全 文 ： 2008, Vol. 29, No. 08 食品科学 ※营养卫生594
熊果酸体外细胞毒性及对丙烯酰胺细胞
毒性抑制作用的研究
黄玉艾，王 菲，沈 雪，王 昊，关 爽，卢 静*
(吉林大学军需科技学院食品质量与安全系，吉林 长春 130062)
摘 要：目的：评价不同浓度的熊果酸的体外细胞毒性及其对环磷酰胺和丙烯酰胺细胞毒性的抑制作用。方法：
在培养板上加入不同的受试物。MTT比色法观察细胞的活性以研究细胞增殖率。用分光光度计以490nm波长测光
密度值(OD)。分析并评定熊果酸的毒性级。结果：熊果酸毒性程度无毒级，对丙烯酰胺的抑制作用显著。
关键词：熊果酸；细胞毒性；丙烯酰胺
Cytotoxicity of Ursolic Acidin vitro and Its Inhibition Effect on Cytotoxicity of Acrylamide
HUANG Yu-ai，WANG Fei，SHENG Xue，WANG Hao，GUAN Shuang，LU Jing*
(Department of Food Quality and Safety, College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)
Abstract ：Objective: To evaluate the cyotoxicity of diffirent doses ursolic acid and its inhilition effect on cytoxicity of
acrylamide. Methods: Diffirent test matters were loaded on the culture plate.The viability of cells was evaluated by MTT assay
to investigate cell proliferation. Optical density (OD) was measured by a spectrophotometer at 490 nm. Then the cytotoxicity
grade was evaluated according to the means of cell proliferation and the statistical significance. Result: Ursolic acid is innoxious
to the tested cells. It has great inhibition effect on cyotoxicity of acrylamide.
Key words：u solic acid； ytotoxicity；acrylamide
中图分类号 R994.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)08-0594-03
收稿日期：2008-04-22
作者简介：黄玉艾(1986-)，女，本科生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：fn-huangyuai@163.com
*通讯作者：卢静(1976-)，女，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：x ujing1@yahoo.com.cn
熊果酸(ursolic acid，UA)，又名乌索酸，乌苏酸
是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，以游离形式
或与糖结合成苷的形式分布于约7 个科46个属62种植
物，主要为木犀科植物女贞叶，蔷薇科植物枇杷的叶，
玄参科植物毛泡桐叶，唇形科植物夏枯草的全草，冬
青科冬青属铁冬青的叶以及白舌草、车前草、苦丁茶、
杜香等。具有抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降
低血糖、抗癌、抗促癌等多种生物学效应，熊果酸还
具有明显的保湿功能，因而被广泛地用作化妆品原料。
急性毒性体系可测定外源性物质对机体引发的损
害，对食品安全性检测有着重要的意义。其中急性毒
性检测是检测外源性物质对人体健康危害的重要方法。
采用传统整体动物实验检测污染物的毒性，耗资和耗时
较多，远远不能满足对新的受试物进行及时毒理学检测
的需要，同时受国际动物保护主义的影响，趋向用细
胞进行污染物的毒性检验。
体外细胞培养，可同时对十几种物质进行筛选测试
以确定可疑毒物。化学物对整体动物的毒性，实质上
是对细胞的一种毒性效应。因为进入体内的毒性物，最
终必然与细胞内部物质发生生物转化，因此毒物的毒
性，可在细胞水平上进行细胞毒性评价。
按寇氏法测得小鼠通过灌胃熊果酸的LD50为8.33g/
kg，腹腔注射LD50为637mg/kg[1]，细胞毒性作用还未
见报道。近来又有多方报道，熊果酸具有保肝的作用，
本次实验以小鼠原代培养肝细胞研究熊果酸的细胞毒
性，以及对丙烯酰胺引起的细胞毒性的减缓作用。
本实验采用MTT法进行检测，MTT法被称为“细
胞毒性检测的标准方法”，是一种能够快速评定细胞增
殖和细胞毒性的比色分析法，检测终点是线粒体琥珀酸
脱氢酶的活性。相信在不久的将来，该方法将在食品
毒性检测方面做出更大的贡献[2]。因为小鼠肝细胞具有
很多人类肝脏代谢酶的活性，在无需加体外代谢活化系
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统(如肝混合功能氧化酶混合液，即S9混合液)的条件
下，使能够在体外直接活化代谢外源性化合物，因此，
本实验选取小鼠肝细胞作为毒性筛选体系，使本研究体
系能够更好的模拟体内的生物代谢环境。
1 材料与方法
1.1动物、试剂及仪器
清洁级小鼠，雌性，体重平均23.4g。购自吉林
大学动物实验中心，合格证号：SGK-(Ji)-2003-00001。
熊果酸(纯度＞%)；胰蛋白酶 宝泰克生物科技公
司；RPMI1640培养基 美国CXbico公司；小牛血清
