全 文 ：提取效果的影响次序为 A
压力为 26MPa ,时间为 1h ,萃取温度为 45℃, 其中
时间和压力对萃取量影响较大 。
表 1 正交试验方法与结果
试验号 流量(kg/h)
A
压力(MPa)
B
时间(h)
C
温度(℃)
D
萃取量(g)
1 1(10) 1(16) 1(1) 1(45) 173.00
2 1(10) 2(21) 2(2) 2(55) 178.00
3 1(10) 3(26) 3(3) 3(65) 151.00
4 2(16) 1(16) 2(2) 3(65) 149.00
5 2(16) 2(21) 3(3) 1(45) 168.00
6 2(16) 3(26) 1(1) 2(55) 187.00
7 3(21) 1(16) 3(3) 2(55) 144.00
8 3(21) 2(21) 1(1) 3(65) 173.00
9 3(21) 3(26) 2(2) 1(45) 193.00
K 1 502.00 466.00 533.00 534.00
K 2 504.00 519.00 520.00 509.00
K 3 510.00 531.00 463.00 473.00
R 2.667 21.667 23.334 20.333
1.4 GC-MS 分析 按 CO2 流量 21Kg/h ,压力为
26MPa ,时间为 1h ,温度为 45℃的最佳萃取条件萃
取药材混合物 ,得萃取物 ,再按上述条件对该萃取物
进行 GC-MS 分离与鉴定 ,根据总离子流图 ,经计算
机检索及人工解析质谱及与标准谱图校对 ,最后用
面积归一化法测出各成分的相对含量 。
2 结果
鉴定出 20种成分 。所得萃取物的化学成分及
其相对含量见表 2。
表 2 超临界萃取物成分组成
序号 化合物 相对含量(%) 序号 化合物 相对含量(%)
1 1 , 8-桉叶素 0.1 11 β-没药烯 0.45
2 1-辛醇 0.25 12 β-倍半水芹烯 2.18
3 胡荽油 0.21 13 莪术酮 1.52
4 乙酸乙酯 1.82 14 正丁烯基苯酞 0.62
5 δ-榄香烯 0.82 15 正丁烯基苯酞 0.74
6 烯 0.21 16 芳姜黄酮 2.1
7 β-榄香烯 0.22 17 姜黄酮 5.71
8 顺式-石竹烯 0.45 18 正丁基-4 , 5-苯酞 3.41
9 姜黄烯 0.95 19 藁本内酯 4.91
10 姜烯 3.06 20 油酸+亚油酸 5.07
(2004-05-08收稿)
·药理·
异叶蛇葡萄和蛇葡萄提取物抑制黄嘌呤
氧化酶和脂质氧化酶的活性研究
陈科力1 叶丛进1 Geoff W.Plumb2 鲍永平2
(1.湖北中医学院药学系 ,武汉 430061;2.英国食品研究所 ,Norw ich NR4 7UA , UK)
摘要 蛇葡萄和异叶葡萄是湖北地区应用的具有抗病毒作用的药用植物 , 它们的抗氧化活性用酶的和非酶的
体外抗氧化测定方法进行研究。实验结果显示 ,两种植物的提取物具有抑制黄嘌呤氧化酶和脂质氧化酶的活性;
用 T rolox 等价抗氧化能力(TEAC)方法测定 ,显示两种提取物是 ABTS·+自由基离子的清除剂 , 与葡萄种子提取物
相比较 ,显示具有较强的抗氧化能力。
关键词 蛇葡萄 异叶蛇葡萄 黄嘌呤氧化酶 脂质氧化酶 抗氧化能力
蛇葡萄根是葡萄科蛇葡萄 Ampelopsis sinica
W.T.Wang的根 ,为我国民间中草药 ,具有清热解
毒和活血化瘀的作用 ,主要用于治疗慢性骨髓炎等
外伤科疾病〔1〕 。据研究 ,蛇葡萄根还具有抗疱疹病
毒和乙肝病毒的作用 ,并应用于临床〔2 ～ 4〕 。根据我
