全 文 ：盐碱胁迫下碱地肤 Na+/ H+逆向转运蛋白基因
KsNHX1 表达分析*
付寅生摇 崔继哲**摇 陈广东摇 刘摇 佳摇 弭晓菊摇 张海波
(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 150025)
摘摇 要 摇 利用 RACE 技术得到碱地肤 KsNHX1 的 3爷cDNA 序列. 分子系统进化分析显示,
KsNHX1 为液泡膜 Na+ / H+逆向转运蛋白编码基因.通过半定量 RT鄄PCR检测了该基因在盐碱
胁迫下的表达,结果表明: 200 mmol·L-1 NaCl胁迫 2 ~ 24 h,KsNHX1 在叶片中表达量持续增
加;200 mmol·L-1 NaCl 处理 10 h,KsNHX1 在根、茎、叶和花中的表达都上调;不同浓度 NaCl
处理下,叶片中 KsNHX1 表达上调,160 mmol·L-1时达到最高;低于 400 mmol·L-1浓度下,根
中该基因的表达也都上调.经不同浓度 Na2CO3胁迫,根中 KsNHX1 的表达变化趋势与相应浓
度 NaCl胁迫下的变化相同;但叶片中除 160 mmol·L-1 Na2CO3处理下 KsNHX1 表达略有上调
外,其他浓度下 KsNHX1 的表达都低于对照. KsNHX1 的表达模式暗示,在不同盐碱胁迫下,碱
地肤能够维持体内相对稳定的 K+ / Na+,其耐盐特性可能与 Na+ / H+逆向转运蛋白的作用密切
相关.
关键词摇 碱地肤摇 Na+ / H+逆向转运蛋白基因摇 耐盐碱性
文章编号摇 1001-9332(2012)06-1629-06摇 中图分类号摇 Q756, Q945. 78摇 文献标识码摇 A
Expression of Na+ / H+ antiporter gene KsNHX1 in Kochia sieversiana under saline鄄alkali
stress. FU Yin鄄sheng, CUI Ji鄄zhe, CHEN Guang鄄dong, LIU Jia, MI Xiao鄄ju, ZHANG Hai鄄bo
(College of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025, China) .
鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(6): 1629-1634.
Abstract: The 3爷cDNA fragment of KsNHX1 in Kochia sieversiana was obtained by RACE. The
phylogenetic analysis of antiporters from different plant species indicated that the KsNHX1 was a
gene encoding vacuolar Na+ / H+ antiporter. By using semi鄄quantitative RT鄄PCR, the expression
profiles of the KsNHX1 under different saline鄄alkali stresses were examined. It was observed that the
transcript of KsNHX1 in leaves under the stress of 200 mmol·L-1 for 2-24 h increased gradually
with increasing duration, and the expression of KsNHX1 in roots, stems, leaves, and flowers under
the stress of 200 mmol·L-1 for 10h was up鄄regulated. Under various NaCl concentrations, the ex鄄
pression of KsNHX1 in leaves was up鄄regulated, with the maximum under 160 mmol·L-1 of NaCl.
The expression of KsNHX1 in roots was also up鄄regulated under the stress of <400 mmol·L-1 . Un鄄
der various concentrations of Na2CO3, the expression of KsNHX1 in roots appeared the similar
change patterns with those under corresponding concentrations of NaCl, but the expression of
KsNHX1 in leaves was down鄄regulated except under 160 mmol·L-1 . The changes of the expression
patterns implied that KsNHX1 played roles in maintaining the homeostasis of K+ / Na+, which proba鄄
bly contributed to the saline鄄alkali tolerance of Kochia sieversiana.
Key words: Kochia sieversiana; Na+ / H+ antiporter gene; saline鄄alkali tolerance.
*黑龙江省教育厅科技研究项目(11551144)资助.
**通讯作者. E鄄mail: shiccc1@ yahoo. com. cn
2011鄄12鄄30 收稿,2012鄄03鄄06 接受.
