全 文 ：收稿日期:2011-04-22; 修订日期:2011-09-05
基金项目:国家自然科学基金(No． 39870900) ;
粤港科技合作项目(No． GHP /022 /06)
作者简介:李明勇 (1973-) ，男(汉族) ，广东湛江人，现任广东医学院讲
师，硕士学位，主要从事肿瘤防治研究工作．
* 通讯作者简介:梁念慈(1940-) ，男(汉族) ，广东吴川人，现任广东医学
院教授，主要从事天然药物研究与开发工作．
半边旗提取物 5F对人鼻咽癌
CNE － 2Z细胞生长的抑制作用
李明勇1，李 蓉1，吴科锋2，梁念慈2*
(1．广东医学院，广东 湛江 524023;
2．广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)
摘要:目的 研究半边旗提取物 5F对人鼻咽癌 CNE － 2Z细胞的抑制作用及可能机制。方法 以台盼蓝活细胞计数法测
定生长曲线;用 MTT比色法检测给药后鼻咽癌细胞的增殖抑制情况;采用 FCM检测 5F对细胞周期和凋亡的影响;用 PI /
Hoechst33258 荧光双染法和 DNA ladder检测凋亡。结果 5F 作用后，生长曲线测定和 MTT 比色法实验结果显示，5F 对
CNE － 2Z细胞的增殖和生长有显著的抑制作用并呈明显的时间 －剂量依赖关系;流式细胞仪、DNA ladder和荧光双染法
结果提示 5F可诱导 CNE － 2Z细胞凋亡。结论 半边旗提取物 5F能抑制 CNE － 2Z细胞的增殖效应，其机制可能与诱导
细胞凋亡和引起细胞周期阻滞于 G2 /M期有关。
关键词:半边旗; 鼻咽癌; 生长曲线; 细胞凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 02． 003
中图分类号:R739． 63 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)02-0261-02
Inhibitory Effects of 5F from Pteris semipinnata L． on Proliferation of Human Nasopha-
ryngeal Carcinoma CNE － 2Z Cells
LI Ming-yong1，LI Rong1，WU Ke-feng2，LIANG Nian-ci2*
(1． Department of Pathophysiology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China;2． Guangdong
Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Zhanjiang 524023，China)
Abstract:Objective To study the inhibitory effect and its mechanism of 5F from Pteris semipinnata L． on human nasopharynge-
al carcinoma CNE － 2Z cells． Methods The growth curve was drawn by means of counting cell number． MTT assay was adopted
to determine the inhibition rate on CNE － 2Z cells． The cell apoptosis was detected by flow cytomertic analysis，DNA ladder and
Hoechst3358 /PI fluorescent staining． Results The result of growth curve and MTT showed that the 5F had a remarkable inhibition
on the proliferation and growth of CNE － 2Z cells，in time and does － dependent manner． FCM，DNA ladder and fluorescent stai-
ning could detect the cell apoptosis． Conclusion 5F can inhibit the proliferation of CNE － 2Z cells and the possible mechanism
may be related to inducing the cell apoptosis and arresting the cell cycle in G2 /M phase．
Key words:Pteris semipinnata L．; Nasopharyngeal carcinoma; Growth curve; Apoptosis
半边旗 Pteris semipinnata L．，又名半边莲、半边菊，属凤尾蕨
科植物，广泛分布于南方各省，民间常用于清热解毒、利水消肿、
治疗疳积、风湿痛等。半边旗提取物 5F(5F from Pteri semipinnata
L．)是从中药半边旗中提取的一种二萜类化合物，其化学名为 11
－ α －羟基 － 15 －氧 － 16 －烯 －对映贝壳杉烷 － 19 酸，分子式为
C20H28O4，分子量为 332． 4。本课题对半边旗的有效活性成分及
