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响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺



全 文 :44 2014, Vol.35, No.04 食品科学 ※工艺技术
响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺
杨 艳,任亚梅*,马 婷,周九庆,查 晶,张哲学
(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100)
摘 要:为优化猕猴桃根熊果酸的超声波提取最佳工艺,在单因素试验基础上,选择乙醇体积分数、液料比、提
取时间、提取温度为自变量,熊果酸得率为响应值,利用中心组合试验法和响应面分析法,研究各自变量交互作
用及其对熊果酸得率的影响,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明:当超声功率225 W、超声频率
40 kHz时,超声波提取熊果酸工艺最佳条件为乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1(mL/g)、提取时间23.2 min、提
取温度79.1 ℃。此提取条件下,熊果酸得率达到2.014%,与模型预测值之间具有较好的拟合性,且提取液中熊果酸
的纯度为49.7%。
关键词:猕猴桃根;熊果酸;超声波提取;响应面分析
Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Ursolic Acid from Roots of Actinidia chinensis
Using Response Surface Analysis
YANG Yan, REN Ya-mei*, MA Ting, ZHOU Jiu-qing, ZHA Jing, ZHANG Zhe-xue
(College of Food Science and Engineering, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)
Abstract: In this study, the conditions for ultrasonic-assisted extraction of ursolic acid (UA) from the roots of Actinidia
chinensis were optimized by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments, a mathematical
regression model was established indicating the effect of ethanol concentration, solv ent/solid ratio, extraction time and
temperature on the extraction yield of UA by response surface central composite design. Under the conditions of 225 W and
40 kHz, the optimum extraction conditions determined were as follows: 73.8% ethanol concentration, 7.80:1 solvent/solid
ratio (mL/g), 23.2 min and 79.1 ℃. Under these conditions, the experimental extraction yield of UA was 2.014%, which is
well matched with the predicted value, and the purity of UA in the extract was 49.7%.
Key words: Actinidia chinensis root; ursolic acid; ultrasonic-assisted extraction; response surface analysis
中图分类号:TQ929.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)04-0044-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201404010
收稿日期:2013-02-18
基金项目:西北农林科技大学科技创新与成果转化项目(Z222021313)
作者简介:杨艳(1988—),女,硕士,研究方向为果蔬功能性成分的分析与提取。E-mail:330579453@qq.com
*通信作者:任亚梅(1970—),女,副教授,博士,研究方向为果品蔬菜的贮藏及加工。E-mail:yameiren@yahoo.com
猕猴桃根是一种肉质根,多为侧根和水平根,无主
根[1]。根中主要含有β-谷甾醇、抗坏血酸、熊果酸、齐墩
果酸、琥珀酸和胡萝卜苷等成分,并富含Fe、Cu、Mn和
Se等元素。猕猴桃根具有清热消毒、利尿和活血消肿的
功效,民间常用于治疗肝炎、水肿、跌打损伤、风湿关
节痛、乳汁不足、淋虫、带下、疮疖和瘰疬等疾病[2]。目
前,与国内外对猕猴桃、猕猴桃 籽油等研究的比较广泛
和深入相比,猕猴桃根方面的研究便显得十分有限。
熊果酸(ursolic acid,UA)又称为乌苏酸或乌索
酸,是一种弱极性的五环三萜酸。其分子式为C30H48O3,
相对分子质量为456.68,在自然界分布很广,并且是多种
天然产物的功能性成分。熊果酸在山茱萸、山楂、猕猴
桃根、车前草、女贞子等药用植物中广泛分布[3-4]。已有
研究[5-12]表明,熊果酸具有较广泛的药理和生物学作用,
如降血脂、抗菌、抗病毒、抗癌、抗艾滋病、免疫活性
等作用。熊果酸的传统提取方法有索氏提取、回流提取
等,近年来在提取工艺方面引入了一些新方法如超临界
CO2流体萃取[13]、微波提取[14]、超声提取[15-17]、分子蒸
馏技术等。超声提取作为一种先进的提取方法,具有提
取时间短、能耗低、效率高等特点。目前采用响应面设
计优化熊果酸提取工艺的报道较少。本研究以农民入冬
前修剪的秦美猕猴桃根粉为原料,对秦美猕猴桃根粉乙
醇溶液进行超声波处理,利用超声波的空化作用、热效
应、机械作用加速细胞壁的破碎,促进细胞内物质的释
放、扩散及溶解,缩短提取时间[17],以熊果酸得率为评
价指标,在乙醇体积分数、液料比、提取时间、超声功
※工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.04 45
率、提取温度等单因素试验基础上,利用响应面分析法
优化超声波提取熊果酸的工艺条件,以期为开发利用猕
猴桃根资源及工业化生产熊果酸提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
秦美猕猴桃根,于2011年10月采自陕西省周至县丁
麻村一管理良好的猕猴桃园。首先,将猕猴桃根用清水
冲洗3遍;然后,将根茎切至5 cm以下,60 ℃恒温干燥
48 h,控制其含水量为8%;最后,用多功能中药粉碎机
粉碎,粉体过60目筛,将筛下物用0.05 mm厚的PE密封
袋包装,在低温(0~10 ℃)条件下保存。
熊果酸标准品 上海金穗生物科技有限公司;无水
乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯、高氯酸、石油醚均
为分析纯。
1.2 仪器与设备
WFJ7200紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有
限公司;HWSYⅡ-K恒温水浴锅 北京长风仪器仪表公
司;DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪
器有限公司;KQ 250DE数控超声波清洗器 昆山市超
声仪器有限公司;SHB-Ⅲ(A)循环水真空泵 河南省
太康县科教仪器厂;FW100型高速万能粉碎机 天津市
泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
猕猴桃根→清洗→粉碎→过筛(60目)→除杂→乙
醇溶解→超声波提取→静置→抽滤→稀释→定容→待测
提取液
1.3.2 提取方法
分别称取2.00 g过60 目筛的除杂后的猕猴桃根粉,
加入一定量、一定体积分数的乙醇浸提液,置于250 mL
三角瓶中摇匀,在一定功率条件下超声波(频率为
40 kHz)处理一定时间后,静置l h,抽滤得含有熊果酸
的乙醇溶液上清液,取0.5 mL上清液移至10 mL容量瓶
中,并用相应提取体积分数的乙醇溶液定容。取0.2 mL
的稀释液移至试管中,置于90 ℃水浴锅中使乙醇蒸干,
得到猕猴桃根中熊果酸粗提物的待测样品。
1.3.3 熊果酸测定
称取熊果酸标准品0.010 0 g,用无水乙醇定容至
100 mL容量瓶中,即得0.1 mg/mL的熊果酸标准溶液。精
确取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL熊果酸
标准溶液分别于具塞试管中,各具塞试管均放入90℃水
浴锅中,挥发掉具塞试管中的乙醇溶剂,各具塞试管中
分别加入5%香草醛-冰醋酸0.3 mL和高氯酸0.7 mL,置于
60 ℃水浴中加热15 min,取出冷却后移至5 mL聚酯试管
中,用99.5%的乙酸乙酯定容至5 mL,摇匀后在549 nm波
长处测定吸光度[18]。以吸光度为纵坐标,熊果酸质量浓
度为横坐标,绘制标准曲线,得出熊果酸标准回归方程
为:Y=0.045X-0.012 2(R2=0.998 6),熊果酸标准品在
6~20 μg/mL质量浓度范围内呈线性关系。将超声波提取
后的样品,按以上测定方法,以无样品液的实验做空白
参比,测定吸光度,由熊果酸标准曲线得出待测溶液中
熊果酸的质量浓度ρ。熊果酸得率的计算公式为:
X/%=(ρ×D×V/m)×100
式中:X为熊果酸得率/%;ρ为待测溶液中熊果酸的
质量浓度/(μg/mL);V为待测溶液的体积/mL;D为稀
释倍数;m为猕猴桃根粉的质量/g。
1.3.4 试验设计
采用Design-Expert统计软件设计并分析试验数据。
依据四因素中心组合设计(central composite design,
CCD),见表1,考察乙醇体积分数、液料比、提取时
间、提取温度对熊果酸得率的影响。
表 1 试验设计方案因素水平
Table 1 Factors and levels used in quadratic orthogonal rotation
combination design
水平
因素
X1乙醇体积分数/% X2液料比(mL/g) X3提取时间/min X4提取温度/℃
-2 65 4∶1 10 40
-1 70 6∶1 20 50
0 75 8∶1 30 60
1 80 10∶1 40 70
2 85 12∶1 50 80
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对熊果酸得率的影响
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
65 70 75 80 85
Э䝛ԧ⿃ߚ᭄/%