摇 摇 土壤盐碱化日益严重,导致人类可利用土地逐
渐减少,已成为重要的生态问题之一[1-2] .中国内陆
地区的盐碱地盐化和碱化一般协同发生,盐化主要
受 NaCl、 Na2SO4 等中性盐的影响,碱化则受到
Na2CO3、NaHCO3 等碱性盐的作用.通常碱性盐对植
物影响大于中性盐[3-4],开展盐生植物抗盐碱生理
特性及其机制的研究具有重要意义[5-7] . 藜科植物
碱地肤(Kochia sieversiana)具有优良的耐盐碱性,繁
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 6 月摇 第 23 卷摇 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2012,23(6): 1629-1634
殖能力极强,常作为先锋植物侵入碱斑定居而形成
单优势的盐生植物群落,是一种高度抗碱的盐生植
物,是改良盐碱化牧草地的理想材料[8-10]和潜在的
植物抗盐碱基因资源[11] . 在盐碱胁迫条件下,碱地
肤茎叶中 Na+含量陡升. 非盐碱胁迫下,其 K+含量
较高,但一经盐碱处理,K+含量骤然降低,随着盐碱
度的增大,其 K+、Na+含量均上升.盐碱胁迫下,碱地
肤茎叶中 K+ / Na+基本保持不变;Na+、K+含量变化
主要受盐度的影响,受碱度的影响较小[8,12] .碱地肤
在不同盐碱胁迫下保持相对稳定的 K+ / Na+可能是
其强耐盐碱的一个重要生理机制.
土壤中过多的 Na+和高的 pH 值是盐碱地上植
物生长的主要限制因子,大量积累 Na+以降低细胞
的渗透势是大多数盐生植物的特点. 许多研究已证
明,进入细胞中的 Na+由液泡膜上的 Na+ / H+逆向转
运蛋白 NHX将其区隔化进入液泡,以避免 Na+对细
胞质产生毒害作用,是植物耐盐的一个重要策
略[13-18] .最近的研究显示,定位于液泡膜上的 NHX
蛋白具有将 K+区隔化到液泡中,避免细胞质中产生
毒害的 Na+ / K+,保持细胞中 Na+、K+稳态和调控 pH
的作用[19-20] .碱地肤的 Na+ / H+逆向转运蛋白基因
KsNHX1 在碱地肤的耐盐碱性中是否发挥作用? 碱
地肤响应盐碱胁迫时能够保持其细胞中 K+、Na+的
稳态是否也与其 KsNHX1 作用有关? 对此,本研究
从碱地肤中克隆获得 Na+ / H+逆向转运蛋白基因
(KsNHX1)3爷cDNA序列,分析了碱地肤和其他植物
中 NHX的系统关系,着重研究了盐碱胁迫下碱地肤
Na+ / H+逆向转运蛋白基因 KsNHX1 的表达模式,以
探讨 KsNHX1 与碱地肤耐盐碱特性之间的可能联
系,为在分子水平上揭示碱地肤耐盐碱机制,深入理
解 KsNHX1 基因在植物生长发育和适应逆境中的综
合作用奠定基础.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料及处理
碱地肤(Kochia sieversiana)种子采自黑龙江省
五里木草场.种子播种在蛭石 颐 草炭(3 颐 1)的混合
介质中,置于培养室中 24 益、16 h·d-1光照条件下
培养.将 4 周龄苗用 200 mmol·L-1 NaCl 溶液处理
10 h,取其叶片液氮速冻后-80 益保存,用于提取
RNA以分离 KsNHX1 基因. 室内播种碱地肤于花盆
蛭石中,2 周后置于室外培养,盛花期的植株按表型
一致度分成 4 组分别进行如下处理: 1 ) 用 200
mmol·L-1 NaCl 处理 2、6、10、16、24 h 后,分别取其
叶片; 2 )、 3 ) 分别用 80、 160、 240、 320 和 400
mmol·L-1的 NaCl或 Na2CO3处理植株 10 h,取其叶
和根;4)用 200 mmol·L-1 NaCl处理植株 10 h,分别
取根、茎、叶和花器官. 各处理都以不经胁迫的相同
时期表型一致的植株为对照同时取样. 样品迅速用
液氮速冻后置于-80 益冰箱中保存,用于提取 RNA
并进行半定量 RT鄄PCR检测 NHX1 的表达.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 NHX1 基因保守序列的克隆及 3爷RACE摇 SDS
法[21]提取总 RNA,分别用紫外分光光度计、琼脂糖
凝胶电泳检测 RNA 的含量、质量及完整性. 以 Olig
(dT)为引物,用 ReverTra Ace鄄琢鄄cDNA 合成试剂盒
(东洋纺公司)合成 cDNA.以 2 滋L cDNA为模板,用
兼并引物 NHX1F、NHX1R 扩增 NHX1 保守序列.
