全 文 ： 乌梅熊果酸提取优化及其对大肠杆菌的抑制作用
周 茜，韩晓梅，王唯霖，赵 文*1
（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

摘要：采用响应面法优化超声提取乌梅熊果酸的最佳条件。在单因素基础上，选择乙醇体积分数、料液比和超
声时间为影响因子，以乌梅熊果酸得率为响应值，进行响应面分析，并研究了乌梅熊果酸对大肠杆菌的抑制作
用。结果表明乌梅熊果酸提取最佳工艺条件为：乙醇体积分数 71%、料液比 3:44（g/mL）、超声时间为 2.5 h，
在此条件下得率为 12.58 mg/g。乌梅熊果酸对大肠杆菌最低抑菌浓度为 0.25 mg/mL；高剂量组（0.5 mg/mL）处
理后与对照组相比，细胞壁和细胞膜通透性增加，培养液蛋白质含量、核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率
分别增加了 29倍、1.5倍、7倍和 0.8倍；扫描电镜观察菌体有明显变形或破碎现象，表明乌梅熊果酸对大肠杆
菌生长具有抑制作用。研究为乌梅熊果酸及乌梅资源的综合利用提供可靠的理论基础。
关键词：乌梅；熊果酸；响应面分析法；大肠杆菌；抑菌作用

Optimization of Ursolic Acid Extraction from Fructus Mume and
Evaluation of its antibacterial mechanism on Escherichia coli

ZHOU Qian, HAN Xiao-mei, WANG Wei-lin, ZHAO Wen*
(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China)

Abstract: The ultrasound-assisted extraction of ursolic acid from Fructus mume by response surface methodology
(RSM) was optimized. Based on single-factor tests, three factors including ethanol concentration, solid-liquid ratio and
extraction time were applied to RSM to determine the effect of prime factors on the yield of ursolic acid from Fructus
mume. Besides, the antibacterial effect of ursolic acid on Escherichia coli was studied. Results showed that the optimum
extraction conditions by RSM were ethanol concentration 71%, solid-liquid ratio 3:44 (g/mL), extraction time was 2.5 h,
and under these conditions, the yield of ursolic acid was 12.58 mg/g. The antibacterial study showed that minimal
inhibition concentration of ursolic acid against E. coli was 0.25 mg/mL. After 0.5 mg/mL ursolic acid treatment, the cell
wall and membrane permeability of E. coli increased, protein content, nucleic acid materials, Ca2+ content and total
leakage were enhanced by 29, 1.5, 7 and 0.8 fold compared to control, respectively. The scanning electron microscope of
E. coli showed the cell was obvious destroyed or broken, which indicated that ursolic acid had the inhibitory effect on the
growth of E. coli. The study provided the theoretical basis for the application of ursolic acid and Fructus mume in future.
Key words: Fructus mume; ursolic acid; response surface methodology; Escherichia coli; antibacterial effect


基金项目：河北省科技计划项目(13226602D)
作者简介：周茜（1986- ），女，讲师，博士，研究方向为天然活性物质研究与食品安全。zhouqianyz513@126.com
通信作者：赵文（1962- ），女，教授，硕士，研究方向为营养分析与食品安全。
2015-10-09
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网络出版时间：2015-10-12 15:45:37
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20151012.1545.074.html