/%
图 1 乙醇体积分数对熊果酸得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid
在超声功率225 W、液料比10∶1、温度50 ℃、提取
30 min的条件下,乙醇体积分数对熊果酸得率有显著影
响,如图1所示,随着乙醇体积分数的增加,熊果酸得率
先增加后降低,当乙醇体积分数为75%时,熊果酸得率
最大,为1.448%,其原因可用相似相溶原理解释,当提
46 2014, Vol.35, No.04 食品科学 ※工艺技术
取溶剂的极性与熊果酸的极性接近时,得率最高,由此
可以推测75%的乙醇水溶液的极性与猕猴桃根中熊果酸
的极性最接近,所以乙醇体积分数在75%左右为宜,即
选取75%为自变量乙醇体积分数的零水平。
2.1.2 液料比对熊果酸得率的影响
在超声功率225 W、乙醇体积分数75%、温度
50 ℃、提取30 min的条件下,液料比对猕猴桃根中熊果
酸得率的影响见图2,随着溶剂添加量的增加,熊果酸
的得率先增后迅速减小,当液料比达到8∶1时,浸提可达
到比较理想的效果,原因可能是随着液料比的增大,熊
果酸在整体溶剂中的比例迅速减小,不利于熊果酸的提
取。所以液料比8∶1左右为宜,即选取8∶1为自变量液料
比的零水平。
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
4IJ1 6IJ1 8IJ1 10IJ1 12IJ1
⏢ᯉ∄˄mL/g˅