PCR总反应体积为 20 滋L,PCR 反应程序:94 益预
变性 4 min,94 益变性 30 s,57 益退火 30 s,72 益延
伸 1 min,35 个循环,72 益终延伸 10 min. 植物总
RNA用 PrimeScript Reverse Transcriptase(大连宝生
物公司)、以 3爷CDS 为引物反转录合成 cDNA. 以 1
滋L cDNA为模板,用通用引物 UPM 和据克隆的保
守序列设计的引物 JDF3鄄1 进行 3爷RACE. PCR 总反
应体积为 20 滋L,PCR程序为 94 益预变性 4 min,94
益变性 30 s,66 益退火 30 s,72 益延伸 2 min,35 个
循环,72 益 终延伸 10 min. 上述 PCR 产物通过
UNIQ鄄10 柱式 DNA胶回收试剂盒(上海生物工程公
司)进行回收纯化后连接至 pMD18鄄T 载体(大连宝
生物公司),转化感受态大肠杆菌 JM109(北京博大
泰克生物公司),蓝白斑筛选阳性克隆,经菌落 PCR
鉴定后,送交上海生工测序.
1郾 2郾 2 KsNHX1 表达的半定量 RT鄄PCR 检测 SDS 法
提取各胁迫处理样品的总 RNA,用 ReverTra Ace鄄琢鄄
cDNA 合成试剂盒(东洋纺公司)合成 cDNA,取 2
滋L cDNA为模板进行 PCR,总反应体积 20 滋L. 以
18SrRNA作为内参基因,PCR 引物为 S1:5爷鄄AGTAT鄄
GGTCGCAAGGCTGAA鄄3 爷, S2: 5爷鄄 CATTCAATCGG鄄
TAGGAGCGA鄄3爷,预期扩增的片段大小为 549 bp.
KsNHX1 基因的扩增引物为 NHXa 和 NHXb,预期扩
增片段大小是 434 bp. PCR 反应程序为:94 益预变
性 4 min,94 益变性 30 s,52 益退火 30 s,72 益延伸
1 min.经优化后确定 18SrRNA和 KsNHX1 的 PCR的
循环数分别为 28 和 32. PCR产物用 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测.
1郾 3摇 数据处理
将克隆后测序得到的 NHX1 保守区序列和
0361 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
3爷RACE序列用 DNAMAN 软件进行拼接. 用 NCBI
(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov / )的 Blastn 程序进
行序列比对,并寻找出所获序列的编码区. 用 DNA鄄
MAN6. 0. 3. 99 软件分析 DNA 序列,翻译出相应蛋
白质的氨基酸序列,用 MEGA 4. 0 软件构建 NHX1
的系统进化树.
半定量 RT鄄PCR的电泳结果用 BandScan 5. 0 软
件进行灰度值分析,所得数据通过内参基因 18SrRNA
标准化,以未经胁迫处理的 KsNHX1 表达量为 100%,
表示不同条件下 KsNHX1的相对表达量.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 碱地肤 Na+ / H+逆向转运蛋白基因 NHX1 克隆
及特性
2郾 1郾 1 碱地肤 NHX1 基因保守区及 3爷 cDNA 序列克
隆结果摇 将经反转录合成的 cDNA 用植物 Na+ / H+
逆向转运蛋白基因的兼并引物进行 PCR扩增,得到
约 300 bp片段的 NHX1 基因保守区(图略),测序该
片段为 288 bp(图 1). 依据保守区序列设计碱地肤
3爷 RACE 的特异引物 JDF3鄄1, RT鄄PCR 产物约为
1800 bp,经测序得到一段长 1757 bp 的序列. 将
NHX1 基因保守序列与 3爷RACE 序列用 DNAman 软
件进行序列拼接,得到一段 1827 bp 的序列(图 1),
将其命名为 KsNHX1. Blast 比较分析显示其编码区
长度为 1410 bp,翻译产物应为一段含 469 个氨基酸
的多肽;3爷非翻译区含有 391 bp 的核苷酸,另加上
26 个 ploy(A) .