中图分类号： R284.5 文献标志码：A 文章编号：

乌梅，又称酸梅、合汉梅，是梅果主要加工产品之一。梅是我国的一种特种资源，目前世界上仅在
韩国、日本、新西兰等少数国家人工栽培，其他国家和地区相对罕见。乌梅使用历史悠久，具有敛肺涩
肠、生津止渴、驱虫止痢等功效，《神农本草经》中列为中品，是我国重要的药食同源物品[1]。研究表明
[2]，乌梅中含有多种活性物质，包括有机酸、萜类、黄酮、脂类等，其中熊果酸是乌梅发挥药理作用的有
效成分之一。熊果酸具有抗炎症、降血糖及免疫增强效果等多种生物学活性[3-5]。Zhang等研究表明熊果酸
可以通过抑制Toll样受体介导的炎症途径及改善机体氧化应激作用，对实验性早期脑损伤起到保护作用[6]。
日本等国家已经将其作为天然抗氧化剂应用于食品中，具有广阔的应用前景和重要的开发利用价值[7]。
目前乌梅熊果酸的相关研究较少。王娟[8]采用乙醇提取乌梅熊果酸并进行响应面法优化，熊果酸得率
为 6.57 mg/g。纪晓花[9]对乌梅熊果酸抑菌效果进行初步研究，结果表明其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等
4种致病菌具有显著抑菌作用。但是乌梅熊果酸得率较低，制约了其生物活性的深入研究。因此本文采用
超声辅助提取乌梅熊果酸并进行响应面法优化，获得最佳提取条件，提高乌梅熊果酸得率；并从细胞膜
和细胞壁通透性、蛋白质含量、细胞内容物及菌体形态等方面研究乌梅熊果酸对大肠杆菌的抑菌作用，
以期为熊果酸及乌梅资源的综合利用提供可靠的理论基础。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乌梅，购于保定万宝堂药房，60℃恒温烘箱中烘干，多功能高速粉碎机粉碎，60 目过筛备用。熊果
酸对照品，中国药品生物制品检定所；香草醛、无水乙醇、高氯酸、冰乙酸等试剂均为分析纯。营养琼
脂、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉浸膏、蛋白胨，北京双旋微生物培养
基制品厂；试验用水为蒸馏水。大肠杆菌（Escherichia coli），保存于河北农业大学微生物实验室。
1.2 主要仪器设备
BL-100 型高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金工具厂；TU-1810 紫外可见分光光度计，北京
普析通用仪器有限公司；电子天平，常州称重设备系统有限公司；SB-5200DTDN超声波清洗机，宁波新
芝生物科技股份有限公司；SPX-150S-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZX-30KBS
立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.3试验方法
1.3.1 乌梅熊果酸的测定[10,11]
1.3.1.1 熊果酸标准溶液的配制
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精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品 20.00 mg，置于 50 mL容量瓶中，无水乙醇定容，获得浓度为
400 µg/mL的标准溶液。准确吸取 2.5 mL标准品溶液，定容至 10 mL，即得浓度为 100 µg/mL的熊果酸
对照品，待用。
1.3.1.2 标准曲线绘制
准确吸取熊果酸对照品 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mL，分别置于试管中，85℃水浴锅中挥干
溶剂，加入 5% 香草醛-冰乙酸溶液 0.3 mL，摇匀；加入高氯酸 1.0 mL，摇匀；60℃水浴温育 15 min，后
置于冰水冷却至室温；加入冰乙酸 5.0 mL，摇匀后放置 15 min显色，以空白试剂为参比，测定 546 nm波
长处吸光度值。以熊果酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制熊果酸标准曲线并得到回归方程。
1.3.1.3 样品中熊果酸含量测定
准确吸取 0.3 mL样品提取液，参照 1.3.1.2，测定 456 nm波长处的吸光度值。根据回归方程计算熊果
酸质量。熊果酸得率以单位乌梅质量（g）含有的熊果酸质量（mg）计算。
1.3.2乌梅熊果酸取工艺流程
乌梅（干燥）→粉碎→不同条件下超声辅助浸提→离心→过滤→定容→测定吸光度→浓缩干燥→得
率计算。
1.3.3乌梅熊果酸提取条件单因素试验
1.3.3.1乙醇体积分数对提取效果的影响
准确称取乌梅样品 3.0 g共 4份，固定料液比为 3:30（g/mL）、超声时间 2 h、超声温度 50℃，考察
乙醇体积分数为 50%、60%、70%、80%、90%条件下乌梅熊果酸得率。
1.3.3.2料液比对提取效果的影响
准确称取乌梅样品 3.0 g共 4份，乙醇体积分数用 1.3.3.1中选定的条件，固定超声时间 2 h、超声温
度 50℃，考察料液比为 3:20、3:30、3:40、3:50、3:60（g/mL）条件下乌梅熊果酸得率。
1.3.3.3超声时间对提取效果的影响
准确称取乌梅样品 3.0g共 4份，乙醇体积分数用 1.3.3.1中选定的条件，料液比用 1.3.3.2中选定的比
例，固定超声温度 50℃，考察超声时间为 0.5、1、2、3、4 h条件下乌梅熊果酸得率。
1.3.3.4超声温度对提取效果的影响
准确称取乌梅样品 3.0g共 4份，乙醇体积分数用 1.3.3.1中选定的条件，料液比用 1.3.3.2中选定的比
例，超声时间用 1.3.3.3中选定的时间，考察超声温度为 30、40、50、60、70℃条件下乌梅熊果酸得率。
1.3.4熊果酸提取工艺条件优化[12,13]
在单因素试验结果基础上，选取乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）为自变量，以
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熊果酸得率为响应值，根据响应面 Box-Behnken中心组合试验设计原理（表 1），对乌梅熊果酸提取的影
响因素进行深入研究和条件优化，并做出响应图，对响应受多个变量影响的因素进行建模分析。
表 1 Box-Benhnken试验设计因素和水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment design
因素
水平
-1 0 1
X1（乙醇体积分数/%） 60 70 80
X2（料液比（g/mL）） 3:30 3:40 3:50
X3（超声时间/h） 1 2 3

