全 文 ：湖南林业科技 2013 年第 40 卷第 1 期
研究报告
收稿日期:2012 —10 —12
修订日期:2013 —01 —11
基金项目:国家林业局野生植物保护管理项目 (090630)。
作者简介:詹 鹏 (1982 —) ，男，湖南省保靖县人，讲师，
主要从事环境生物技术研究。
* 为通迅作者
小溪国家级自然保护区落叶木莲生长与
遗传多样性分析
詹 鹏1，2，徐万吉3，陈介南1，2* ，张 林1，2，谭亦文1，2，石 旺1，2
(1. 国家林业局生物乙醇研究中心，湖南 长沙 410004; 2. 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，湖南 长沙 410004;
3. 湖南小溪国家级自然保护区管理局，湖南 永顺 416709)
摘 要:对小溪国家级自然保护区内落叶木莲生长特性进行了调查，并采用 RAPD － PCR分子生物学技术分析落叶
木莲的遗传多样性。结果表明:该保护区内落叶木莲的胸径 －树高生长曲线为 Y = － 0. 0043X2 + 0. 731X + 0. 7837;
从 UPGMA聚类基因图谱分析得出该区内落叶木莲具有遗传亲缘关系，推断该区内落叶木莲具有相近的起
源，为研究该区内落叶木莲的起源及保护提供了科学依据。
关键词:落叶木莲;生长曲线;遗传多样性;小溪国家级自然保护区
中图分类号:Q 943 文献标识码:A 文章编号:1003 —5710 (2013)01 —0057 —04
doi:10. 3969 / j. issn． 1003 —5710. 2013. 01. 016
Analysis of growth and genetic diversity of Manglietia deciduas in
Xiaoxi National Nature Reserve
ZHAN Peng1，2，XU Wanji3，CHEN Jienan1，2* ，ZHANG Lin1，2，
TAN Yiwen1，2，SHI Wang1，2
(1. State Bureau of Forestry，Bioethanol Research Center，Changsha 410004，China; 2. Institute of Biological and
Environmental Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China;
3. Administration of Xiaoxi National Nature Reserve，Yongshun 416709，China)
Abstract:The growth characteristic of Manglietia deciduas in Xiaoxi National Nature Reserve was investigated，and the RAPD-PCR
molecular biology technique and UPGMA cluster method were used to analyze the genetic diversity of Manglietia deciduas. The results
showed that，the DBH-height growth curve of Manglietia deciduas was fitted with a formula，which was Y = － 0. 004 3X2 + 0. 731X +
0. 783 7 . There were some genetic relationship and the similar origin among different Manglietia deciduas plants in the survey area，
which provided the scientific basis for the origin and protection of Manglietia deciduas in Xiaoxi National Nature Reserve.
Key words:Manglietia deciduas;growth curve;genetic diversity;Xiaoxi National Nature Reserve
落叶木莲 (Manglietia deciduas)又名华木莲，是
我国特有单种属，1999 年被列入 《国家重点保护野生
植物名录 (第一批)》。由于其落叶的固有特性，落叶
木莲为木兰科的木莲属与木兰属间的亲缘关系找到了
一条纽带，对研究木兰科的系统演化，乃至探讨被子
植物的起源，有着极其重要的地位［1］。另外，落叶木
莲具有较高的观赏价值，可作为优美的庭园绿化树种、
营造速生丰产林的树种和上等的建筑、家具、细木工
等的用材树种。
2003 年，小溪国家级自然保护区管理站在其核心
区鲁家村收集植物资源种子时发现一种木莲属的种子，