们早期的调查研究 ,异叶蛇葡萄 Ampelopsis humil-
i folia var.heterophy lla(Thunb)K.Koch是湖北麻
城地区作为蛇葡萄根药用的资源植物之一〔1〕 ,其根
的形态组织〔5〕 和化学成分与蛇葡萄根非常类
似〔6、7〕 ,单纯凭性状特征 ,难以把两种植物的根区别
开 。蛇葡萄为多年生木质藤本 ,生长年限较长 。在
笔者最近几年的实地调查中 ,发现湖北麻城地区蛇
葡萄的资源破坏很大 ,连片的植株已很难发现;目前
分布较广 ,现有蕴藏量较大并实际上在提供蛇葡萄
根药用的是异叶蛇葡萄的一个植株较大型的居群 ,
其单株总根可达 100 kg 以上 。这一居群在原来的
调查中曾被报道〔1〕。根据亲缘关系相近植物活性
成分和功效类似的原则 ,异叶蛇葡萄根极有可能具
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2004.09.013
有蛇葡萄根类似的抗病毒作用。目前 ,国内外对于
蛇葡萄及其变种已经进行了较多的研究 ,而异叶蛇
葡萄根报道甚少 。我们将深入研究异叶蛇葡萄根抗
病毒的相关作用和机理 ,同时 ,为探讨减少木本药用
植物根的挖掘 、充分利用资源的途径 ,也研究蛇葡萄
茎叶抗病毒应用的可能性 。
抗病毒的中草药除了具有一定程度的直接的抑
制病毒活性的作用外 ,还可能具有增强机体免疫功
能 ,减少炎症 、促进组织修复的作用 。自由基在组织
破坏和病理变化过程中起着重要的作用〔8〕 ,因此 、
抗氧化 、抗自由基作用是减少炎症 、促进组织修复的
一个重要原因。蛇葡萄和异叶蛇葡萄均报道具有体
内抗氧化和减少组织损伤的作用〔9、10〕 ,本文将深入
研究其抗氧化作用的机理和强度。抗氧化作用的机
理涉及到酶的和非酶的过程〔11〕 。酶的过程涉及到
体内几种重要的氧化酶 ,如黄嘌呤氧化酶(xanthine
oxidase)和脂质氧化酶(lipoxygenases)等 。非酶的过
程即体内直接清除自由基的过程。本文将重点研究
异叶蛇葡萄根和蛇葡萄茎叶提取物对黄嘌呤氧化
酶 、脂质氧化酶活性的影响和直接清除自由基的能
力。
1 材料和方法
1.1 植物材料和提取 异叶蛇葡萄 Ampelopsis
hum ili folia var.Heterophyl la(Thunb)K.Koch.的
根 ,2000年 9月采于湖北麻城。蛇葡萄 Ampelopsis
sinica W.T.Wang 茎叶 , 2002 年 7 月采用湖北麻
城。原植物经笔者鉴定 ,标本留存于湖北中医学院
标本室。
植物材料干燥后粉碎成细粉 ,称取 50.0 g ,用
70%乙醇 500 ml室温(20℃)浸渍 24 h ,过滤 ,滤渣
再用少量 70%乙醇洗两次 ,合并洗液和滤液 ,用旋
转薄膜蒸发仪回收溶剂 ,残渣于 60 ～ 70℃减压干
燥 ,备用。
1.2 仪器和试剂 贝克曼 DU 640分光光度计 ,带
有动力学/时间软件 。
黄嘌呤氧化酶(提自奶油),脂质氧化酶(提自大
豆)和其他生物试剂均购自 Sigma 公司(Dorset ,
UK);化学试剂均为分析纯;水用 Millex Q-plus 系
统纯化(Millipore , Watford , UK)。
1.3 黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制试验
1.3.1 底物溶液:分别取 7.6 、5.7 、3.8 mg 黄嘌呤
溶解在 500 ml水中 ,得到 0.1 、0.075 、0.05 mM 的
底物溶液 ,该溶液室温保存 ,可持续使用一周 。
1.3.2 XOD 活力测定:XOD 的活力按照 Cos
