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大岩桐组织培养研究进展



全 文 :·专题综述· 北方园艺2011(23):166~170
作者简介:徐全乐(1980-),男,博士,讲师,现主要从事植物分子生
物学等研究工作。
基金项目:西北农 林 科 技 大 学 人 才 专 项 资 金 资 助 项 目
(Z111020912)。
收稿日期:2011-08-23
大岩桐组织培养研究进展
徐 全 乐
(西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌712100)
  摘 要:从大岩桐的再生途径、再生过程、培养基配方以及再生过程中出现的褐变、休眠、体
细胞突变等对大岩桐组织培养的研究现状进行了回顾,并探讨了存在的主要问题及发展趋势,以
期为今后的深入研究提供参考。
关键词:大岩桐;组织培养;研究现状;研究前景
中图分类号:S 682.2+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2011)23-0166-05
  大岩桐(Sinningia speciosa)属苦苣苔科苦苣苔属
多年生肉质草本植物。又名落雪泥,原产巴西,有单瓣
和重瓣之分[1-2];因其叶茂翠绿,花大色艳而得到广泛
种植。国内大岩桐的引种始自20世纪30年代,但直
到20世纪90年代才有小批量生产[3];这主要是由于
大岩桐自花不育,依靠种子繁殖技术难度较高且易造
成种性退化[4],块茎繁殖[5]、扦插等常规方法繁殖系数
低、受到季节的限制[6]。而组织培养则有效解决了这
一问题,为大岩桐的快速繁殖和工业化生产奠定了一
定的基础[5]。大岩桐的组织培养研究最早见于20世
纪80年代[7-8]。时至今日,在国内外已有多篇关于建
立大岩桐再生体系的报道[5,9];然而,其快繁体系多处
于试验阶段,对产业化模式的探讨较少[10-11]。现对大
岩桐组织培养的主要研究进展进行综述,分析其目前
存在的主要问题,以期为以后的深入研究和利用提供
参考。
1 大岩桐的离体再生概况
植物组织培养中,再生植株的形态发生有胚状体
发生和器官发生2条途径[12]。任如意等[13]通过组织
学观察,发现大岩桐的离体再生属于器官发生途径。
目前,尚未见有胚状体形成的报道。在器官发生途径
中,外植体可先形成愈伤组织,再进一步分化出不定芽
而形成再生植株;或者由外植体直接诱导形成不定芽。
在已有报道中,大岩桐的离体再生绝大部分属于前
者[4-5,13-18]。但倪奎[19]和张艳萍等[20]分别以叶片为外
植体,采用直接方式不经过愈伤组织阶段诱导生成不
定芽。在上述按照器官发生途径离体再生的相关报道
中,均是先形成不定芽,继而诱导生根。Xu等[21]以叶
片为外植体,经过2种途径建立大岩桐的高效离体再
生体系。第1种途径是按照常规的器官发生途径进
行,即外植体先形成愈伤组织,愈伤组织再分化出不定
芽,进而生成不定根,形成再生苗;第2种途径是外植
体先形成少量愈伤组织和根,再产生不定芽,进而形成
再生苗。其中第1种途径的芽诱导率达到99.0%,根
诱导率达到98.81%;第2种途径中芽诱导率达到
90.4%,根诱导率达到100%。徐全乐等[9]又以茎段和
根为外植体证实大岩桐的离体再生过程确实存在2种
分化途径。张肯定[22]进一步研究了不同浓度的NAA
对大岩桐先生根再生途径的影响,并指出单一的NAA
即可诱导大岩桐的再生。
目前,国内已有较多大岩桐组织培养成功的相关
报道[4,13-18],但这些报道多采用较复杂的培养基配方,
需多次继代培养。绝大部分报道在诱导愈伤组织时添
加0.3~4.0mg/L BA和0.01~0.2mg/L NAA,然后