经有关专家实地考察，经鉴定该物种为落叶木莲。同
年，在与鲁家村接壤的云盘村也发现了该树种，至此，
打破了落叶木莲仅发布于江西幕阜山地宜春市明月山
的报道［2 － 3］，使得落叶木莲成为湖南省拥有的珍稀国
家重点保护野生植物。由于落叶木莲自身遗传多样性
詹 鹏，等:小溪国家级自然保护区落叶木莲生长与遗传多样性分析
较差，其繁衍能力远远低于其它林木，使得落叶木莲
种群数量稀少［4 － 5］，同时受群落内其他物种的竞争作
用，加剧了落叶木莲的濒危程度［6］，对落叶木莲的调
查及保护显得尤其重要。
随机扩增多态性 (Random amplified poIymorphic
DNA，RAPD)分子标记技术是建立在 PCR 基础之上
检测受试材料基因组的遗传变异关系的一种分子生物
学技术，由于其简便快捷、多态性高、成本低等特点，
已在植物研究中获得了广泛应用，如进行植物遗传图
谱的建立，植物系统分类学及种质资源遗传关系的研
究，辅助选择育种等 ［7］。我们对小溪国家级自然保护
区内落叶木莲的分布及生长特性进行了调查，并采用
RAPD － PCR分子生物学技术揭示种间的亲缘关系，为
保护这一珍稀濒危物种提供基础数据。
1 试验地概况
小溪国家级自然保护区位于湖南省西北部湘西自
治州永顺县境内，地理坐标为:110°0650″—110°21
35″E，28°4215″—28°5315″N。东西长 23. 5 km，南北
宽 20 km，总面积 24 800 hm2，系亚热带保存最完整、
面积最大的低海拔常绿阔叶原始次生林区之一，是少
数免遭第四纪冰川侵袭而幸存的天然资源宝库之一。
境内最高海拔 1 327. 1 m，最低海拔 162. 6 m，海拔高
度差达 1 164. 5 m。保护区属亚热带湿润季风气候，年
平均气温 12 ～ 14℃，无霜期海拔较低处为 250 d，
800 m以上为 200 d。年降水量 1 300 ～ 1 400 mm。土壤
为板页岩发育的山地黄红壤，较肥沃，pH 值平均为
6. 0。采样地位于小溪国家级自然保护区核心区鲁家村
低塔，东经 110°1546. 42″—110°1548. 56″，北纬 28°
5147. 00″—28°5151. 51″，海拔 679 ～ 752 m，总面积
10 000 m2。
保护区内最大株落叶木莲位于鲁家村低塔，胸径
70 cm，树高 31. 2 m，冠幅 13 m × 12 m，枝下高 6 m，
主干高 2 m处已空腐，树龄约 300 a，年可采落叶木莲
果实约 20 kg。该树 10 m ×10 m内土壤为山地黄红壤，
pH 值为 5. 8，地表 10 cm 处土壤密度为 1. 613 g /cm3，
有机碳质量为 8. 34 g /kg，分布有宜昌润楠、甜槠、杨
桐、锥栗、赤皮青冈、枫香、多青冈、线叶蕗蕨、钟
鄂木 (国家一级保护树种)、波叶木巴戟、尖连蕊茶、
银木荷等物种。该树超过江西省宜春市明月山国家森
林公园发现的树高 30 m、胸径 63 cm、冠幅 7 m × 4 m
落叶木莲最大株的记录［1］。
2 材料与方法
2. 1 材料
2. 1. 1 试验材料 落叶木莲树叶采自小溪国家级自然
保护区核心区鲁家村，采集株数 4 株，置于封口袋内
冰盒保鲜送至实验室， － 80℃保存备用。样品情况详
见表 1。
表 1 落叶木莲样品基本情况
Tab. 1 Basic situation of different Manglietia deciduas
samples
编
号
胸径
(cm)
树高
(m)
经纬度 海拔
(m)经度 纬度
1 28 15. 8 110°1548. 56″ 28°5147. 00″ 752
2 6 3. 5 110°1547. 57″ 28°5149. 19″ 706
3 70 31. 2 110°1546. 05″ 28°5151. 38″ 712
4 10 8. 0 110°1546. 42″ 28°5151. 51″ 679
2. 1. 2 试验试剂及引物 试验所需试剂均为市售分析
纯。扩增所需引物由上海宝生生物科技有限责任公司
设计合成 (见表 2)。
表 2 引物序列
Tab. 2 Sequence of primers
序号 引物名称 引物序列 GC含量(%)
1 S36 5’AGCCAGCGAA3’ 60
2 S37 5’GACCGCTTGT 3’ 60
3 S43 5’GTCGCCGTCA3’ 70
4 S134 5’TGCTGCAGGT3’ 60
5 S147 5’AGATGCAGCC3’ 60
6 S387 5’AGGCGGGAAC3’ 70
7 S404 5’GGCGGCTGTC3’ 80
8 S405 5’GGGAACGTGT3’ 60
2. 2 方法
2. 2. 1 生长曲线的测定 于 2012 年 7 月中旬进入保护
区鲁家村进行落叶木莲的实地测定。其中树高采用测
树仪法;胸径采用测树围尺法;经纬度采用 GPS 仪测
定法。
2. 2. 2 遗传多样性分析
(1)DNA提取与检测。落叶木莲总 DNA 的提取采