等〔12〕描述的方法在 290 nm 处用分光光度法测定 。
每隔20 sec在 290 nm 处记录吸光度增长的数值 ,共
计 5 min。根据不同时间吸光度增长的数值得到一
条直线 ,计算直线的斜率。斜率越大 ,说明酶的活力
越强。
1.3.3 样品测定:把植物提取物溶解在二甲亚砜
(DMSO)中 ,得到不同浓度的溶液 ,取适量加到石英
比色皿中(最终浓度<1%),重复上述操作 、记录吸
光度在 290 nm 处的变化 。
1.3.4 空白对照:重复上述操作 , 不加样品和
XOD ,但加与样品同样体积的 DMSO , 记录吸光度
的变化 ,作为空白对照 。
1.3.5 样品对 XOD的抑制:通过上述样品测定获
得直线的斜率减去空白 ,每个样品平行操作 3次 ,分
别计算直线的斜率 ,取斜率平均值计算样品的抑制
系数 ,样品的抑制系数为斜率的倒数 。
1.3.6 抑制动力学常数 Ki值的计算:使用 3个不
同浓度的底物(黄嘌呤)溶液 ,获得不同浓度样品溶
液对 XOD的抑制系数 ,用 Dixon绘图法计算 Ki值 。
1.3.7 阳性对照品:为了核对实验结果的可信性 ,
取槲皮素溶解在二甲亚砜中得到不同浓度的溶液 ,
重复上述实验 ,计算 Ki值 。
1.4 脂质氧化酶(LOX)抑制试验
1.4.1 LOX的活性:按照 Chen等〔13〕描述的方法
在 234 nm 处用分光光度法测定 。
1.4.2 底物储备液:用亚油酸(linoleic aacid)157.2
μl、吐温-20 157.2 μl 、去离子水 10 ml 、然后加 1 ml
1M NaOH使溶液澄清 ,最后加水到 50 ml。储备液
用 0.2 M 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释 4倍得到 2.5
mM 底物溶液 ,使用前充氧 2 min 。
1.4.3 LOX活力测定:测定时在一个 2 ml的石英
比色皿中加底物溶液 1.96 m l和适量水至量后的总
体积为 2 ml ,在 37℃孵化 2 min;然后加200 U LOX
使反应开始 ,每隔20 sec记录吸光度在 234 nm 处增
长的数值共计 5 min 。
1.4.4 样品测定:加入不同浓度样品(植物提取
物)的 DMSO 溶液(最终浓度<1%),重复上述操
作;不加样品和 LOX ,但加与样品同样体积的 DM-
SO ,重复上述操作 ,得到空白对照值。计算样品在
不同浓度底物中对 LOX的抑制系数 。
抑制动力学常数 K i值的计算:使用 3个不同浓
度的底物(亚油酸)溶液 ,获得不同浓度样品溶液对
LOX的抑制系数 ,用 Dixon绘图法计算 Ki值 。
1.5 Trolox 等价抗氧化能力(TEAC)测定
T rolo x等价抗氧化能力(TEAC)用 Salah等〔14〕描述
的方法测定。所测定的抗氧化能力 TEAC 值是样
·651·中药材第 27 卷第 9 期 2004 年 9 月
品在液相中清除 ABTS 的能力 。ABTS[ 2 ,2 -azino-
bis(3-ethy lbenzo thiazoline-6-sulfonic acid)diammoni-
um salt] 是可由高铁肌红蛋白(metmyoglobin)在
H2O2和三价铁盐存在下产生的自由基 ,呈绿色 ,能
在734 nm 处被测定 。样品清除 ABTS 的能力与
Trolox C(6-hydroxy-2 , 5 , 7 ,8-tet ramethy lchroman-2-
carboxy lic acid ,一种维生素 E 的水溶性类似物)相
比较 ,表示与样品溶液抗氧化能力等价的 Trolox 溶