转到添加2.0mg/L BA和0.01~0.2mg/L NAA的
MS培养基上进行芽分化和增殖培养[4,23]。但唐伟斌
等[24]认为,诱导分化和继代增殖可使用相同配方的培
养基,这就为简化培养过程提供了依据。Xu等[21]和
徐全乐等[9]在大岩桐的组织培养中建立了一步法,即
从愈伤组织的诱导到不定芽的分化再到不定根的形成
过程中均只使用了1种配方的培养基,并且培养期间
不需要更换培养基,从而极大的简化了操作流程,并取
得了90%以上的芽分化率。
2 大岩桐离体再生过程中的培养条件
2.1 培养方式
大岩桐快繁成功的报道很多,其中绝大部分都使
用了固体培养基[9,22],并取得了良好的效果。但也有
用液体培养基的报道[10,25]。研究发现,液体静置培养
有利于降低成本,增加增殖倍数[10,25];但培养分化的芽
非常纤细[10],不利于后续生根移栽。王鸿鹤等[26]采用
液体悬浮振荡培养(80r/min)进行快速繁殖重瓣大岩
桐,显著提高了大岩桐的分化速度和分化率,得到更多
的再生苗,并且与单纯用固体培养相比变异率并没有
明显的改变。Nhut A T等[27]设计了试管状尼龙膜培
养系统,获得了100%的芽分化率;但由于该种方式需
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要额外的设备而没有得到广泛推广。
2.2 培养基
在大岩桐的组织培养中,以 MS基本培养基的使
用最为频繁;也有人以B5为基本培养基的,但效果不
如MS[10,28]。王福银[29]分别以MS、1/2MS和SH为基
本培养基对重瓣大岩桐进行试验。结果表明,基本培
养基对重瓣大岩桐试管苗芽的分化生长影响显著;在
1/2MS和SH基本培养基上生长的试管苗增殖倍数仅
分别相当于 MS的68%和73%,而且生成的试管苗叶
色淡、光泽差、叶形小而薄;在 MS基本培养基上生长
的试管苗则叶形正常,叶色浓绿,生长健壮。故初步认
为大岩桐组织培养需较高质量浓度的矿质营养[28]。
周钟信等[30]在 MS培养基上增大有机成分比重,对分
化芽的培育壮苗起到了很好的作用。黄小荣等[15]利
用改良ER配方,添加0.5mg/L BA和0.25mg/L
NAA使腋芽分化出不定芽;但叶片、花梗等均未分化。
不论采用哪种基本培养基,7%左右的琼脂都是培
养基固化的首选。但邵果园等[31]在建立大岩桐无性
繁殖体系时使用5.8g/L的卡拉胶代替琼脂作为凝固
剂。翟红莲等[32]则研究了不同凝固代替剂对大岩桐
分化的影响;结果表明,利用卡拉胶和魔芋胶组合替代
琼脂,可以促进分化;而利用卡拉胶和魔芋胶或黄原胶
组合做凝固剂,则可以促进愈伤组织大小和长势。可
能是复合凝固剂满足了植物生长期的营养所需。
2.3 培养条件
一般认为,大岩桐再生的最适培养条件为:温度
(25±3)℃,光照强度1 500~2 000lx,光照时间10~
12h[33]。其中温度对芽的诱导有较大的影响,过高和
过低都会影响细胞的增殖与分化[34]。光照条件要求
相对较弱,但也有研究使用较高[15-16,28]或较低光照强
度(1 200lx)[35]以及较长光周期[9,11]并取得成功。
3 大岩桐的离体再生
3.1 外植体
外植体的选择在植株再生中起到十分关键的作
用[36]。在单瓣大岩桐的组织培养中,以子叶[37]、下胚
轴[37]、叶 片[4-5,9,14,20-21,27,31,38-41]、叶 柄[9,16,22,42-43]、茎
尖[5,39,44-45]、腋 芽[15,45-46]、茎 段[4,31,39,47]、根[9,22]和 花
柄[48]做外植体的都有报道。在重瓣大岩桐的组织培
养中,叶片[13,26,49-51]、嫩茎[50]、茎尖[52]等也都可以诱导