/%
图 2 液料比对熊果酸得率的影响
Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of ursolic acid
2.1.3 提取时间对熊果酸得率的影响
在超声功率225 W、乙醇体积分数75%、液料比
8∶1、温度50 ℃时,超声波提取时间对熊果酸得率的影响
见图3,在超声波提取10~30 min内,熊果酸得率呈上升
趋势,提取时间达到30 min时,得率达到最大值1.64%;
当提取时间超过30 min后,得率开始下降。原因可能为
由于超声波提取时间太短,熊果酸不能全部迅速游离到
溶剂中,超声波提取时间过长,除熊果酸以外的醇溶性
物质充分游离至溶剂中,从而与熊果酸竞争溶剂,使得
熊果酸的得率下降,故提取时间以30 min为宜。所以,
选取30 min为自变量时间的零水平。
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
10 20 30 40 50 60
ᨀਆᰦ䰤/min





/%
图 3 提取时间对熊果酸得率的影响
Fig.3 Effect of urtrasonic treatment time on the extraction yield of
ursolic acid
2.1.4 超声功率对熊果酸得率的影响
在温度50 ℃、乙醇体积分数75%、液料比8∶1、提
取时间30 min的条件下,超声功率对熊果酸得率的影响
见图4。由图4可知,功率在125~250 W之间,随着超声
功率的升高,熊果酸得率呈上升趋势,通过对225 W与
250 W功率条件下熊果酸得率的显著性分析,发现得率并
无显著的升高,考虑到设备在最大功率下运行对其寿命
的影响,故选择225 W作为提取熊果酸的超声功率。以下
试验中超声功率均为225 W。
1.30
1.35
1.40
1.45
1.50
1.55
125 150 175 200 225 250
䍙ໄࡳ⥛/W





/%
图 4 超声功率对熊果酸得率的影响
Fig.4 Effect of urtrasonic power on the extraction yield of ursolic acid
2.1.5 提取温度对熊果酸得率的影响
在超声功率225 W、乙醇体积分数75%、液料比
8∶1、超声时间30 min的条件下,提取温度对熊果酸
得率的影响见图5。由图5可知,提取温度在40~60 ℃
时,熊果酸得率迅速上升,在60 ℃时达到最大值
1.652%,但随着温度的继续升高,熊果酸得率开始下
降并最终趋于平衡,这可能是由于在升温和机械波作用
下,熊果酸结构遭到破坏,造成得率下降。因此,最佳
提取温度应在60 ℃附近,选取60 ℃为自变量温度的零
水平。
1.35
1.40
1.45
1.50
1.55
1.60
1.65
1.70
40 50 60 70 80
ᨀਆ⑙ᓖ/ć