2郾 1郾 2 碱地肤 NHX1 的系统进化分析 摇 在 Genbank
蛋白 质 数 据 库 中 选 取 拟 南 芥 AtNHX1 ( NP _
198067郾 1 )、 AtNHX5 ( AAM08406郾 1 )、 AtNHX6
(AAM08407郾 1 )、 AtNHX7 ( AEC05529郾 1 )、 AtNHX8
(AEE29199郾 1)、玉米 ZmNHX1(AAP20428郾 1)、水稻
OsSOS1 (AAW33875郾 1)、OsNHX2(BAJ06109郾 1)、大豆
GmNHX1(AAY43006郾 1)、盐芥 ThNHX1 (BAJ33874郾 1)、
冰叶日中花 McNHX1 (CAN99589郾 1)、无翅猪毛菜
SkNHX1(BAJ06110郾 1)、海松菜 SjNHX1(BAE95195郾 1)、
角 碱 蓬 ScNHX1 ( ABF68604郾 1 )、 碱 蓬 SsNHX1
(ABU49649郾 1) 、盐角草SeNHX1(AAN08157郾 1) 、
海蓬子 SbNHX1 ( ACA33931郾 1 )、盐爪爪 KfNHX1
(AAV73803郾 1)、盐穗木 HcNHX1(ADK62565郾 1)、灰
绿藜 CgNHX1 ( AAQ72785郾 1 )、北滨藜 AgNHX1
(BAB11940郾 1)、犁苞滨藜 AdNHX1(AAO48271郾 1)
等植物的 NHX1 氨基酸序列与由本试验获得的
碱地肤NHX1序列推出的肽段序列进行比对,用
1 CCACCTATAA TATTCAATGC GGGGTTTCAG GTGAAAAAGA AGCAGTTCTT
51 TCGCAACTTC ATTACTATTA TAATGTTTGG AGCCGTTGGC ACATTGGTTT摇
101 CATTTTCCAT CATATCCGCA GGAGCTATGG CTATTTTTAA GAAGATGGAT摇
151 ATTGGCTCTC TGGAATTAGG AGACTATCTT GCAATTGGTG CAATATTCGC摇
201 TGCAACCGAT TCTGTTTGCA CTTTGCAGGT GCTTAATCAA GATGAGACTC摇
251 CTCTGCTCTA CAGTCTGGTC TTTGGTGAAG GTGTTGTT AA TGACGCTACA
301 TCGGTGGTGC TTTTCAATGC AATTCAGAAC TTCGATCTTA CACACATTGA
351 TCACAGAATA GCTTTACAGT TTAGTGGCAA CTTTTTATAC TTATTTTTTG
401 CAAGCACTTT GCTCGGAGCA ATGACTGGTT TGCTCATTGC TTATGTTATC
451 AACAACCTGC ATTTTGAAAG GCATTCAACT GATCGTGAGG TTGCTTTAAT
501 GATGCTCATG GCCTATCTAT CTTACATGCT TGCTGAACTC TTCTATTTGA
551 GTGGAATTCT TACAGTATTC TTCTGTGAAA TTGTCATGTC CCATTATACG
601 TGGCACAATG TGACTGAGAG CTCAAGAGTA ACCACCAAGC ATGCTTTTGC
651 AACACTGTCT TTCGTTGCAG AAATTTTCCT CTTTCTATAT GTTGGTATGG
701 ATGCATTGCA CATTGAGAAG TGGAGATCTG TGAGTGATAG TCCTGTAATC
751 TCTGTTGCTG TGAGCTCCAT ATTGATTGGT CTACTCATGG TTGGACGAGC
801 AGCTTTTGTT TTCCCATTAT CCTTGCTATG GAACTTGTCC AAGACATCTC
851 ATAGTCAGAA GATCACCTTT ACCGAGCAGA TAGTCATATG GTGGTCCGGT
901 CTCATGAGAG GTGCTTTCTC CATGGCACTT GCATATCATC AGTTTACAAG
951 GTCAGGGCGC ACACAGCTGA GGGGATACGC CATTATGATC ACAAGCACCA
1001 TATCTGTTGT CATCTCTAGT ACGATGTTCT TTGGGATGCT CACAGAGCCG
1051 ACTATATGGT ATTTTAAGCC CCAACAAAAA CACTTTGCCA GTGCCAGCAC
1101 TGTGTCAGAT TTGGGGAGTC CAAAAGGATT CTTTTTGCCT CTTCTTGAAG
1151 GTGTACAAGA TCCTGAAGTA GACATGGACA CCCATGTCGT AGGAACCAGC