形成愈伤组织及再生小植株。但不论是哪种大岩桐品
种,选择叶片做外植体的都占大多数。这主要是因为
叶片取材较为方便,对母株影响较小;同时可以得到
99%以上的较高再生频率[9];从叶片分化而来的再生
苗也更易生根[53]。因此,叶片是大岩桐离体再生培养
研究的最适外植体[9]。
一般而言,幼嫩叶片有利于再生。王鸿鹤等[26]选
用重瓣大岩桐第3、4片幼叶,朴日子等[51]选用顶端
1~2节新展开的嫩叶进行重瓣大岩桐的离体再生,都
取得了较好的效果;并发现幼叶在不定芽萌发时间、芽
分化率和芽的数量上明显优于完全展开的老叶[51]。
而叶片的背腹性对于分化也有一定的影响[14,26,54-55]。
外植体处理是影响其存活的重要因素。由于大岩
桐叶表面密披绒毛,细菌易隐藏其中并滋生,导致外植
体在培养过程中污染率较高[34]。所以,大岩桐叶外植
体的适宜消毒方式为:剪取幼嫩叶片,用毛刷蘸自来水
(可加少量表面活性剂)清洗,然后在超净台上进行常
规表面消毒。一般采用70%酒精30~45s,0.1%升汞
8~10min并不停振荡,最后用无菌水冲洗3次
以上[26,34]。
3.2 愈伤组织诱导
绝大部分研究表明,大岩桐的再生要经过愈伤组
织诱导阶段[56];偶而也有外植体不经愈伤组织而直接
分化的报道[56],但不占据主流地位。在无激素基本培
养基上,大岩桐外植体没有愈伤组织形成[43]。若在基
本培养基上单独添加低浓度BA即可诱导愈伤组
织[31,55],诱导率可达95%以上[43]。在诱导愈伤组织
时,很多报道都添加了2,4-D,并认为2,4-D的极小差
异就会造成愈伤组织的极大差异[50]。侯卓婕等[18]以
BA分别和NAA、IBA、2,4-D组合诱导愈伤组织后指
出:在有低浓度BA存在条件下,愈伤组织诱导效率为
2,4-D>IBA>NAA。但研究发现,加入2,4-D虽然有
利于愈伤组织的形成[19,26],却不利于芽的分化[26]。而
当BA浓度不变时,NAA 较IBA更有利于芽的分
化[18,49]。因此,BA与NAA是大岩桐愈伤组织诱导的
最佳激素组合[14]。
就愈伤组织形态而言,有淡绿色愈伤组织[18,31]、颗
粒状愈伤组织[21,41]、黄白色愈伤组织[17]、浅红绿色愈
伤组织[24]、淡黄绿色愈伤组织[11,43]和白色愈伤组织[57]
等。但不论哪种愈伤组织形态,最终均可分化出不定
芽。显微分析发现,以叶片为外植体诱导的愈伤组织
起源于叶肉细胞[5];其余外植体诱导的愈伤组织起源
鲜有报道。
3.3 芽分化和增殖培养
众所周知,外植体的分化能力取决于基本培养基
上添加物质的种类和浓度[37]。有研究报道,单独使用
1.0mg/L BA即可诱导大岩桐不定芽的分化[55]。刘
雪莲等[46]也采用单独添加BA的方法诱导大岩桐产生
不定芽,但只取得了58.8%诱导率,效果不如复合培养
基。何家涛等[58]在大岩桐芽分化时采用了TDZ,并发
现当TDZ浓度为1.0mg/L时,分化率与增殖系数较
高,分化率可达92.5%;当TDZ>2.0mg/L时,丛生芽
会发生玻璃化现象,增殖受到一定抑制。王秀英等[57]
在重瓣大岩桐组织培养中使用 KT替代BA,取得
88.7%的芽诱导率。进一步研究BA、KT和TDZ在不
定芽增殖过程中的效果发现,不论是芽增殖还是芽苗
的生长状态,BA均优于KT[5,51]和TDZ[51];并且随着
BA浓度增大,增殖系数也增大;但当BA浓度大于
2.0mg/L时,增殖系数和平均株高呈下降趋势[51]并易
引起玻璃化[16,31]等变异现象。侯卓婕等[18]的试验结
果也证实了该观点,不过认为当BA浓度大于3.0mg/L
时,增殖倍数才会下降。这可能与所选的外植体类型
不同有关。
