先发现了低浓度
CaCl2能诱导细胞成为能摄取外源 DNA 的感受态细
胞,1972 年 Cohen 等[18]利用 CaCl2转化方法首次将
R质粒转化到大肠杆菌. 但是迄今为止,CaCl2的诱
导机制尚未完全清楚. 一般认为,低温下低浓度
CaCl2能提高细胞膜的通透性,Ca2 +还能与外源 DNA
分子结合,形成抗 DNase 的羟基鄄磷酸钙复合物,黏
附在胞膜的外表面,42 益热激,使细胞膜上出现微
小孔,使得外源 DNA 得以进入细胞内. 因此,CaCl2
浓度和热激时间对转化效率高低至关重要. CaCl2转
化法操作简单,不需要特殊设备,转化效率足以满足
一般克隆试验的需要. 目前,CaCl2转化方法在大肠
杆菌上应用较多,而在假单胞菌属细菌中仅在铜绿
假单胞菌(P. aeruginosa) [19]、恶臭假单胞菌(P. pu鄄
tida) [20-21]、丁香假单胞菌(P. syringae) [22]、荧光假
单胞菌(P. fluorescens) [23-25]和类产碱假单胞菌(P.
pseudoalcaligenes) [26]有过成功报道,但是大多数都
还需要超声波、PIPES 缓冲液处理等条件,来辅助
CaCl2转化方法.另外,假单胞菌属的其他一些种,如
本研究中的施氏假单胞菌和门多萨假单胞菌,还未
见有 CaCl2转化方法的相关报道.
鉴于假单胞菌所具有的潜在的应用价值,以筛
选自石油污染土壤的烃降解菌 P. putida TS11、反硝
化细菌 P. stutzeri DNB 和聚丙烯酰胺降解菌 P.
mendocina JJ12 为研究对象,设计了 CaCl2浓度、热激
时间及复苏时间的 3 因素 4 水平正交试验,利用本
实验室构建的广宿主质粒 pBBR1鄄2rhl对 3 种假单胞
菌进行了 CaCl2法感受态细胞制备和转化条件的摸
索,得到了 3种假单胞菌 CaCl2转化方法的优化条件,
旨在为进一步探讨异源基因在假单胞菌中的克隆与
表达及假单胞菌属工程菌的构建打下方法学基础.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
1郾 1郾 1 菌株与质粒 摇 恶臭假单胞菌 ( P. putida)
TS11、施氏假单胞菌(P. stutzeri) DNB 和门多萨假
单胞菌(P. mendocina) JJ12 均为本实验室保存菌
种,且经检验均无卡那霉素抗性. pBBR1鄄2rhl 质粒
为本实验室构建(9. 5Kb,具卡那霉素抗性,其上具
有 M13鄄47 / RV鄄M 引物对,在引物对之间包含有
4410 bp的外源 DNA片段),保存在大肠杆菌 E. coli
DH5琢中.
1郾 1郾 2 主要试剂与仪器 摇 rTaq DNA 聚合酶、姿鄄Hind
芋 digest分子质量标准均为宝生物工程(大连)有
限公司产品;卡那霉素、SOC 培养基、CaCl2·2H2O
(ACS级别)、引物 M13鄄47 / RV鄄M 均为上海生工产
品;高纯度质粒小提试剂盒为康为世纪公司生产,其
他试剂均为国产分析纯. 主要仪器为 PCR 仪(美国
ABI公司的 Veriti 96 well Thermal cycler)、凝胶成像
系统(美国 Bio鄄RAD 公司的 Gel Doc2000TM)、微型
紫外分光光度计 (美国 Thermo 公司的 Nanodrop
2000)、低温离心机(美国 Thermo 公司的 BIOFUGE
PRIMOR)、电泳仪(北京六一仪器有限公司)、JSM鄄
T300 扫描电镜(日本岛津公司).
1郾 1郾 3 培养基与溶液摇 1)LB 培养基(g·L-1):蛋白
胨 10,酵母粉 5,氯化钠 10,固体培养基添加 17 g 琼
脂粉. 2) LB 卡那霉素抗性培养基:LB 培养基加入
50 mg·mL-1卡那霉素至终浓度为 50 滋g·L-1 . 3)
SOC培养基(g·L-1):上海生工生物公司成品,按照
9873 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 峰等: 3 种假单胞菌 CaCl2法感受态细胞的制备及转化条件摇 摇 摇 摇 摇 摇
34 g·L-1浓度,添加蒸馏水配制. 4)CaCl2溶液:称取
CaCl2·2H2O,用蒸馏水分别配制浓度为 25、50、75、
100 mmol·L-1的溶液各 100 mL,备用. 5)50%甘油:
按甘油与无菌蒸馏水体积比 1 颐 1 比例配制.