1201 AATTATGAGG AAGACACCAA CCGCCGGCTT ATAGCTCGAC CCAGTAGCTT
1251 TCGCATGTTT CTAAATGCAC CAACTCACAC TGTCCACCAT TACTGGCGCA
1301 AATTTGATGA TTCATTTATG CGGCCTGTAT TGGGCGGACG GGGTTTGGTA
1351 CCTTATGTCC CGGGCTCACC TACAGAGCAG AGCAACCAGA ATTTGATTGA
1401 GAGAACTTAG GAGAGAATAG AGCCTGTTGG TACAATTAAT ATTAACTTAC
1451 AGGTGGTCTG CCCTTACGTA AGAACTTTCT GGCATTTGGT CTTGTGAGTG
1501 TTCTGTTGAT AGATAGATAG TTATAATTAC GCCACCGATG AAATTACCAA
1551 TGCCCTTTTA ACAGTATTGC AAACGATGTT TTCTTTAATC GGGCTTTAGC
1601 TAGAATATTA TAGCATGTTT TGTAGTTCCG GCTATCATTT AGGATTATGC
1651 GGCCCGGAGC CATCTCTTTG AATCAGAAGT TTAAAGTTCT TTGTTGCATA
1701 GAATAAACCG TGACTTGAAC AGTTGCTGAA GGGCAAAGAA AAACCTAAAT
1751 AGTGGTTTAG ATTTTATGTT GTTCATTTGT CAAGGGCATT CGAACGTTTT
1801 CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA
图 1摇 碱地肤 KsNHX1 基因 3爷cDNA序列
Fig. 1摇 3爷cDNA sequence of KsNHX1.
阴影部分与下划线部分分别表示保守区片段和 3爷非翻译区 The
fragment of conserved domain was highlighted in black, and the 3爷鄄UTR
was underlined.
MEGA4郾 0 软件构建 NHX1 的系统进化树(图 2).结
果显示,碱地肤 NHX1 与 NHE / NHX 亚家族中液泡
型 Na+ / H+逆向转运蛋白(玉类蛋白)同属一类,尤
其与同为藜科的盐爪爪 KfNHX1、无翅猪毛菜 SkN鄄
HX1、碱蓬 SsNHX1、盐穗木 HcNHX1 等植物的
NHX1 同源关系最近;与该亚家族定位于内膜囊泡
上的 Na+ / H+逆向转运蛋白(域类蛋白)相比同源关
系稍远;而与 NhaP / SOS1 亚家族中质膜型 Na+ / H+
逆向转运蛋白(NhaP / SOS1)同源关系最远,分属不
同类别.上述系统学的分析显示 Na+ / H+逆向转运蛋
白具有高度的保守性,本研究克隆的碱地肤 Na+ / H+
逆向转运蛋白基因 KsNHX1 编码液泡膜 Na+ / H+逆
向转运蛋白.
13616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 付寅生等: 盐碱胁迫下碱地肤 Na+ / H+逆向转运蛋白基因 KsNHX1 表达分析摇 摇 摇 摇
图 2摇 植物 Na+ / H+逆向转运蛋白氨基酸序列的分子进化树
分析
Fig. 2摇 Molecular phylogenic analysis of putative Na+ / H+ anti鄄
porter proteins in plants.
Ch: 藜科 Chenopodiaceae.
2郾 2摇 盐碱胁迫下碱地肤 NHX1 基因的表达分析
分别提取碱地肤不同处理材料、不同器官的总
RNA,以 18SrRNA为内参,用半定量 RT鄄PCR方法检
测了在盐碱胁迫条件下 KsNHX1 基因在 mRNA水平
上的表达变化.
经 200 mmol·L-1 NaCl 胁迫 2、6、10、16 和 24
h,随着盐胁迫时间的延长,碱地肤 NHX1 基因在叶
片中表达量持续增加,胁迫 6 h 时表达量与未胁迫
时相比增加了 3 倍;10 h 后上调幅度减缓(图 3A).
为明确碱地肤 NHX1 基因在不同器官中的表达,进
一步检测了未胁迫和 200 mmol·L-1 NaCl胁迫 10 h
时碱地肤根、茎、叶和花中 KsNHX1 的表达水平. 结
果显示,正常生长条件下 KsNHX1 基因在碱地肤根、
茎、叶和花中均有表达,以叶片和花中表达量为高;
胁迫后 KsNHX1 在各器官的表达都被上调,但各器
官中该基因的上调幅度差别不大(图 3B).