/%
图 5 提取温度对熊果酸得率的影响
Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction yield of ursolic acid
2.2 响应面试验
2.2.1 模型优选
根据四因素中心组合设计,于中心点重复12次共计
30次试验,结果见表2,对该模型进行方差分析,结果见
表3。将试验结果输入Design-Expert系统,并寻找合适的
回归方程。
※工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.04 47
表 2 四元二次回归通用旋转组合试验结果
Table 2 Results of four-variable quadratic orthogonal rotation
combination design
试验号 X1 X2 X3 X4
Y熊果酸得率/%
实际值 预测值
1 -1 1 1 1 1.514 1.50
2 -1 -1 -1 1 1.779 1.76
3 1 -1 -1 -1 1.597 1.58
4 1 -1 1 1 1.676 1.65
5 1 1 -1 1 1.296 1.31
6 -1 1 -1 -1 1.301 1.30
7 -1 -1 1 -1 1.354 1.31
8 1 1 1 -1 1.438 1.43
9 -1 -1 -1 -1 1.534 1.52
10 1 1 -1 -1 1.381 1.37
11 -1 1 -1 1 1.679 1.65
12 -1 -1 1 1 1.733 1.71
13 1 1 1 1 1.457 1.44
14 -1 1 1 -1 1.526 1.52
15 1 -1 -1 1 1.889 1.86
16 1 -1 1 -1 1.748 1.74
17 0 2 0 0 0.887 0.89
18 0 0 0 2 1.815 1.85
19 0 0 -2 0 1.557 1.58
20 -2 0 0 0 1.172 1.21
21 0 0 0 -2 1.558 1.58
22 0 -2 0 0 1.261 1.32
23 0 0 2 0 1.551 1.59
24 2 0 0 0 1.192 1.21
25 0 0 0 0 1.893 1.93
26 0 0 0 0 1.904 1.93
27 0 0 0 0 1.924 2.03
28 0 0 0 0 2.015 2.03
29 0 0 0 0 1.869 1.84
30 0 0 0 0 1.988 1.84
表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0.25 14 0.14 33.62 <0.000 1 **
X1 1.92 1 5.305×10-61.303×10-3 0.971 8
X2 5.305×10-6 1 0.27 66.26 <0.000 1 **
X3 0.27 1 1.946×10-4 0.048 0.830 3
X4 1.946×10-4 1 0.10 24.90 0.000 2 **
X1
2 0.67 1 0.67 164.30 <0.000 1 **
X2
2 0.92 1 0.92 225.99 <0.000 1 **
X3
2 0.11 1 0.11 26.91 0.000 2 **
X4
2 0.025 1 0.025 6.10 0.028 2 *
X1X2 0.046 1 0.046 11.39 0.005 0 **
X1X3 3.298×10-3 1 3.298×10-3 0.81 0.384 5
X1X4 0.034 1 0.034 8.41 0.012 4 *
X2X3 0.014 1 0.014 3.42 0.087 3
X2X4 0.013 1 0.013 3.11 0.101 3
X3X4 0.023 1 0.023 5.57 0.034 6 *
残余项 0.053 13 4.072×10-3
失拟项 0.042 10 4.165×10-3 1.11 0.526 5
纯误差 0.011 3 3.761×10-3
总和 2.22 29
注:**.影响极显著,P< 0.01;*.影响显著,P< 0.05。
由表3可知,模型P值小于0.01,表示模型高度显
著,而失拟项不显著(P>0.05),预测值与试验值之间
有较好的相关性,决定系数R2=0.973 1,因此,采用响应
曲面法进行猕猴桃根粉熊果酸的提取试验设计所得回归
模型是有效的。X2、X4、X12、X22、X32、X1X2对应的P值
小于0.01,说明其对结果影响极显著;交互项X42、X1X4、
X3X4对应的P值小于0.05,说明其对结果影响显著;X1、
X3、X1X3、X2X3、X2X4对结果影响不显著。
根据庄恒扬等[19]因素重要性分析方法,综合考虑各
因子的线性、二次及交互作用三方面的影响,在试验考
察范围内,各因素对熊果酸得率的影响为:液料比>提
取温度>提取时间>乙醇体积分数。
2.2.2 回归方程的建立与检验
对试验数据用二次多项式拟合后,得到因子编码值
回归方程和实际值回归方程为∶
Ý=1.93-0.000 5X1-0.11X2+0.003X3+0.065X4-
0.054X 1X 2+0.014X1X 3-0.047X 1X 4+0.030X 2X 3-
0.028X2X4-0.040X3X4-0.15X12-0.18X22-0.054X32-
0.021X4
2 (1)
Y=1.932-0 .000 5X 1-0 .107X 2+0.003X 3+
0 .065X 4-0 .054X 1X 2+0 .014X 1X 3-0 .047X 1X 4+
0.030X 2X 3-0 .028X 2X 4-0 .038X 3X 4-0 .156X 12-
0.183X2
2-0.063X32-0.030X42 (2)
回归方程的拟合程度可通过决定系数R2和R2校正值
来验证[20],此处R2校正值为0.944 2,表明在熊果酸超声
波提取工艺研究中,大约有94.4%的变异分布在所研究的
4个因子当中,另有5.6%的变异不能由该模型来解释。
相关系数R=0.973 1,表明熊果酸得率的实际值与预测值
(表2)之间具有很好的拟合相关性。
2.2.3 响应面分析优化提取条件
2.1
1.6
1.1
0.6
0.1
2
1
0
1
2 2
1
0
1
2❞