在选用何种激素与BA组合进行芽的诱导时,
90%以上的研究都选用NAA,但也有选用其它激素的
报道。庞基良等[35]利用细胞分裂素协同赤霉素促进
离体培养大岩桐花蕾并使花萼切块高频率直接再生花
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芽[59]。王秀英等[57]在重瓣大岩桐组织培养芽分化和
增殖培养阶段添加了1.0mg/L的GA3,并认为附加
GA3对分化和增殖培养基中的KT和NAA活性有增
效作用。除此之外,还有BA与IAA组合[5],BA与
IBA组合[58]等。但在大岩桐的不定芽诱导过程中,首
选的是BA和NAA组合。这主要是由于BA与NAA
组合有利于外植体的脱分化与再分化,其最佳浓度组
合为BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L[10,14,26,42,51],再生
频率可达96.67%[51]。
总体而言,大岩桐属于比较容易进行组织培养的
物种,可能是因为大岩桐的内源激素水平较低[30],使
其在再生过程中对生长调节物质的要求不是非常严
格[10,28],添加一定量的复合激素即可取得良好效果。
但也有一些研究在上述激素组合的基础上进一步添加
其它介质并研究其对大岩桐再生的影响。如添加番茄
汁会使试管苗基部产生大量愈伤组织但抑制芽的分化
和生长[60];添加活性炭对大岩桐试管苗的增殖具有抑
制作用[37,60],但再生苗的叶数目和叶面积都有所增大,
有利于进一步的移栽[37];较低浓度(50和100mg/L)
的氯化胆碱有利于大岩桐不定芽的快速分化[61]等。
朴日子等[51]在增殖阶段还添加了500mg/L的LH(水
解乳蛋白)。
3.4 生根及移栽
大岩桐做为宿根植物,其再生苗生根相对容易。
王树耀等[43]在 MS基本培养基上添加0.2mg/L的
NAA,获得了100%的生根率。朴日子等[51]将 MS培
养基无机盐浓度降低到1/4后也获得了100%生根率。
但大部分报道在生根培养时采用1/2MS为基本培养
基。在不加激素的1/2MS培养基上,就可得到70%~
83%的生根率[17,31],只不过生根较慢且根系较弱[31]。
但有研究表明,添加外源生长素对于大岩桐试管苗的
生根是必须的[39]。这种矛盾可能是由于前期培养时
所采用的激素组合不同所致。Xu等[21]发现,在长期
的组织培养和继代过程中,大岩桐再生苗的内源激素
水平会发生一定程度的改变,进而影响生根。对于大
多数研究而言,都采用了基本培养基添加一定浓度生
长素的办法诱导生根。如在1/2MS培养基上添加低
浓度的NAA[28,57]即可促进生根,生根率可达96%以
上[57];但当NAA浓度超过0.5mg/L时,再生苗根部
易愈伤化,产生的根量多但不健壮。研究表明,以IBA
为诱导激素进行生根培养时,其浓度为1.0mg/L时都
不会产生愈伤化,且生成的根系健壮[26]。从生根效果
和根系生长状况来看,IBA的效果明显优于NAA[51];
利用0.4~0.5mg/L的IBA可获得100%的生根
率[31,51]。张艳萍等[20]也认为利用NAA生根时不易形
成主根,生成的气生根居多;而IAA生根效果较好。
但任如意等[13]认为利用NAA或IBA生根的形态几乎
没有区别。在诱导生根过程中,绝大部分报道都采用
单一生长素,但也有报道利用IBA和NAA组合[18]或
IAA和NAA组合[30]诱导生根,并取得良好的效果。
但总体而言,采用NAA做为单一激素诱导生根操作
较为简便、生根率较高,是大岩桐再生苗诱导生根的较
好选择。
在生根培养基中,一般都添加30g/L的糖,但也
有人认为1/2MS+15g/L的糖是最佳生根培养基[62]。