液的毫摩尔浓度 ,即 TEAC 值。葡萄种子提取物有
较高的抗氧化能力〔15〕 ,用作阳性对照 。
1.5.1 试剂配制:PBS , 5 mM pH 7.4的磷酸盐缓
冲溶液;ABTS 5 mM 储备度液 , 27.43 mg 溶于 10
ml PBS;Trolox , 2.5 mM 储备液 , 156.41 mg 溶于
250 ml PBS , 不同浓度的 Trolo x 溶液(0.5 , 1.0 ,
1.5 , 2.0 mM)临用时用 PBS 配制;H2O2 1.0 mM 储
备液 ,取 30%H2O2 溶液 515 μl用 PBS 稀释至 10
ml ,产生一个 500 mM 的溶液 ,再取该溶液 108 μl用
PBS稀释至 50 ml ,产生 1.0 mM 的溶液 ,临用配制;
高铁肌红蛋白 70 μM 储备液 ,高铁肌红蛋白需要用
色谱柱纯化以除去杂质。高铁肌红蛋白 75.2 mg 溶
于 10 ml PBS 形成 400μM 的溶液 ,再加 10 ml铁氰
化钾溶液(740 μM),混合 60 min以上 ,加到一个用
PBS 平衡的 、35 ×2.5 cm 的 Sephadex G15-120 柱
上 ,用 PBS洗脱 ,收集第一个流分 ,用 Witburn 公式
计算其浓度和纯度 ,纯度应大于 90%,用 PBS 稀释
至所需浓度 ,冷冻储藏备用。
1.5.2 样品测定:实验开始前各种试剂和比色池
在 30℃预热 30 min ,高铁肌红蛋白(Metmb)自始至
终保持在室温。在 1 ml比色皿中加 934 μl PBS , 30
μl ABTS ,36 μl MetMb 混合 10 secs ,放在分光光度
计中作为空白 。再取 1 ml 比色皿 , 加 850.6 μl
PBS ,30 μl ABTS ,36 μl M etMb和 8.4 μl样品溶液 ,
缓缓混合 20 secs ,记录吸收度值作为背景。取出该
比色皿 ,加 75μl H2O2 ,同时开始计时 ,振动混合新的
溶液 20 secs ,然后放回分光光度计 ,在精确的 6 min
后在 734 nm处记录吸收值 。每个样品平行操作 3
次。
1.5.3 标准曲线的制作:以不同 Trolox 溶液作为
样品 ,重复上述操作 ,每个样品平行操作 3 次 ,取平
均值制作 Trolo x的浓度-吸收度标准曲线 。
2 实验结果
2.1 XOD和 LOX的抑制实验 表 1给出了异叶
蛇葡萄根和蛇葡萄茎叶提取物对XOD和 LOX的抑
制效果 。阳性对照品槲皮素对 XOD的动力学抑制
常数 K i是 0.25 μM ,与文献[ 16]报道的值 0.2μM 相
近 。由动力学常数 K i值判断 ,两种提取物对 XOD
和 LOX抑制效果明显 ,并呈剂量相关性。
表 1 植物提取物对 XOD 和 LOX的抑制效果
样品来源 K i f or XOD K i f or LOX
异叶蛇葡萄 11.5μg/ml(38.0μM ＊) 2.3μg/ml(7.7μM ＊)
蛇葡萄 8μg/ml(26.7μM ＊) 5μg/ml(16.7μM ＊)
槲皮素 0.25μM
＊假定平均分子量是 300
2.2 TEAC 测定 Trolox(0 ～ 2.5 mM)TEAC 浓
度-吸收度标准曲线如下图 ,两种提取物的 TEAC值
见表 2。异叶蛇葡萄根提取物(10 mg/ml)的 TEAC
值是 52.9 ,高于葡萄种子提取物(10 mg/ml)的值
48;蛇葡萄茎叶提取物(10 mg/ml)的 TEAC 值是
46.9 ,与葡萄种子提取物(10 mg/ml)的值 48接近 ,
说明两种提取物有较强的抗氧化能力 。