1郾 2摇 质粒提取及感受态细胞的制备
采用高纯度质粒小提试剂盒,从大肠杆菌 E.
coli DH5 ( pBBR1鄄2rhl)的过夜培养物中,提取 pB鄄
BR1鄄2rhl质粒,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测确认后,
通过 Nanodrop 2000 微型紫外分光光度计测定质粒
浓度.
3 种假单胞菌感受态细胞的制备方法均参考
Cohen等[18]的方法并加以改进:自-70 益取出甘油
管保存的菌种,LB 培养基平板划线,30 益培养活
化;挑单菌落接入 10 mL 液体 LB 培养基中,30 益
200 r·min-1培养 14 h;按 1 颐 100 的接种量接入新
鲜的液体 LB培养基中,30 益 200 r·min-1培养 1 ~
2 h至 OD600为 0. 5 左右[23,27],将菌液转移到 50 mL
离心管中,冰浴 20 min;4 益 7000伊g 离心 10 min 收
集菌体.无菌蒸馏水洗涤菌体 3 次,4 益 7000伊g 离
心 10 min,再用 CaCl2溶液轻轻洗涤一次;冰浴预冷
的 CaCl2 溶液处理菌体 1 h, 4 益 7000 伊g 离心 10
min;加入 0. 7 mL CaCl2和 0. 3 mL 50%甘油,轻轻重
悬菌体,按每管 100 滋L 分装. 按照上述同样制备方
法,再做一批未经蒸馏水多次洗涤处理的感受态细
胞,考察蒸馏水多次洗涤处理对转化效率的影响.
1郾 3摇 扫描电镜检测
收集 3 种菌对数生长期的新鲜菌液,将经 3 次
蒸馏水洗涤和经 1 次洗涤去除培养基成分的菌体制
备扫描电镜样本[28],电镜观察细胞表面结构.
1郾 4摇 CaCl2转化方案设计
由于 CaCl2浓度和热激时间对细菌 CaCl2热激
转化效率至关重要,因此参考了一些文献报
道[24-25],选择了影响 CaCl2热激转化的 CaCl2浓度、
热激时间及复苏时间 3 个主要因素,按照 L16(45)正
交表进行 3 因素 4 水平正交试验,如表 1 所示,以转
化效率(转化子·滋g-1质粒) 为评价指标,每个试验
组合设 3 个平行.具体试验方法:分别向 3 种假单胞
菌感受态细胞(100 滋L)中加入约 100 ng pBBR1鄄
2rhl质粒,经 42 益热激,冰浴处理后,迅速加入预热
至 30 益的 SOC培养基 890 滋L,30 益150 r·min-1复
苏培养,最后取 100 滋L 转化液涂布含终浓度为 50
滋g·L-1卡那霉素的 LB抗性平板,30 益倒置培养 2 d.
对试验结果进行极差分析和方差分析,确定 3
种假单胞菌转化的最优条件组合,然后再对获得的
最优条件进行 3 次重复试验验证,同时,做不添加质
粒的阴性对照.
1郾 5摇 转化子的筛选、鉴定及转化效率的计算
由于 3 种假单胞菌受体菌株在卡那霉素抗性平
板上均不能生长,因此,抗性平板长出的菌落可初步
判定为含有 pBBR1鄄2rhl质粒的阳性转化子.
每种菌分别随机挑取 10 个转化子,至含卡那霉
素的 LB液体培养基中过夜培养,参照《精编分子生
物学实验指南》 [29]的碱裂解方法提取质粒. 以 pB鄄
BR1鄄2rhl质粒载体上的 M13鄄47 / RV鄄M 引物对进行
PCR验证,以 pBBR1鄄2rhl 质粒为 PCR 阳性对照.