在此基础上,有研究发现添加适量的多效唑[47]或氯化
胆碱[61]可以促进根伸长和粗壮生长;而加入活性炭后
生根速度明显加快[26]。秦廷豪等[10]在生根时添加爱
多收(主要成分为单硝化愈创木酚钠)也取得较好
效果。
大部分研究在大岩桐不定芽产生后都采用了上述
生根方法并取得理想效果。孙仲序等[63]采用滤纸桥
生根技术,生根率为97.2%,生根数为18条,生根天数
为3d。李建民等[11]在生成大岩桐不定芽后,直接将
其切 割 为 单 芽,转 入 到 添 加 0.5 mg/L IBA 的
Hoagland营养液中,保湿进行生根和壮苗培养,约35d
后,生根率可达96%以上。除此之外,还有一些研究使
得外植体或再生无根苗直接生成块根[64-66]。赵小梅
等[66]利用NAA和IBA组合,从叶片外植体上成功诱
导块根,诱导率可达100%。孙静秋等[64]利用附加
0.2mg/L NAA的1/2MS培养基直接诱导再生无根
苗形成了块根。研究表明,添加5%蔗糖、1.5%活性炭
以及采用液体悬浮振荡培养最有利于大岩桐试管结球
和球根生长[64];其中添加活性炭还可以缩短试管结球
时间[64]。而戴黎鸣等[65]发现食用白糖可代替蔗糖,并
具有相同的促进效果。研究还发现[65],外植体类型、
光照条件以及ΒA浓度对大岩桐试管块茎形成都具有
明显影响。其中,叶外植体比顶芽更有利于块茎的形
成,全光照条件更有利于块茎的形成,而ΒA则会抑制
块茎的形成。
再生苗生根后,就要进行练苗移栽,该过程中很重
要的一点就是选择移栽的基质。适宜的基质有利于大
岩桐球根的形成,根系发生及其功能的恢复[64]。李发
虎等[3]比较了不同基质对大岩桐的移栽成活率影响发
现,松针土是最适宜于大岩桐成活的基质,这可能是由
于松针土质地疏松,保水保肥性较好。钱仁卷等[67]研
究了大岩桐移栽的影响因素发现,大岩桐练苗的合适
方法是将瓶苗先放入外界环境练苗3d,再揭开封口膜
练苗2d,洗净培养基后移栽至腐质土∶椰糠∶珍珠
岩=1∶1∶2的混合基质中,并喷洒多菌灵。
4 大岩桐组织培养过程中出现的其它现象
4.1 褐变
褐变是植物组织培养中常见的一种不利现象,通
常与外植体的种类、取材与处理、培养基的组成及培养
条件等多种因素相关[68]。在大岩桐的组织培养过程
中,当继代周期过长时就易出现褐变现象[43,69]。如在
外植体处理时使用0.7%PVP则可有效防治外植体褐
变,提高分化率[13]。
4.2 休眠
在继代4代后,大岩桐试管苗就会出现休眠现
象[23,70]。该现象和大岩桐在自然生长过程中的休眠现
象具有一定的关联,推测继代过程中出现的休眠现象
是由于细胞生物种的作用引起的[23]。进一步的生理
生化检测表明,休眠苗叶片的叶绿素a合成受阻、过氧
化物酶含量升高[23]。周根余等[23]认为休眠的内在因
素是由于植物体内的生长素水平降低所致。
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如在继代过程中采用 MS培养基[70]、降低蔗糖浓
度[23,70]、利用NAA处理[23]、对试管苗进行低温(15℃)
黑暗预处理10d等方法能在一定程度上降低试管苗
休眠的发生[23,50,70];但培养基的pH变化对试管苗的
休眠现象基本没有影响[23,70]。
4.3 变异
观赏植物植物离体繁殖后的遗传稳定性是组织培
养技术应用的关键因素之一。Scaramuzzi等[5]发现,
大岩桐组培苗的染色体数目确实和母株保持一致。但
长期的继代培养会引起再生苗的形态改变[21]。张树
宝等[70]在继代4代后,发现大岩桐试管苗出现超度含
水态苗。庞基良等[71]在重瓣大岩桐的组织培养过程
中发现了6种同源异型花,其变化部位主要集中于花