提取工艺进行了详细的研究［1，2］，大量研究表明其二萜类提取物
5F对体外培养的肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病癌细胞等
均有抑制及诱导凋亡作用［3 ～ 5］，动物实验也显示其有明显的抗肿
瘤活性且毒副作用小，是一种具有广泛应用前景的抗癌新
药［6，7］，但其对鼻咽癌细胞生长的影响至今未见报道。本研究旨
在探讨半边旗提取物 5F 对人鼻咽癌 CNE － 2Z 细胞生长的抑制
作用及可能的机制。
1 材料与仪器
1． 1 材料 CNE － 2Z 细胞由广东医学院肿瘤研究所提供;半边
旗提取物 5F由广东医学院天然药物开发中心提供，实验前 5F用
DMSO溶解，培养液稀释(DMSO/终浓度控制在 0． 1% 以下)。
RPMI － 1640 培养基为 Gibco 公司产品;小牛血清为四季青公司
产品;MTT和 DMSO均为 AMRESCO公司产品;5 －氟尿嘧啶(5 －
Fluorouracil，5 － Fu)购于上海旭东海普药业有限公司(批号:
011012) ;PI /Hoechst33258 为 Sigma公司产品;琼脂糖、TBE Buffer
和 DNA ladder试剂盒购买于北京鼎国试剂公司，其余试剂均为
分析纯。
1． 2 仪器 培养箱(日本 HITEL 公司) ，Thermo electron corpora-
tion varisskan flash酶标仪、EPICSXL型流式细胞仪(COUNTER 美
国) ，TS100 倒置生物显微镜(日本 Nikon 公司)Mini 垂直电泳槽
(北京六一厂)。
2 方法
2． 1 细胞培养 CNE － 2Z 细胞在 5% CO2，37℃条件下，用含
10%小牛血清、青霉素(100 μg /ml) ，链霉素(100 μg /ml)RM-
PI1640 培养液传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。
2． 2 半边旗提取物 5F对细胞生长曲线的影响 取处于对数生长
期的细胞经 0． 25%胰酶消化脱壁后，用台盼蓝作活细胞计数，接
种于 24 孔板中，每孔 8 × 104 /0． 9 ml，置于 37℃，5% CO2 饱和湿
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 2 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 2 期
度的温箱中培养，待细胞贴壁后分别加入 0． 1 ml 不同浓度的药
物和 5 － Fu，使其终浓度分别 10，20，40 和 20 μg /ml，空白对照组
加等量生长液。然后在 37℃、5%CO2 饱和湿度条件下培养 4 d，
在培养后的即刻及药物作用后的 1，2，3，4 d，镜下观察细胞形态
学改变并各取样 4 孔，消化后各孔取 40 μl，加 0． 4%台盼蓝染液
10 μl，置血球计数板计活细胞数，并以培养时间为横坐标，以活
细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
2． 3 半边旗提取物 5F 对细胞增殖的影响 取对数生长期的细
胞，用含 10%胎牛血清的 RPMI － 1640 培养液配成 5 × 104 /ml 单
细胞悬液，接种至 96 孔板中，每孔 180 μl，每组设 4 个平行孔，然
后分别加入实验药物，终体积为 200 μl。实验分为 5 组，实验组:
加入终浓度为 10，20，40 μg /ml半边旗提取物 5F;阳性对照组:5
－ Fu终质量浓度为 20 μg /ml;空白对照组加等量生长液。置于
37℃，5%CO2 饱和湿度的温箱中培养 48 h 后取出，分别加入 50
μl MTT 温育 4 h，弃去培养基，加入 150 μl DMSO，在平板摇床上
摇匀，在酶标仪 495 nm读板，根据测得的吸光度值按下式计算抑
制率。抑制率(%)=(1 －实验组吸光度值 /对照组吸光度值)×
100%。
2． 4 流式细胞术检测药物细胞凋亡及细胞周期的影响 分别用
终浓度为 10，20，40 μg /ml 的 5F 作用于 CNE － 2Z 细胞，同时设
立溶剂对照组，培养 48 h后收集细胞(1 × 106 /ml)用 PBS液洗涤
两次，离心后加预冷的 70%乙醇固定过夜。次日，PBS离心洗去
乙醇后加 PI染液 (含 100 μg /ml RNaseA，无 DNase) ，4℃避光染
色 40 min，于流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率，每组均重复 3
次。
2． 5 DNA Ladder 检测 用胰酶消化经药物作用 48 h 后的细胞，
离心、洗涤后，按细胞凋亡 DNA － Ladder 检测试剂盒说明提取细
胞 DNA，以 12 μl TE Buffer溶解 DNA，转移至 1． 5%琼脂糖凝胶，
在 80 V直流电压下电泳 1 h，紫外灯下观察并拍照。
2． 6 荧光双染法检测细胞凋亡情况 取处于对数生长期的 CNE
－ 2Z细胞，加入 0． 5 ml浓度为 2 μg /ml的药物，同时设立溶剂对
照组。培养 48 h 后取出，胰酶消化脱壁后，离心去上清液，PBS
洗 1 次，加入荧光染料 Hoechst33258 及 PI，在荧光显微镜下观察
细胞形态及颜色改变以区分出活的、凋亡及坏死细胞并照相。
3 结果
3． 1 5F对鼻咽癌细胞生长曲线的影响 从图 1 可以看出，从第 2