1.3.5 乌梅熊果酸对大肠杆菌的抑菌作用研究
依照响应面分析确定的最优提取条件提取乌梅熊果酸。提取液 5000 r/min离心 10 min，取上清液，经
大孔凝胶树脂纯化后，回收洗脱液冷冻干燥即得乌梅熊果酸粉末。配制相应质量浓度溶液进行大肠杆菌
抑菌作用研究。
1.3.5.1 最低抑菌浓度（MIC）的测定
采用琼脂平板稀释法测定乌梅熊果酸的MIC值[14]。将乌梅熊果酸倍比稀释，使其在培养基中终质量
浓度为 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，分别取 1 mL加入培养皿中，倒入 15 mL培养基，充
分混匀。待冷却凝固后，均匀涂布 100 μL、104 CFU/mL的对数生长期大肠杆菌菌悬液，37℃恒温培养 24
h，观察菌落生长情况。以无菌落生长的最低乌梅熊果酸稀释浓度为MIC。
1.3.5.2 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞膜通透性的影响[15]
将培养至对数期的大肠杆菌，分别加入乌梅熊果酸使其终浓度为MIC和 2MIC，37℃、150 r/min继
续培养。分别于 0、2、4、6、8h时取样，3500 r/min离心 10 min，取上清液，用DDS-307A （DDB-600）
型电导仪测定其电导率。以不含乌梅熊果酸的菌悬液为对照，重复 3次，取平均值。
1.3.5.3 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞壁通透性的影响[16]
分别于 0、2、4、6、8h时取 1.3.5.2中试验组与对照组菌悬液，3500 r/min离心 10min，取上清液，
用试剂盒测定碱性磷酸酶（AKP）的含量，重复 3次，取平均值。
1.3.5.4 乌梅熊果酸对大肠杆菌培养液蛋白质含量影响[17]
分别于 0、2、4、6、8h时取 1.3.5.2中试验组与对照组菌悬液，采用 Bradford方法测定菌液中蛋白
质含量，重复 3次，取平均值。
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1.3.5.5 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞内容物含量的影响[18]
分别取 1.3.5.2中试验组与对照组培养 8h菌悬液 10mL于离心管中，分别测定核酸大分子物质含量、
钙离子含量及总漏出率。核酸大分子物质含量测定：4000 r/min离心 5min，取上清液，测定 260 nm波长
下的吸光度值。钙离子含量测定：依照钙试剂盒说明书测定上清液中钙离（Ca2+）。总漏出率测定：测定
上清液 600 nm波长下的吸光度值。重复 3次，取平均值。
1.3.5.6 扫描电镜观察[19, 20]
分别取 1.3.5.2试验组与对照组菌悬液各 5 mL，8000 r/min 离心 5min收集菌体，2.5%戊二醛固定 4h，
磷酸缓冲液洗涤，依次使用 50%、70%、90%和 100%乙醇体积分数对菌体进行脱水处理 30min。将脱水
菌体涂片于盖玻片上，自然风干，放入高真空蒸发器中，喷金镀膜，扫描电镜观察细菌表面形态。

2 结果与分析
2.1标准曲线与回归方程
以熊果酸含量（µg）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标，绘制熊果酸的标准曲线并得到回归方程为：
y=0.0064x-0.0132，相关系数 R2=0.9995。
2.2单因素试验
提取单因素对乌梅熊果酸得率的影响结果见图 1。图 1A结果显示，乙醇体积分数在 40%-70%范围内，
乌梅熊果酸得率呈现上升趋势，且乙醇体积分数达到 70%时得率最高。但当乙醇体积分数大于 70%时，
得率下降，提取溶剂的极性降低，可能会导致熊果酸溶解度下降，而其它脂溶性杂质溶出量增加，影响
熊果酸得率。因此，选择 70%的乙醇体积分数作为提取溶剂。图 1B显示料液比在 3:20到 3:40的范围内，
熊果酸得率显著增加，且料液比为 3:40 时最高；但当料液比继续增加时，熊果酸得率下降。当提取溶剂
过少时，固液两相浓度梯度小，使熊果酸有效物质不能完全溶出；而溶剂过多会造成溶剂浪费并对后续
分离纯化步骤不利。因此选择 3:40为最适提取料液比。图 1C结果显示提取时间在 2 h内，得率随超声时
间延长而增高，2 h时达到最大。但继续延长超声时间，得率开始下降并且趋于平稳。故选定 2 h为最佳
提取时间。图 1D结果显示得率随超声温度升高而平缓增加，但没有显著性差异，故超声温度对熊果酸提
取的影响较小。