瓣;并推测是移栽操作影响了花型。
在组织培养的过程中,比较容易出现体细胞无性
系变异[72],这种变异方式已经发展成为多种植物种质
资源创新和良种选育的有效途径[73-74]。Xu等[21]报道
了大岩桐进行连续组织培养后,筛选得到的twp
(Tricussate whorled phylotaxis)突变体及花的同源异
型现象[9,21]。并对twp突变体进行了生理分析,认为
其内源生长素和赤霉素含量都有下降[21]。胡鑫等[41]
重点报道了大岩桐组织培养过程中产生的叶型改变,
并认为这种改变可能是由于大岩桐长期的组织培养和
多次继代使得再生植株的内源激素水平发生改变而造
成的。这些变异为大岩桐新品种的选育奠定了良好的
基础。
5 大岩桐组织培养技术的应用
欧洲国家在大岩桐遗传育种方面起步较早,开发
出了一些新品种;而我国在这方面刚刚起步,并且育种
主要靠传统的品种杂交方法,限制了大岩桐产业的发
展[75]。而在组织培养基础上进行诱变[76]、基因转
化[56,77]、试管嫁接[78]等是可行的遗传育种方法。王鸿
鹤等[76]通过组织培养与秋水仙碱诱导相结合的技术
途径成功培育重瓣大岩桐多倍体植株。宋俊芳等[56]
利用农杆菌介导的叶盘转化法将绿色荧光蛋白导入大
岩桐中,PCR及点杂交的结果表明,外源基因成功转入
到大岩桐基因组中。赵万苓等[77]也将查尔酮合酶基
因导入重瓣大岩桐中。但是这些研究都没有报道稳定
遗传的大岩桐新品系。最近,张明哲等[53]将CFL基因
导入大岩桐中,并得到提早开花植株。邵果园等[78]利
用试管嫁接技术成功进行了大岩桐与鸡冠花的远缘杂
交,但杂交植株生长缓慢。因此,大岩桐的育种工作仍
然任重而道远。
总体而言,大岩桐的组织培养已经取得阶段性成
果。从愈伤组织诱导、不定芽的分化、根的诱导等方面
都相对成熟并得到较高的分化率。其中,一步法组培
体系的建立极大的简化了操作流程,为工厂化育苗奠
定了良好的基础,有利于其迅速推广应用并为苦苣苔
科其它种属的组培模式提供借鉴。在大岩桐组织培养
的基础上,利用诱变、基因转化和试管嫁接等技术虽然
得到了一定数量的表型变化,但可遗传的稳定性状较
少。因此,开发新的大岩桐观赏品种将是未来研究的
重点内容之一。
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Research Progress on Tissue Culture of Gloxinia
XU Quan-le
(Colege of Life Sciences,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling,Shaanxi 712100)
Abstract:Research status on tissue culture of Sinningia speciosa was reviewed including the pathways,process,
medium component and browning,dormancy,somaclonal variation during the process of tissue culture.Meanwhile,the
problems and prospects were also discussed to provide references for further studies.
Key words:Sinningia speciosa;tissue culture;research status;research prospects
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