PCR反应体系:10伊PCR 反应缓冲液 2. 5 滋L,dNTPs
混合溶液(每种 2. 5 mmol·L-1)2 滋L,10 滋mol·L-1
M13鄄47 / RV鄄M引物各 1 滋L,质粒模板 1 滋L,Taq 酶
(5 U·滋L-1)0. 25 滋L,加灭菌去离子水至总体积为
25 滋L.反应条件:95 益预变性 5 min,94 益变性 1
min,55 益退火 30 s,72 益延伸 5 min,30 个循环,72
益延伸 10 min. PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳
检测.
对每一个试验组合的抗性平板上的菌落进行计
数,并计算转化效率(转化子数·滋g-1质粒 DNA):
转化效率=菌落平均数伊转化反应原液总体积 /涂板
菌液体积 /质粒 DNA加入量(滋g)= 3 个平板上菌落
平均数伊(1 mL / 100 滋L伊0郾 1 滋g).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 多次洗涤菌体对假单胞菌感受态细胞制备的
影响
在未经蒸馏水洗涤菌体时,也探索了多种转化
条件,但转化率几乎为零,推测这 3 株假单胞菌可能
具有胞外多糖结构,影响感受态细胞的形成及转化
效率.因此,改进了假单胞菌感受态细胞的制备方
法,在 CaCl2溶液处理前,先用无菌蒸馏水多次洗涤
菌体,以尽可能去除细胞表面可溶性多糖.经蒸馏水
洗涤处理菌体后,转化率明显提高.为进一步证实上
述猜测,对菌体表面结构进行扫描电镜观察.
扫描电镜观察发现(图 1),经无菌蒸馏水多次
洗涤的菌体细胞表面(B)较经蒸馏水一次洗涤的菌
体细胞表面(A)更为光滑,表明胞外结构经反复重
悬洗涤后被基本去除.
097 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
图 1摇 P. putida TS11(a) P. stutzeri DNB(b)和 P. mendocina
JJ12(c)菌扫描电镜图(伊20000)
Fig. 1 摇 Scanning electron microscope photograph of strains of
P. putida TS11 ( a), P. stutzeri DNB(b) and P. mendocina
JJ12 (c) (伊20000).
A:经蒸馏水一次洗涤的菌体细胞 Cells once washed with sterile dis鄄
tilled water; B:经无菌蒸馏水多次洗涤的菌体细胞 Cells repeatedly
washed with sterile distilled water.
2郾 2摇 阳性转化子鉴定
随机挑取在抗性平板上生长的 3 种假单胞菌的
单菌落共计 30 个,过夜培养,提取质粒,以质粒载体
上M13鄄47 / RV鄄M引物进行PCR验证 . 电泳结果显
图 2摇 M13鄄47 / RV鄄M PCR产物电泳图谱
Fig. 2摇 Electrophoresis map of M13鄄47 / RV鄄M PCR products.
1,10) 姿 / Hind芋 DNA 分子量标准 姿 / Hind 芋 DNA molecular mass
standards; 2,3) P. putida TS11 M13鄄47 / RV鄄M PCR 产物 P. putida
TS11 M13鄄47 / RV鄄M PCR products; 4,5) P. stutzeri DNB M13鄄47 / RV鄄
M PCR 产物 P. stutzeri DNB M13鄄47 / RV鄄M PCR product; 6,7) P.
mendocina JJ12 M13鄄47 / RV鄄M PCR 产物 P. mendocina JJ12 M13鄄47 /
RV鄄M PCR product; 8)阳性对照( pBBR1鄄2rhl) M13鄄47 / RV鄄M PCR
产物 Positive control (pBBR12rhl) M13鄄47 / RV鄄M PCR product; 9)阴
性对照 Negative control.
示,PCR产物均含有约 4. 4 kb 的单一目的片段(图
2),因此,所挑取的克隆均为阳性转化子.
2郾 3摇 正交试验结果分析
转化试验结果如表 1 所示,转化效率(转化子
·滋g-1质粒 DNA)= 3 个平板上菌落平均数伊102 .
摇 摇 对正交试验结果进行极差分析,结果表明,3 个
因素对 3 种假单胞菌转化效率影响大小的次序为:
P. putida TS11:CaCl2浓度>热激时间>复苏时间;P.
stutzeri DNB:CaCl2浓度>复苏时间 >热激时间;P.
mendocina JJ12:CaCl2浓度>复苏时间>热激时间(表
2).影响 3 种假单胞菌转化效率高低的最主要因素
均为 CaCl2浓度.