经 80、160、240、320 和 400 mmol·L-1 NaCl 处
理 10 h,与对照相比,不同浓度条件下 KsNHX1 基因
在碱地肤叶片中都上调表达,160 mmol·L-1时达到
最高(图 3C);在根中,低于 400 mmol·L-1浓度下,
KsNHX1基因的表达也都上调;当NaCl胁迫浓度达
图 3摇 不同盐碱胁迫条件下碱地肤中 KsNHX1 的表达
Fig. 3摇 KsNHX1 expression in Kochia sieversiana under NaCl and Na2CO3 treatment
各电泳图泳道下的数值为 KsNHX1 的相对表达量,通过 18SrRNA标准化后,以未经胁迫处理的 KsNHX1 表达量为 100%表示 Relative mRNA lev鄄
els were shown below as percentage of control levels, normalized using 18SRNA. M: DNA 分子量标准(DL2000) DNA marker (DL2000). A: 200
mmol·L-1 NaCl处理不同时间碱地肤叶中 NHX1 的表达 KsNHX1 expression in leaves at different times under 200 mmol·L-1 NaCl treatment. 1 ~ 6:
处理时间分别为 0、2、6、10、16 和 24 h The time of NaCl treatment by 0, 2, 6, 10, 16, and 24 hours; B: 200 mmol·L-1 NaCl处理碱地肤 10 h,
NHX1 在根、茎、叶和花中的表达 Relative transcript abundance of KsNHX1 gene in roots, stems, leaves, and flower tissues after 10 hours of 200
mmol·L-1 NaCl treatment. 1 ~ 4:未经胁迫处理时 KsNHX1 在根、茎、叶和花中的表达 KsNHX1 expression in roots, stems, leaves, and flowers of
Kochia sieversiana before NaCl treatment; 5 ~ 8: 200 mmol·L-1 NaCl处理下 KsNHX1 在根、茎、叶和花中的表达 KsNHX1 expression in roots, stems,
leaves, and flowers after 200 mmol·L-1 NaCl treatment. C和 D: 不同浓度 NaCl处理碱地肤 10 h,NHX1 在叶(C)和根(D)中的表达 Expression of
KsNHX1 in leaves(C) and roots(D) after 10 hours of different concentrations NaCl stress. 1 ~ 6:NaCl浓度 0、80、160、240、320 和 400 mmol·L-1 Con鄄
centration of NaCl treatments of 0, 80, 160, 240, 320, 400 mmol·L-1 . E和 F:不同浓度 Na2CO3胁迫碱地肤 10 h,叶(E)、根(F)中 NHX1 的表达
Expression of KsNHX1 in leaves(E) and roots(F) after 10 hours of different concentrations Na2CO3 stress. 1 ~ 6:Na2CO3浓度 0、80、160、240、320 和
400 mmol·L-1 Concentration of Na2CO3 treatment of 0, 80, 160, 240, 320, 400 mmol·L-1 .
2361 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
到 400 mmol·L-1,KsNHX1 表达量低于对照 (图
3D).
在不同浓度 Na2CO3胁迫下,KsNHX1 在碱地肤
根中的表达变化趋势(图 3 F)与相应浓度 NaCl 胁
迫时的变化(图 3 D)相同,即低于 400 mmol·L-1浓
度下, KsNHX1 基因的表达都上调;然而叶片中
KsNHX1 的表达(图 3 E)明显不同于 NaCl胁迫下的
情况,除 160 mmol·L-1浓度下 KsNHX1 表达略有上
调外,其他浓度 Na2CO3胁迫下 KsNHX1 的表达都低
于对照.