天开始，随着时间的延长，各浓度组的细胞生长曲线逐渐变得低
平，20 μg /ml浓度组最为明显，第 3 天开始出现下降，表明 5F对
CNE － 2Z细胞的生长抑制存在明显的时效关系(组间比较差异
均非常显著 P ＜ 0． 01)。
图 1 半边旗提取物 5F不同时间对 CNE － 2Z细胞生长的影响
3． 2 5F对鼻咽癌细胞增殖的影响 不同浓度的 5F 对 CNE － 2Z
细胞作用 48 h 后，CNE － 2Z 细胞增殖受抑制，抑制率分别为
(35． 71 ± 3． 54)%、(58． 93 ± 2． 61)%、(85． 71 ± 1． 37)%，与对照
组相比有显著差异(P ＜ 0． 01) ，且增殖抑制率呈明显的量 －效关
系，5F浓度为 20 μg /ml 以上时，对 CNE － 2Z 细胞的增殖抑制率
高于阳性对照组。见表 1。
3． 3 5F对鼻咽癌细胞周期与凋亡的影响 由表 2 可见 5F 使
CNE － 2Z 细胞周期中 G0 /G1 期细胞减少，G2 /M 期细胞增多，并
且随着 5F浓度的增高，凋亡率也逐渐增多。
表 1 5F作用 CNE － 2Z细胞 48 h后对细胞的抑制作用(珋x ± s)
组别 C /μg·ml －1 OD值 抑制率 (%)
对照 0． 56 ± 0． 02 －
10 0． 36 ± 0． 04* 35． 71 ± 3． 54*
20 0． 23 ± 0． 05＊＊ 58． 93 ± 2． 61＊＊
40 0． 08 ± 0． 01＊＊ 85． 71 ± 1． 37＊＊
20(5 － Fu) 0． 26 ± 0． 03＊＊ 52． 34 ± 3． 21＊＊
与对照组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01;n = 8
表 2 5F处理 CNE － 2Z细胞 48 h后细胞周期分布和凋亡的改变(珋x ± s)
组别 C /μg·ml － 1 G1(%) S (%) G2 /M (%) 凋亡率 (%)
对照 66． 5 ± 2． 7 25． 5 ± 1． 2 8． 0 ± 0． 5 0
10 61． 5 ± 2． 3* 27． 6 ± 1． 7 10． 9 ± 1． 2* 4． 9 ± 0． 4*
20 55． 3 ± 2． 4* 28． 2 ± 2． 3 19． 5 ± 1． 7* 12． 6 ± 0． 7*
40 39． 2 ± 2． 8＊＊ 30． 4 ± 3． 4 30． 4 ± 1． 5＊＊ 25． 4 ± 1． 6＊＊
与对照组比较，* P ＜0． 05;＊＊P ＜0． 01;n =8
3． 4 琼脂糖凝胶电泳 DNA ladder 试验 不同浓度的 5F 作用
CNE － 2Z细胞 48 h的电泳结果见图 2。
A － control ;B － 10μg /ml;C － 20μg /ml;D －40μg /ml;M －100bp Marker
图 2 5F诱导 CNE － 2Z细胞凋亡的 DNA凝胶电泳图谱
3． 5 荧光双染法检测结果 浓度为 20 μg /ml 的 5F 作用 CNE －
2Z细胞 48h，经 Hoechst33258 /PI 双重染色后，在荧光显微镜下，
可见染成强蓝色，核呈固缩状或圆珠状的凋亡细胞和染成红色的
坏死细胞(图 3B)。而空白对照组以活细胞为主，未见凋亡细胞
(图 3A)。
图 3 Hoechst33258 /PI荧光双染检测细胞凋亡(200 ×)
4 讨论
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方地区高
发性肿瘤。治疗上，放射治疗是鼻咽癌首选治疗方法已被公认，
但放射治疗可损伤机体的正常组织，抑制机体的免疫功能，引起
明显的甚至强烈的毒副反应，治疗后复发率高。寻找中药、天然
药物抗鼻咽癌且无明显毒副作用的研究成为发展趋势，因此从传
统医药中筛选抗癌新药，日益受到国内外学者的青睐［8］。
近年来，植物来源的抗肿瘤药在新药开发上显示了巨大潜
力，一方面，可从中筛选出安全、高效的新型抗肿瘤药物，如紫杉
醇、喜树碱等，另一方面，又可为设计更理想的新药提供独特的化
学结构。半边旗提取物抗肿瘤作用日益受到人们的重视。大量
研究表明半边旗提取物均具有抗肿瘤作用，目前认为其可能的抗
癌机制有细胞毒作用、诱发肿瘤细胞的凋亡、抑制血管生成、阻断
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 2 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 2
肿瘤细胞的生长信号通路等［9，10］。
本实验 MTT 和生长曲线结果提示 5F 可明显抑制 CNE － 2Z
细胞的生长，并呈时间 －剂量依赖性。流式细胞术结果表明，5F
能使 CNE － 2Z细胞发生 G2 /M 期阻滞，使细胞无法进入下一增
殖周期而达到抑制细胞增殖的目的，这可能是其具有抗肿瘤作用
机制之一。此外，不同浓度的 5F作用 CNE － 2Z细胞 48 h 后，均
可检测出凋亡峰，与对照组存在显著性差异(P ＜ 0． 01) ，提示半
边旗提取物 5F具有一定程度上诱导 CNE － 2Z细胞凋亡的作用。
细胞发生凋亡是由于细胞内核酸内切酶的激活，将 DNA 切割成
180 ～ 200 bp的片段，DNA 凝胶图谱上出现“梯状条带”(DNA －
Ladder) ，这种现象被认为是细胞凋亡的重要标志。琼脂糖凝胶
电泳 DNA ladder试验结果显示不同浓度的 5F作用细胞 48h 后，