用如下方法［8］:①去离子水将落叶木莲叶片洗净，灭菌
后的吸水纸吸去表面的水分;②取 0. 2 ～ 0. 3 g 剪碎，
加液氮迅速在研钵中研磨至粉状，加 1. 5 mL 65 ℃预
热的 CTAB 提取液;③分装至 1. 5 mL 离心管中，65℃
水浴 60 min;④加 0. 5 mL 氯仿 /异戊醇 (24 ∶ 1，V /
V) ，混匀，8 000 r /min 离心 10 min，取上清液，重复
2 次;⑤加 2 /3 体积预冷的异丙醇，混匀，10 000 r /
min离心 10 min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀;⑥干燥
后 50 μL TE 缓冲液溶解沉淀，并加入 2 μL 10 mg /mL
的 RNAse室温放置 30 min，4℃保存备用。0. 8%琼脂
糖凝胶电泳，Syngene Genesnap 凝胶成像系统观察
拍照。
(2)RAPD — RCR 扩增。PCR 反应体系:25 μL 总
体积， 2. 5 μL PCR Buffer， 0. 2 mMdNTP， 2. 8 mM
MgCl2，0. 3 μM引物，2. 5 U Taq DNA，100 ng DNA 模
板。扩增程序为:94℃预变性 4min，然后 40 个循环，
每个循环中 94℃变性 1 min，36℃退火 1 min，72℃延
伸 2 min，最后 72℃延伸 10 min。反应在 MJ PTC — 200
·85·
研究报告
基因扩增仪上进行。扩增产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶进
行电泳，Syngene Genesnap 自动凝胶成像系统拍照
观察。
3 结果与分析
3. 1 落叶木莲生长曲线
调查区域内落叶木莲胸径最小、最大值分别为
6 cm 和 70 cm，树高最小、最大值分别为 3. 5 m 和
31. 2 m，胸径在 15 cm 以下的样本占总数 (4 株)的
66. 7%。通过 Excel软件进行拟合，调查区域内落叶木
莲胸径与树高存在着一定的相关性 (R2 = 0. 969 3) ，
其公式为:Y = － 0. 004 3 X2 + 0. 731 X + 0. 783 7 ，其中
Y代表树高 (m) ，X代表胸径 (cm) (见图 1)。
图 1 落叶木莲胸径 －树高曲线
Fig. 1 Relationship between DBH and height of Manglie-
tia deciduas
3. 2 RAPD － PCR检测
3. 2. 1 DNA质量检测 环境样品能否顺利提取基因组
总 DNA片段是能否进行 RAPD — PCR 技术分析的前提。
所提取的 DNA 样品的色泽为白色或近白色，采用核酸
和蛋白质含量测定仪 (GeneQuant Pro)检测 260 nm、
280 nm波长处的光吸收比值 OD260 / OD280 为 1. 75，
计算可知 DNA 产率为 0. 314 ug /L，DNA 琼脂糖电泳图
谱如图 2 所示。由图 2 可看出，各落叶木莲样品基因
组 DNA 电泳得到的条带可进行后续 RAPD —PCR分析。
图 2 落叶木莲总 DNA电泳检测
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of dif-
ferent samples
3. 2. 2 RAPD － PCR 扩增 如表 3 所示，由于落叶木
莲的遗传多样性较差，采用 8 种单引物对各落叶木莲
DNA样品进行 RAPD扩增所得图谱中的条带较少 (0 ～
4 条)。通过比选扩增出条带的多少，选择引物 S404
(5’GGCGGCTGTC3’)为进行 RAPD 扩增的最优引物，
并采用该引物对各落叶木莲样品进行扩增，以揭示各
样本之间的亲缘关系。由图 3 可知，各样品均扩增出 3
至 4 个条带。1、3 号样有 3 条条带，2、4 号样有 4 条
条带。
表 3 引物扩增结果
Tab. 3 Results of the primers amplification
序号 引物名称 引物序列 GC含量(%) 条带数
1 S36 5’AGCCAGCGAA 3’ 60 1
2 S37 5’GACCGCTTGT 3’ 60 4
3 S43 5’GTCGCCGTCA 3’ 70 2
4 S134 5’TGCTGCAGGT 3’ 60 0
5 S147 5’AGATGCAGCC 3’ 60 2
6 S387 5’AGGCGGGAAC 3’ 70 0
7 S404 5’GGCGGCTGTC 3’ 80 1
8 S405 5’GGGAACGTGT 3’ 60 3
图 3 落叶木莲 RAPD － PCR电泳检测
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of RAPD-PCR products
3. 3 聚类分析
通过 DPS软件进行 UPGMA聚类分析 (见图 4) ，4