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图 1 乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度对熊果酸得率的影响
A：乙醇体积分数，B：料液比，C：超声时间，D：超声温度
Fig. 1 Effects of ethanol concentration, solid-to-solvent ratio, extraction time and extraction temperature on extraction yield of ursolic
acid

2.3乌梅熊果酸提取工艺优化
2.3.1 回归模型的建立及方差分析
在单因素试验结果基础上，选择乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）为因素，进行
3因素 3水平的响应面试验设计（表 1）。

表 2 熊果酸得率响应面方案及结果
Table2 Design and results of RSM for the extraction of ursolic acid
试验编号 X1（体积分数/%） X2（料液比/mL） X3（超声时间/h） Y（得率mg/g）
1 80.00 40.00 1.00 10.10
2 60.00 40.00 3.00 9.82
3 70.00 30.00 1.00 9.67
4 60.00 30.00 2.00 9.13
5 80.00 50.00 2.00 10.53
6 80.00 30.00 2.00 10.63
7 70.00 40.00 2.00 11.85
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8 70.00 40.00 2.00 11.94
9 60.00 40.00 1.00 9.73
10 60.00 50.00 2.00 10.47
11 70.00 50.00 1.00 10.60
12 70.00 40.00 2.00 11.90
13 70.00 40.00 2.00 11.74
14 70.00 50.00 3.00 11.84
15 70.00 30.00 3.00 10.50
16 70.00 40.00 2.00 11.40
17 80.00 40.00 3.00 11.73

响应面分析方案与结果见表 2。利用Design Expert 7.0 软件对表 2数据进行多元回归拟合分析，获
得以熊果酸得率为响应值的回归方程：
Y=+11.77+0.36 X1+0.44 X2+0.35 X3-0.36 X1 X2+0.14 X1 X3+0.10 X2 X3-1.07 X1 X1-0.51 X2 X2-0.60 X3 X3。
上述回归方程的方差分析结果见表 3。由表 3的ANOVA分析可知：模型 P=0.0006<0.001（极显著），
失拟项 P=0.1894>0.05（不显著），说明此模型与试验有较好的拟合性，试验误差较小。相关系数 R=0.9569
和调整系数Adj.R2=0.9006也表明模型拟合程度较好，总变异系数为 2.63%，说明重现性较好，该模型可
用于优化乌梅熊果酸提取工艺条件。
从各个因素显著性水平差异可知，对乌梅熊果酸得率影响大小为：料液比 X2>乙醇体积分数 X1>超声
时间 X3。乙醇体积分数的二次项 X1 X1对熊果酸得率的影响达到了极显著水平（P<0.001）；乙醇体积分
数 X1、料液比 X2、料液比的二次项 X2X2和超声时间的二次项 X3 X3对熊果酸得率影响达到了高度显著水
平（P<0.01）；乙醇体积分数和料液比交互项 X1 X2（P<0.05）对熊果酸得率具显著影响；而其它因素交
互作用不显著。
表 3熊果酸提取优化回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance regression model of ursolic acid
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 概率>F 显著性
模型 12.32 9 1.37 17.11 0.0006 ***
X1 1.01 1 1.01 12.60 0.0093 **
X2 1.54 1 1.54 19.25 0.0032 **
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X3 0.97 1 0.97 12.16 0.0102 *
X1X2 0.52 1 0.52 6.48 0.0384 *
X1X3 0.073 1 0.073 0.91 0.3716
X2X3 0.042 1 0.042 0.53 0.4921
X1X1 4.79 1 4.79 59.88 0.0001 ***
X2X2 1.09 1 1.09 13.65 0.0077 **
X3X3 1.54 1 1.54 19.21 0.0032 **
残差 0.56 7 0.080
失拟项比 F值 0.37 3 0.12 2.60 0.1894
绝对误差 0.19 4 0.047
总和 12.88 16
注：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
2.3.2 响应面分析
根据回归方程得出不同因子的响应面和等高线，结果见图 2~4。响应面图是指在各个试验因素的相互
作用下导致响应值变化情况的三维空间曲面，能够清楚获得重要影响因素及指标变化情况等信息。在响
应面图中，曲面越陡峭，说明该因素对响应值影响越显著。等高线图与响应面图相对应，随响应面图变
化而变化，其曲线越接近中心，则对应的响应值越大。等高线图形状接近圆形，表明两个自变量间的交
互效应较弱；若形状接近椭圆形，表明两个自变量间交互作用较强[9]。
图 2表示乙醇体积分数 X1和料液比 X2的交互作用对熊果酸得率的影响。从图中得知，曲面比较陡峭，
说明乙醇体积分数、料液比对得率影响都是明显的。同时等高线是椭圆形，说明交互作用也非常明显。
当乙醇体积分数比较低时，得率随料液比变化不明显；当乙醇体积分数在 70~72%之间时，得率随着料液
比变化而显著提高，且能达到最大值。图 3表示乙醇体积分数 X1和超声时间 X3的交互作用对得率的影响。
由图中可知，虽然乙醇体积分数和超声时间单因素对得率影响显著，但两者交互作用不显著（P=0.3716），
响应面图曲面相对陡峭，等高线图接近圆形。从等高线图中还可看出，保持乙醇体积分数不变，超声时
间太高不利于熊果酸提取；当超声时间大于 2.5 h时，得率开始降低。图 4表示料液比 X2和超声时间 X3
的交互作用对得率的影响，但两者交互作用（P=0.4921）不显著；当料液比大于 3:44 时，得率降低。同
时，乙醇体积分数和料液比的交互作用与料液比和超声时间的交互作用相比，前者等高线更接近于椭圆
形，其对得率作用比后者显著。
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图 2 乙醇体积分数X1和料液比X2对得率的响应面分析
Fig. 2 RSM analysis for interactive effects of ethanol concentration X1 and solid-to-solvent X2