图 T rolox 浓度-吸收度标准曲线(每个
点是三个独立实验的 x±s)
表 2 植物提取物(10mg/ml)的 TEAC值 x±s)
样品 TEAC 值
1mM Trolox 1.00±0.05
异叶蛇葡萄根提取物(10 mg/ml) 52.90±1.71
蛇葡萄茎叶提取物(10 mg/ml) 46.89±1.00
葡萄种子提取物(10 mg/ml) 48.05±1.51
3 讨论
实验显示两种蛇葡萄提取物都有较强高的
TEAC值 ,并有明显的抑制黄嘌呤氧化酶和脂质氧
化酶的能力 ,其中 ,异叶蛇葡萄根提取物对脂质氧化
酶的抑制作用较强 ,蛇葡萄茎叶提取物对黄嘌呤氧
化酶的抑制作用较强。提取物抑制 XOD的 K i值与
化学单体槲皮素的 Ki 值比较 ,虽然较小 ,但由于是
混合物 ,具有多重作用 ,仍然具有实际意义和应用价
值 。
黄嘌呤氧化酶(XOD)催化黄嘌呤和次黄嘌呤
的氧化生成尿酸并产生过氧化物自由基 ,尿酸引起
痛风 ,自由基涉及到炎症 、硬化 、癌症和衰老等病理
过程 。尤其是 XOD在肝炎中增加 ,因此 ,XOD抑制
剂可能对肝炎治疗有利 ,同时可以减少氧化造成的
紧张和伤害〔16〕 。脂质氧化酶(LOX)涉及到白三烯 、
前列腺素等的生物合成路径并诱导脂肪酸的氧化 ,
这些也涉及到炎症 、硬化 、癌症等过程〔17〕 。因此 ,
·652· 中药材第 27 卷第 9期 2004 年 9 月
LOX抑制剂有利于直接减少炎症 ,减少因脂肪酸和
脂蛋白氧化造成的细胞膜伤害 , 促进组织修复 。
Trolox 等价抗氧化能力(TEAC)测定是评价纯化合
物 、混合物或提取物细胞外抗氧化能力的系列方法
之一 ,它以直接清除自由基离子 ABTS·+为指标 。
两种蛇葡萄提取物都显示有较强的抗氧化能力 ,说
明它们能在细胞内有效地防护自由基造成的伤害 ,
从而减少炎症 ,促进组织修复 。
抗病毒的中草药含有多种天然化学成分 ,虽然
直接的抗病毒作用一般较为缓和 ,但由于具有多重
作用而使病情逐渐缓解 。本文通过研究证实 ,异叶
蛇葡萄根提取物具有通过抑制两种氧化酶抗氧化和
直接在体液中清除自由基的作用 ,这使得它能从多
靶点 、多层次减少炎症造成的组织伤害 ,促进组织修
复 ,有利于病毒性疾病的治疗和缓解 ,为其治疗病毒
性疾病提供了依据。本文的研究表明 ,蛇葡萄茎叶
提取物具有类似的抗氧化作用 ,为这一资源的开发 ,
提供了新的线索 。
致谢:本项目受湖北省自然科学基金(2001ABB169)和湖北省科
技攻关项目(2002P1105)的资助。本文主要实验部分在英国食品研
究所完成。
参 考 文 献
1 陈科力 , 等.野葡萄根原植物的调查研究.中药材 ,
1996 , 19(4)∶176
2 陈科力 , 等.野葡萄根抗单纯疱疹病毒的作用部位.中
国药师 , 1999 , 2(6)∶281
3 陈科力 , 等.蛇葡萄根提取物体内抗鸭乙型肝炎病毒作
用.中药材 , 2000 , 23(1)∶46
4 孙迅.蛇葡萄根治疗带状疱疹的疗效观察.中医杂志 ,
1984 , 8∶47
5 罗毅 , 等.蛇葡萄根的形态组织学鉴定.中药材 , 1996 ,
19(11)∶554
6 陈科力.蛇葡萄根化学成分的研究.中国中药杂志 ,
1996 , 21(5)∶294
7 张琼光 ,等.异叶蛇葡萄根化学成分的研究.中药材 ,
2003 , 26(9)∶636
8 O.I.Aruoma.Free radicals , oxida tive stress , and antiox i-
dants in human health and disease.J.Am.Oil.Chem.