个样品可分为 2 类，其中 1、3 号样分为 1 类，2、4 号
样分为 1 类，结合表 1 各落叶木莲的生长地域可推测
1、3 号落叶木莲可能是 2、4 号落叶木莲的后代，4 株
落叶木莲存在着亲缘关系。
图 4 落叶木莲 RAPD 的 UPGMA聚类分析
Fig. 4 UPGMA cluster analysis of different samples
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詹 鹏，等:小溪国家级自然保护区落叶木莲生长与遗传多样性分析
4 结论与讨论
通过实地测量确定了小溪国家级自然保护区内落
叶木莲的胸径 － 树高生长曲线为 Y = － 0. 0043X2 +
0. 731X + 0. 783 7 ，其中该区内最大株落叶木莲是迄今
为止已有报道的最大株落叶木莲。通过 RAPD － PCR分
子生物学技术分析落叶木莲 DNA，得出该区内落叶木
莲具有遗传亲缘关系，为落叶木莲的起源研究及保护
提供了科学依据 。
参考文献:
［1］ 郑庆衍，郑峻嵘． 新发现的濒危树种———落叶木莲 ［J］． 植物
杂志，2000 (1) :1．
［2］ 易宏，侯伯鑫，陈家法，等． 永顺县落叶木莲花的形态学研究
［J］． 湖南农业大学学报:自然科学版． 2006，32 (6) :611
－ 615．
［3］ 侯伯鑫，林峰，田学洲，等． 湖南永顺县落叶木莲资源考察研
究 ［J］． 中国野生植物资源，2007，26 (2) :18 － 22．
［4］ 廖文芳，夏念和，邓云飞，等． 华木莲的遗传多样性研究
［J］． 云南植物研究． 2004，26 (1) :58 － 64．
［5］ Hamrick JL，Godt MJW． Allozyme diversity in plant species
［M］ / /Brown AHD，Clegg MT，Kahler AL，et al． Plant pop-
ulation genetics，breeding，and genetic resources． Sunderland，
Mass:Sinauer Associates，1990:43 － 63．
［6］ 袁斌荣． 落叶木莲的濒危机理与保护对策 ［J］． 江西林业科
技，2005 (3) :45 － 46．
［7］ 胡裕清，赵树进． RAPD 技术及其在植物研究中的应用 ［J］．
生物技术通报，2010 (5) :74 － 77．
［8］ 邹喻苹，葛颂，王晓东． 系统与进化植物学中的分子标记
［M］． 北京:科学出版社，2001．
(文字编校:张 珉

)
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［8］ Wackernagel． M，Yount． J． D． Footprints for sustainability:
the next steps ［J］． Environment，Development and Sustain-
ability，2002，2 (1) :23 － 44．
［9］ Jan Spike，Arthur Woueswinkerl． Multiple Land Use Plann-ing
Methodologies-Comparative Study Between Nether-lands and
USA ［M］． Wageningen:ISOMUL，2006:134 － 137．
［10］ Waehernagel． M，Rees． W． Our ecological footprint:Reduc-
ing human impact on the earth ［M］． Gabriola Island:New
Society Publishers，1996:36 － 39．
［11］ Rees． W． E． Ecological footprint and appropriated carrying
capacity:what urban economics leaves out ［J］． Environment
and Urbanization，2008，4 (2) :12 － 13．
［12］ 李昌峰． 土地利用变化对水资源的影响研究的现状和趋势
［J］． 土壤，2002 (4) :195 － 205．
［13］ 徐建华． 现代地理学中的数学方法 ［M］． 北京:高等教育
出版社，2003:87 － 88．
［14］ 刘佳． 开封市土地利用总体规划环境影响评价 ［D］． 郑州:
河南大学，2009．
［15］ Thomas L． Saaty，Mariya Sodenkamp． Making decisions in hi-
erarchic and network systems［J］． International Journal of Ap-
plied Decision Sciences，2008，1 (1) :24 － 79．
(文字编校:唐效蓉)
·06·