20 μg /ml和 40 μg /ml浓度上琼脂糖凝胶图谱上呈现明显的“梯
状”条带(图 2) ，说明半边旗提取物 5F确实可诱导鼻咽癌细胞的
凋亡，可能是其抗鼻咽癌作用的另一方面，同时荧光双染法结果
也证实了这一结论。
半边旗提取物 5F对人鼻咽 CNE － 2Z 细胞体外生长增殖抑
制作用的发现及其机制的初步探讨，扩展了半边旗提取物 5F 的
药理作用，为临床采用中药治疗鼻咽癌提供理论基础及更广阔的
研究思路。
参考文献:
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thyroid carcinoma cells is via a mitochondrial － mediated pathway［J］．
Apoptosis，2005，10(6) :1345．
收稿日期:2011-04-05; 修订日期:2011-09-23
基金项目:国家自然科学基金(No． 81073045)
作者简介:温金莲(1964-) ，女(汉族) ，广东曲江人，现任广东药学院药科学院副教授，学士学位，主要从事分析化学的教学和科研工作．
* 通讯作者简介:黄庆华(1954-) ，女(汉族) ，广东廉江人，现任广东药学院药科学院教授，学士学位，主要从事分析化学的教学和科研工作．
济众酊的质量标准研究
温金莲，唐 睿，周 清，黄晓文，董宇静，黄庆华*
(广东药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 建立济众酊的质量控制方法。方法 采用薄层色谱法鉴别酊剂中主药大黄、广藿香;气相色谱法测定樟脑、薄
荷脑的含量。结果 济众酊中的大黄、广藿香的薄层色谱具有鉴别特征、斑点清晰、与相应对照品均呈相同的鉴别反应;
樟脑在 0． 040 44 ～ 0． 505 5 mg·ml －1范围内线性关系良好(r = 0． 999 9) ，平均回收率 100． 8%，RSD为 1． 1% (n = 6) ;薄
荷脑在 0． 049 84 ～ 0． 249 2 mg·ml －1范围内线性关系良好(r = 0． 999 4) ，平均回收率 101． 2%，RSD为 1． 2% (n = 6)。结
论 鉴别方法专属性强、灵敏度高;定量方法简便快速、结果准确且重复性好，可用于制剂的质量控制。
关键词:济众酊; 大黄; 广藿香; 樟脑; 薄荷脑; 气相色谱法
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 02． 004
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)02-0263-03
Quality Standard of Ji Zhong Tincture
WEN Jin － lian，TANG Rui，ZHOU Qing，HUANG Xiao － wen，DONG Yu － jing，HUANG Qing － hua*
(Guangdong Pharmacological University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To establish the quality control standard of Ji Zhong tincture． Methods The main ingredients of rhubard
and Herba Pogostemonis were identified by thin － layer chromatography (TLC)． The contents of camphor and menthol were deter-
mined by GC． Results Chi Chung tincture of Rhubarb and patchouli appeared distinguishing characteristic of TLC，spots were
clear，and showed the same reacts with a reference standard． The linear range of camphor was within the range of 0． 0404 4 ～ 0． 505
5 mg·ml －1 with a good linear relationship (r = 0． 999 9) ，the average recovery was 100． 8%，and RSD was 1． 1% (n = 6)． The
linear range of menthol was within the range of 0． 0498 4 ～ 0． 249 2 mg·ml －1 with a good linear relationship (r = 0． 999 4) ，av-
erage recovery was 101． 2%，and RSD was 1． 2% (n = 6)． Conclusion The identification method is selective and sensitive． The
quantitative method is simple，rapid，accurate and can be used to control the quality of Ji Zhong tincture．
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