表 1摇 转化正交试验设计及试验结果
Table 1摇 Orthogonal array design arrangement and results
试验号
Test No.
因素
Factor
CaCl2浓度
CaCl2 concentration
(mmol·L-1)
热激时间
Heat shock time
(min)
复苏时间
Recovery time
(h)
转化率平均值
Average of transformation efficiency (伊102)
TS11 DNB JJ12
1 1(25) 1(1. 5) 1(0. 5) 20 0 1
2 1 2(3. 0) 2(1. 0) 7 1 4
3 1 3(4. 5) 3(1. 5) 15 2 5
4 1 4(6. 0) 4(2. 0) 14 5 1
5 2(50) 1 2 42 22 2
6 2 2 1 44 13 7
7 2 3 4 25 27 4
8 2 4 3 30 73 8
9 3(75) 1 3 4 42 188
10 3 2 4 2 26 176
11 3 3 1 4 9 220
12 3 4 2 9 25 124
13 4(100) 1 4 105 0 9
14 4 2 3 166 3 7
15 4 3 2 92 2 2
16 4 4 1 24 0 5
TS11:恶臭假单胞菌 P. putida TS11; DNB:施氏假单胞菌 P. stutzeri DNB; JJ12:门多萨假单胞菌 P. mendocina JJ12. 下同 The same below.
1973 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 峰等: 3 种假单胞菌 CaCl2法感受态细胞的制备及转化条件摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 转化试验结果极差分析
Table 2摇 Range analysis of transformation results
菌株
Strain
项目
Item
CaCl2浓度
CaCl2 concentration (mmol·L-1)
25 50 75 100
热激时间
Heat shock time (min)
1. 5 3 4. 5 6
复苏时间
Recovery time (h)
0. 5 1 1. 5 2
TS11 平均值 Mean 14. 00 35. 25 4. 75 96. 75 42. 75 54. 75 34. 00 19. 25 23. 00 37. 50 53. 75 36. 50
极差 Range 92. 00 35. 50 30. 75
DNB 平均值 Mean 2. 00 33. 75 25. 50 1. 25 16. 00 10. 75 10. 00 25. 75 5. 50 12. 50 30. 00 14. 50
极差 Range 32. 50 15. 75 24. 50
JJ12 平均值 Mean 2. 75 5. 25 177. 00 5. 75 50. 00 48. 50 57. 75 34. 50 58. 25 33. 00 52. 00 47. 50
极差 Range 174. 25 23. 25 25. 25
表 3摇 转化试验结果方差分析
Table 3摇 Analysis of variance of transformation results
菌株
Strain
因素
Factor
偏差平方和
Partial sum
of squares
自由度
Degree
of freedom
F F0. 95(3,6) F0. 99(3,6) 显著性
Significance
TS11 A 20561. 188 3 6. 895 4. 760 9. 780 *
B 2681. 188 3 0. 899 4. 760 9. 780
C 1900. 688 3 0. 637 4. 760 9. 780
误差 Error 5964. 38 6
DNB A 3273. 250 3 8. 107 4. 760 9. 780 *
B 632. 250 3 1. 566 4. 760 9. 780
C 1280. 750 3 3. 172 4. 760 9. 780
误差 Error 807. 50 6
JJ12 A 89203. 188 3 76. 442 4. 760 9. 780 **
B 1124. 688 3 0. 964 4. 760 9. 780
C 1383. 688 3 1. 186 4. 760 9. 780
误差 Error 2333. 88 6
A:CaCl2浓度 CaCl2 concentration; B:热激时间 Heat shock time; C:复苏时间 Recovery time. *P<0. 05; ** P<0. 01.
摇 摇 极差分析不能估计试验误差,因而无法分析试
验的精度,为了准确判断 3 个试验因素的影响是否
显著,进一步对正交试验结果做方差分析,并对各因
素进行显著性检验,结果(表 3)表明,CaCl2浓度显
著影响 P. putida TS11 和 P. stutzeri DNB 的转化效
率(F0. 01 >F>F0. 05),极显著影响 P. mendocina JJ12
的转化效率(F>F0. 01),说明 P. mendocina JJ12 感受
态细胞的制备对 CaCl2浓度的影响更为敏感;而热
激时间和复苏时间对转化效率的影响均为不显著.