图 3 乙醇体积分数X1和超声时间X3对得率的响应面分析
Fig.3 RSM analysis for interactive effects of ethanol concentration X1 and extraction time X3
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图 4 料液比X2和超声时间X3对得率的响应面分析
Fig.4 RSM analysis for interactive effects of solid-to-solvent X2 and extraction time X3
2.3.3验证试验
根据回归方程预测乌梅熊果酸超声提取最优工艺条件为：乙醇体积分数为 71%，料液比为 3:44，超
声时间为 2.5 h，该优化条件下熊果酸得率预测 12.58 mg/g。为证明试验结果与实际情况是否相符，以上
述优化条件做三次平行，得到熊果酸得率为（12.61±0.13）mg/g，与预测值无显著性差异，说明此响应面
法得到的回归模型具有一定的可靠性。与王娟[8]研究结果相比，熊果酸得率增加 1倍，具有较大应用前景。
2.4 乌梅熊果酸抑菌作用研究结果
2.4.1 乌梅熊果酸对大肠杆菌的MIC测定结果
由表 4结果可知，乌梅熊果酸对大肠杆菌的抑制效果明显，MIC为 0.25 mg/mL。
表 4 乌梅熊果酸对大肠杆菌的MIC测定结果
Table 4 MIC of ursolic acid against E. coli
供试菌株
乌梅熊果酸浓度（mg/mL）
2.0 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0625 0（对照组）
大肠杆菌菌落 － － － － + + +
注： “+” 指有菌生长； “－” 指无菌生长
2.4.2 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞膜通透性的影响
当外界环境不利于微生物生长时，菌体细胞内K+、Na+等电解质大量外漏，导致培养液电导率改变，
从而反映细胞膜渗透性情况，同时电解质离子的外漏导致细胞内多种代谢途径受阻，严重影响细菌的正
常生长[21, 22]。由图 5可知，不同浓度乌梅熊果酸处理的大肠杆菌培养液电导率明显高于对照组。随着作用
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时间的延长，乌梅熊果酸处理的培养液电导率都呈现持续升高现象，且高浓度熊果酸处理组的电导率变
化显著。这说明乌梅熊果酸处理后大肠杆菌菌体细胞细胞质发生渗漏，电解质渗出量不断增大，细胞内
环境稳定性被破坏，从而破坏菌体细胞，达到抑菌效果。