3摇 讨摇 摇 论
碱地肤为高度抗碱的盐生植物[8],其耐盐碱生
理特性与其他一些盐生植物有所不同[12] .在盐碱胁
迫下,其大量积累以 Na+、K+为主的无机离子;正常
条件下,体内 K+含量高于其他无机阳离子;而在盐
碱处理后,K+含量先降低后升高,环境中的 Na+不会
抑制 K+的吸收,Na+、K+含量均随着盐度增强而表现
出一定的上升趋势,并且细胞内 Na+、K+对正电荷的
贡献率始终是 2 颐 1,K+ / Na+基本保持不变 (约
0郾 49) [12] .导致碱地肤表现出这种耐盐碱生理特性
的分子机制值得探究.在分子水平上,植物抵御盐碱
胁迫有多种可能的机制[22] . 深入研究发现,液泡膜
Na+ / H+逆向转运蛋白基因 NHX 的表达模式因植物
类型和物种差异而有所不同[23-24],但其产物液泡膜
Na+ / H+逆向转运蛋白 NHX 普遍具有调节细胞内
pH值、能够将胞液中的 Na+或 K+区隔化到液泡中
及维持细胞内离子稳态等多种功能,在植物抗逆胁
迫中有重要作用[20] . 由此推测,盐碱胁迫下碱地肤
保持其体内 K+ / Na+稳态可能与 KsNHX1 的作用密
切相关.本文通过对盐碱胁迫下碱地肤 Na+ / H+逆向
转运蛋白基因 KsNHX1 表达模式的分析显示了这一
点.
本研究发现,正常生长条件下 KsNHX1 基因在
不同的组织器官中都有表达,这与该基因具有维持
细胞膨压、调节细胞生长等[25]正常的生理作用一
致.在与文献[12]相同浓度(0、80、160、240、320 和
400 mmol·L-1)的 NaCl 处理下,KsNHX1 基因在碱
地肤叶片中都上调表达,在根中除 400 mmol·L-1浓
度外,也都表现出上调. 这种表达特性与其蛋白
NHX1 在渗透胁迫和离子胁迫环境下的功能也是一
致的.因为盐渍条件是一个高 Na+低 K+的环境,Na+
会大量进入植物体内,植物受到盐或渗透胁迫时上
调表达 NHX1,可有更多 NHX1 产物的形成,由此增
强了将胞质中 Na+特别是 K+区隔化到液泡中的能
力[26-27] .此时产生了胞质中 K+含量降低的信号,激
活质膜上高亲和 K+转运体[27],活性增强的高亲和
K+转运体可以特异性的从低 K+环境中摄取更多的
K+到胞质中[19,27],因此维持了胞质中稳定的 K+ /
Na+ . 可见碱地肤中的 NHX1 可能也具有强的对
Na+、K+等无机离子吸收、分配和调节的能力.
植物在低盐度渗透胁迫下可以通过高亲和 K+
转运体维持渗透平衡[27] .在 200 mmol·L-1 NaCl 处
理时间小于 24 h 时,碱地肤可能一直处于渗透胁
迫[28],导致碱地肤 NHX1 基因的转录物保持持续增
加状态.而在高盐度胁迫下,除了渗透胁迫外还造成
了离子毒害,导致 KsNHX1 转录物大量减少.推测碱
地肤 NHX1 基因转录物的持续增加状态,可能是低
浓度盐碱胁迫促进碱地肤植株生长[8,29] 的原因
之一.
在盐碱胁迫下,碱地肤器官中的 pH 没有明显
变化,中性盐胁迫条件下器官 pH为 6. 56,碱性盐胁
迫条件下器官 pH为 6. 62[12] .本研究中,盐、碱胁迫
下 KsNHX1 基因在根中表达的相似性可能与其 pH
的稳态有关.然而,不同浓度 Na2CO3胁迫下,碱地肤
叶中 KsNHX1 表达却普遍下调,推测环境中高 pH对
不同器官中有关基因的影响不同. NHX1 具有调节
pH保持植物体内 pH 稳态的作用[20],但碱地肤
KsNHX1 如何调控盐碱胁迫下 pH,有待进一步
分析.
综上所述,在盐碱胁迫下,碱地肤的生理应答比
较独特,在渗透调节中 Na+对 K+的吸收没有拮抗作
用[12],其分子机制可能与 KsNHX1 基因的表达及其
作用有关:盐碱胁迫下,KsNHX1 通过区隔化胞质中
K+,激活了质膜上高亲和 K+转运体,从而摄取更多
的 K+到胞质中,以维持胞质中 K+ / Na+的稳态.这可
能是碱地肤具有较强耐盐碱性的重要原因. 阐明碱
地肤耐盐碱的机制也将为其进一步开发利用提供理
论依据,有必要对此开展深入研究.
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作者简介摇 付寅生,男,1986 年生,硕士研究生.主要从事植
物抗逆分子生物学与基因工程研究. E鄄mail: kinglikefys@
126. com
责任编辑摇 肖摇 红
4361 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