2郾 4摇 最优转化条件组合验证
根据极差和方差分析,得到了3种假单胞菌的
表 4摇 3 种假单胞菌的最优条件组合及转化率
Table 4 摇 Optimal transformation conditions and transfor鄄
mation efficiencies of the three Pseudomonas species
菌株
Strain
CaCl2浓度
CaCl2 concentration
(mmol·L-1)
热激时间
Heat shock
time (min)
复苏时间
Recovery time
(h)
转化率
Transformation
efficiency (105·
滋g-1 DNA)
TS11 100 3 1. 5 1. 61依0. 19
DNB 50 6 1. 5 1. 01依0. 10
JJ12 75 4. 5 0. 5 2. 16依0. 28
最优转化条件组合,经 3 次重复试验验证,在各自的
最优转化条件下,3 种菌的转化效率均达到 105水
平,且具有很好的重现性.最优转化条件和转化结果
如表 4 所示.而不加质粒的阴性对照在抗性平板上
则无菌落生长.
3摇 讨摇 摇 论
外源 DNA的转化是原核生物中一个较为普遍
的现象,也是分子生物学、微生物基因工程和遗传学
等领域的一项基础技术. 转化的成功与否与受体菌
是否处于感受态有很大的关系. 处于对数生长期的
细菌,细胞壁结构致密性较差,比较容易形成感受
态.此外,大多数假单胞菌属的细菌都能够分泌胞外
多糖[30-31],起到保持细胞水分和阻挡外界有害物质
侵入的作用,利于假单胞菌适应多样的生存环境.而
这种保护作用可能阻碍 Ca2+与细胞膜的充分作用,
使 42 益热激在细胞表面难以形成微孔,影响转化效
率.目前有关胞外多糖对假单胞菌感受态细胞制备
的影响研究报道很少.不同种属的菌体,其分泌的胞
外多糖结构和松散程度不同.从本研究结果看,用无
297 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
菌蒸馏水 3 次重悬冲洗菌体,足以达到基本去除这
3 种假单胞菌的胞外多糖类物质以提高转化效率的
目的.扫描电镜结果也证实了多次洗涤的菌体细胞
表面结构发生改变,表面更为光滑,更有利于 Ca2+与
细胞表面充分作用,增强细胞膜的通透性,使 42 益
热激时细胞膜上更易出现微孔,利于外源 DNA导入
细胞内,进而提高感受态细胞形成率及转化效率.
本研究首次报道了施氏假单胞菌和门多萨假单
胞菌的 CaCl2转化条件,为这两种菌的遗传改造提
供了重要的方法学基础. 虽然本文仅针对本实验室
在石油污染土壤中筛选到的 3 种假单胞菌进行了
CaCl2质粒转化条件探索,有一些局限性,但是摸索
假单胞菌 CaCl2质粒转化条件,将为整个假单胞菌
属细菌的外源质粒转化提供一定的方法学基础.
CaCl2转化方法操作简便,转化率虽不是很高,但足
以满足一般克隆试验的需要,CaCl2质粒转化方法有
望成为外源基因导入假单胞菌的一种简便而有效的
技术方法.该方法的初步探索研究,对遗传改造假单
胞菌应用于生物转化、生物防治及环境修复等领域
具有重要意义.
4摇 结摇 摇 论
本文所选取的 3 个处理因素中,CaCl2浓度是影
响假单胞菌转化效率的最主要因素(P<0. 05). P.
putida TS11、P. stutzeri DNB和 P. mendocina JJ12 的
CaCl2转化优化条件分别为:100 mmol·L-1 CaCl2,
42 益热激 3 min,30 益复苏 1. 5 h;50 mmol·L-1
CaCl2,42 益 热激 6 min, 30 益 复苏 1郾 5 h; 75
mmol·L-1 CaCl2,42 益热激 4. 5 min,30 益复苏 0. 5
h.在上述最优转化条件下,3 种假单胞菌的外源质粒
转化效率均能达到 104 个转化子·滋g-1 DNA水平.
在 3 种假单胞菌的感受态细胞制备过程中,蒸
馏水预先多次洗涤菌体细胞,可改变细胞表面结构,
明显提高转化效率.
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作者简介摇 赵摇 峰,男,1988 年生,硕士研究生.主要从事采
油微生物菌种资源研究. E鄄mail: zhao2008569@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
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