图 5 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞膜通透性的影响
Fig.5 Effects of ursolic acid on the cell membrane permeability of E. coli
2.4.3 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞壁通透性的影响
碱性磷酸酶是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下胞外液中检测不到其活性。当细胞
壁受到破坏后，透性增加，碱性磷酸酶会泄漏到胞液中，所以通过检测细胞外AKP含量的变化可以反映
细胞壁的通透性[23-25]。由图 6 结果可知，随着作用时间延长，不同浓度处理组的大肠杆菌培养液中 AKP
含量持续上升，当达到 6h时，含量达到最高值，随后趋于平稳状态，且含量高于对照组。说明乌梅熊果
酸处理对大肠杆菌细胞壁有很强的破坏作用。

图 6 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞壁通透性的影响
Fig.6 Effects of ursolic acid on the cell wall permeability of E. coli
2.4.4 乌梅熊果酸对大肠杆菌培养液蛋白质含量影响
由图 7可知，不同浓度乌梅熊果酸对大肠杆菌培养液蛋白浓度的增加具有显著影响，当作用时间超
过 2h时，蛋白质含量快速增加，6h时达到最高，但随着作用时间延长，变化不大。当作用时间为 6h时，
MIC、2MIC乌梅熊果酸处理及对照组的蛋白浓度分别为 610.49、620.38和 21.4 µg/mL，乌梅熊果酸显著
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改变大肠杆菌细胞的膜透性，使细胞内的蛋白质渗漏到胞外培养液中。但MIC和 2MIC乌梅熊果酸处理
的差异不显著。

图 7 乌梅熊果酸对大肠杆菌蛋白质含量的影响
Fig.7 Effects of ursolic acid on the protein content of E. coli
2.4.5乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞内容物含量的影响
乌梅熊果酸对大肠杆菌菌液中核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率的影响结果如表 5所示。大肠杆
菌经乌梅熊果酸处理 8h 后，不同处理组的核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率与对照组相比，均具有
差异显著性。不同浓度处理的核酸大分子物质和总漏出率没有显著差异。高浓度乌梅熊果酸处理的 Ca2+
含量显著高于低浓度处理。
表 5 乌梅熊果酸对大肠杆菌细胞内容物含量的影响
Table 5 Effects of ursolic acid on the intracellular constituents of E. coli
内容物种类
乌梅熊果酸处理
对照组 MIC 2MIC
核酸大分子物质（OD260nm） 0.16±0.08 0.42±0.12 0.40±0.16
Ca2+含量（mmol/L） 0.14±0.08 0.60±0.11 1.12±0.18
总漏出率（OD600nm） 0.32±0.11 0.52±0.14 0.59±0.17

2.4.6 扫描电镜观察
图 8 显示，不同浓度处理组大肠杆菌菌体都发生明显变化。MIC 乌梅熊果酸处理的大肠杆菌菌体边
缘模糊，菌体间界限不明显，发生聚集现象；且菌体细胞表面粗糙，有凹陷和皱缩痕迹。2MIC乌梅熊果
酸处理的大肠杆菌呈不规则状态，菌体出现破碎，并伴随有碎片产生。对照组大肠杆菌，菌体边缘整齐、
形状规则，未发现明显变化。说明乌梅熊果酸能够有效抑制大肠杆菌的生长。

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图 8 大肠杆菌的扫描电镜图
A：对照组，B：MIC乌梅熊果酸处理，C：2MIC乌梅熊果酸处理
Fig.8 Scanning electron microscope of E. coli

3 结 论
通过单因素试验和响应面优化分析，影响乌梅熊果酸得率大小的因素顺序为：料液比、乙醇体积分
数和超声时间，其中料液比与乙醇体积分数因素之间的交互作用显著。通过响应面得到乌梅熊果酸提取
最佳工艺条件为：乙醇体积分数为 71%，料液比为 3:44（g/mL），超声时间为 2.5 h。在该优化条件下，
乌梅熊果酸得率是 12.58 mg/g。
乌梅熊果酸对大肠杆菌的最低抑菌质量浓度为 0.25 mg/mL，随着乌梅熊果酸浓度增大，其抑菌效果
也逐渐增强。经过 0.5 mg/mL乌梅熊果酸处理后，大肠杆菌细胞壁、细胞膜通透性明显增加，培养液中蛋
白质含量、核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率增加分别增加了 29倍、1.5倍、7倍和 0.8倍，扫描电镜
观察菌体有明显变形或破碎现象。乌梅熊果酸主要是通过破坏菌体的细胞壁和细胞膜的完整性，引起细
胞内容物的外漏，从而发挥对大肠杆菌的抑制作用。

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