Soc., 1998 , 75(2)∶199
9 张秀明 ,等.蛇葡萄根的保肝降酶及抗自由基损伤的作
用.中国药师 , 1999 , 2(5)∶225
10 陈科力 , 等.三种蛇葡萄根抗 D-GaLN致急性肝损伤的
实验研究.中药材 , 2000 , 23(1)∶46
11 Cotgreave , et al.Host biochemical defence mechanisms a-
gainst prooxidants. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol ,
1988 , 28∶189
12 P.Cos , et al.Structure-activity relationship and classifi-
ca tion of flavonoids as inhibitors of x anthine oxidase and
superoxide scanvengers.J.Nat.P rod., 1998 , 61∶71
13 A.O.Chen , et al.Purification and characterization of a
lipoxygenase from immature English peas.J.Agri.Food
Chem , 1986 , 34∶203
14 N.Salah , et al.Polyphenolic flavanols of aqueous phase
radicals and as chain-breaking antioxidants. Arch.
Biochem.Biophys , 1995 , 322∶339
15 J.Castillo , et al.Antioxidant activity and radioprotective
effects against chromosomal damage induced in vivo by X-
rays of flavan-3-ols(procyanidins)from grape seeds(Vitis
vinifera):comparative study versus other phenolic and
org anic compounds.J.Agric.Food Chem , 2000 , 48∶1738
16 E. J. Oliveira , et al. I n vitro glucuronidation of
kaempferol and quercetin by human UGT-1A9 micro-
somes.FEBS Lett., 2000 , 471∶11
17 H.Kuhn , et al.Oxidation modifcation of human lipopro-
tein by lipoxygenases of different postition specificities.J.
Lipid Res , 1994 , 35∶1749
(2004-04-07收稿)
Investigation on the Antioxidant Activities in Vitro of Extracts
from Ampelopsis humilifolia var.heterophylla and A .sinica
Chen Keli1 , Ye Cong jin1 , Geoff W.Plumb2 , Bao Yongping 2
(1.Department of Pharmacy , Hubei Co llege of T raditional Chinese Medicine , Wuhan 430061;2.Institute of Food Research , Nor-
wich , NR4 7UA , UK.)
Abstract The antio xidant activities of Ampelopsis humili folia var.heterophy lla and A .sinica , antiviral medicinal plants used
in Hubei province of China , have been investiga ted using bo th enzymatic and non-enzymatic antiox idant assay s in vitro.Ex tracts from
the both plants inhibited xanthine oxidase and lipoxygenase activites , and were scavengers of the ABTS·+ free radical by T rolo x E-
quivalent Antioxidant Capacity assay(TEAC).The ex tracts possesses a relatively high TEAC value campared with g rape seed ex-
tracts.
Key words Ampelopsis sinica ;A.humilifolia var.heterophylla;TEAC;Xanthine oxidase;Lipoxygenase
·653·中药材第 27 卷第 9 期 2004 年 9 月