/%
X
2
X 1
2
1
1
2
2 1 0 1 2
0X 2
X1
❞ᵰ䝌ᕫ⥛/%
1.046 6
1.046 6
0.745 211
1.346 98
1.346 981.647 35
6
图 6 乙醇体积分数和液料比交互影响熊果酸得率的响应曲面及等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of solvent-to-solid
ratio and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid
48 2014, Vol.35, No.04 食品科学 ※工艺技术
经统计分析,模型总效应F=33.62,P<0.000 1,说
明各因素间有交互作用。根据上述回归方程作各因素间
交互作用的响应曲面和等高线如图6~8所示。等高线的
形状可直观地看出交互效应的大小,椭圆形反映了两因
素的交互作用较强,而圆形则相反[21]。





/%
X
4
X 1
2
1
0
1
2 2
1
0
1
2
2.100
1.775
1.450
1.125
0.800
2
1
1
2
2 1 0 1 2
0X 4
X1
❞ᵰ䝌ᕫ⥛/%
1.420 51
1.604 35
1.788 19
1.052 84
1.236 66
1.420 51
1.604 35
6
图 7 乙醇体积分数和提取温度交互影响熊果酸得率的
响应曲面及等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of extraction
temperature and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid
2.020 0
1.832 5
1.645 0
1.457 5
1.270 0
2
1
0
1
2 2
1
0
1
2
X
4
X 3





/%
2
1
1
2
2 1 0 1 2
0X 4
X3
❞ᵰ䝌ᕫ⥛/%
1.740 07 1.622 77
1.505 48
1.622 77
1.388 18
1.857 36
6
图 8 提取温度和提取时间交互影响熊果酸得率的响应曲面及等高线图
Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of extraction
temperature and extraction time on the extraction yield of ursolic acid
由图6可知,固定超声提取温度和提取时间,熊果
酸得率随乙醇体积分数和液料比的增加都呈先增加后减
少的趋势。由图7可知,固定液料比和提取时间,熊果酸
的得率随提取乙醇体积分数的增大呈先增加后减少的趋
势;而当乙醇体积分数在低水平时,得率随提取温度的
升高呈增大趋势,当乙醇体积分数在高水平时,得率随
提取温度的升高无明显变化。由图8可知,固定液料比
和乙醇体积分数,熊果酸的得率随提取时间的延长呈先
增加后减少的趋势;而当提取时间在低水平时,得率随
提取温度的升高呈逐渐增加趋势,当提取时间在高水平
时,得率随提取温度的升高无明显变化。
2.2.4 Design-Expert系统的最优提取条件模拟与检验
通过Design-Expert系统对回归方程求解,得到一组优
化方案。在试验的优化水平范围内预测熊果酸提取的最优
条件为:乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1(mL/g)、
提取时间23.2 min、提取温度79.1 ℃,此提取条件下,熊
果酸得率达到(2.018±0.006)%。在此条件下实验重复
3次,得到熊果酸得率的平均值为2.014%,与模型预测
值仅相差0.004%,说明模型预测值与实验值吻合,可用
于指导实际生产。采用大孔树脂法测定熊果酸含量,得
出猕猴桃根提取液中熊果酸的纯度为49.7%。
3 结 论
3.1 利用Design-Expert系统对猕猴桃根熊果酸的超声波
提取工艺4个关键参数作了考察,研究表明在试验考察范
围内,各因子对熊果酸得率的影响为:液料比>提取温
度>提取时间>乙醇体积分数,且这4个因素与熊果酸得
率之间的关系更接近于二次多项式模型。
3.2 此模型的预测值与真实值之间的相关性达94.42%,
模型能够解释94.4%的总变异,即模型在试验范围内能较
准确的预测猕猴桃根熊果酸的得率。
3.3 响应面分析表明猕猴桃根中熊果酸提取的最佳工艺
参数为乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1(mL/g)、提
取时间23.2 min、提取温度79.1 ℃,在此条件下熊果酸得
率可达2.014%,与模型预测值仅相差0.004%,可用于指
导实际生产。在最优提取条件下,参考白新鹏[22]的方法
对最优条件下从猕猴桃根中提取的熊果酸进行纯化,采
用大孔树脂法测定熊果酸含量,得出猕猴桃根提取液中
熊果酸的纯度为49.7%。
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