杭州四季青公司；二甲基亚矾(DMSO)、3-(4,5-二甲基
噻唑-2)-2,5-苯基四氮唑溴盐(MTT)、PBS(pH7.2)、0 4%
台盘兰溶液。
96孔细胞培养板、超净工作台、离心机、倒置显
微镜、C O2恒温培养箱、酶标仪。
1.2方法
1.2.1细胞的分离培养
取成年小鼠1只，于超净工作台内75%酒精中浸洗
10s消毒，剖腹，取出肝组织。用D-Hanks液洗2～
3遍，洗去血污，用眼科剪剪碎至糊状，加入10倍
体积的0.1%的胰蛋白酶，置37℃摇床中消化10min，滴
加几滴小牛血清终止消化，吸上清液转入离心管，
1000r/min离心1min，离心后弃上清，留0.5～1ml原液，
加入D-Hanks液至5ml混匀，相同条件离心，反复三
次清洗，最后一次用培养液洗，最后一次离心后，弃
上清，留0.5ml左右混匀，转入培养瓶，加入RPMI1640
培养液(含20%小牛血清)，放入CO2培养箱，37℃、5%
CO2浓度培养。以后每隔24、48、72h换液。
1.2.2细胞接种
将小鼠肝细胞用0.1%的胰酶消化，台盘兰染色、
计数，并计算细胞的相对活力，制成浓度为5×105个
细胞/ml的细胞悬液，以每孔10μl的体积接种于96孔
板，于CO2细胞培养箱内孵育24h。
1.2.3细胞染毒
每列孔加入不同浓度的不同受试物(8复孔)40μl，于
CO2细胞培养箱内孵育7h。
1.3细胞毒性检测(MTT法)
染毒结束后，每孔加入10μl的MTT溶液，于CO2
细胞培养箱内再孵育4h。
孵育结束后，弃上清，每孔加入150μl的DMSO，
震荡，于酶标仪上读取490nm处的OD值。
1.4数据分析
运用SPSSS及Excel软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1细胞毒性检测结果
图1为酶标仪测完OD值后的照片，图中的蓝色深
浅与细胞的活性成正比。颜色越深，细胞活性越高。
表1为酶标板各受试物的名称、数据分析代码、浓
度及实验结果。OD值以统计分析软件SPSS 11.5进行方
差分析(analysis of variance, ANOVA)及t检验。采用
MTT法所测各组OD值。
图1 测定OD值后培养板照片
Fig.1 Picture of culture plate after measuring OD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
列数
受试物 受试物 浓度
分子量
OD平
标准差
P与PC细胞增
名称 代码 (μmol/L) 均值 对比 殖率
3 丙烯酰胺 A C 37.40071.090.9520.0160.000** .855
4 熊果酸1 UA1 9.0004571.1510.2270.0751.034
5 熊果酸2 UA2 0.9004571.2610.1340.035* 1.133
6 熊果酸3 UA3 0.0904571.2370.0970.019* 1.111
7 熊果酸4 UA4 0.0094571.3160.1390.016* 1.182
8 熊果酸2+
丙烯酰胺
UA2AC0.9/37.4－ 1.2550.0720.061.190
9 熊果酸3+
丙烯酰胺
UA3AC0.09/37.4－ 1.2190.1380.051* .095
10熊果酸4+
丙烯酰胺
UA4AC0.009/37.4－ 1.2540.1480.0851.127
11对照组 P C － － 1.1130.086－ －
12 空白 － － 0.000.000－
表1 实验中受试物的添加情况及结果
Table 1 Additions of test substance in all groups and results
注：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；细胞增殖率(%)=实验组OD值/
对照组OD值×100。
除了UA1和UA4AC与浸提溶剂对照组同阴性对照
组比较无显著性差异(p＞0.05)，说明其对细胞增殖促进
作用不明显外，其他各组与对照组均有显著差异，说
明其对细胞的增殖或抑制作用明显。
2.2毒性级别分析
以实验组OD值占对照组OD值的百分比评价细胞毒
性(100%表示细胞毒性为零，百分比越低其细胞毒性越
大)，最后根据细胞增殖率的均值按表2所示评分标准评
定该组受试物的毒性程度。
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根据表2可知熊果酸为无毒级物质，对细胞增殖率
均大于100%。丙烯酰胺的细胞毒性大，毒性级别为一
级，加入不同浓度熊果酸后均能明显降低毒性。
细胞增殖率(%)≥10075～99 50～74 25～49 1～24 0
细胞毒性级 0 1 2 3 4 5
表2　细胞增殖率与细胞毒性级的对应关系
Table 2¡¡Grades of cytotoxicity corresponding to cell prolifera-
tion percentage
2.3不同浓度熊果酸毒性对比分析
图2 不同浓度熊果酸及对照组OD值
Fig.2 OD values of control group and different doses group of
ursolic acid
1.350
1.300
1.250
1.200
1.150
1.100
1.050
1.000
O
D4
9
0
n
m
熊果酸
UA1 UA2 UA3 UA4 P C
*
*
*
**代表丙烯酰胺加入不同浓度的熊果酸后OD值与不加组差异显著，p＜0.01。
图3 不同浓度熊果酸对丙烯酰胺的抑制作用
Fig.3 Inhibition effect of different doses of ursolic acid on
acrylamide
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
加入A C 不加AC
O
D4
9
0
n
m
受试物(熊果酸+丙烯酰胺)
UA2AC UA3ACUA4AC P C
由图2可见，UA2、UA3、UA4与对照组有显著性
差异(p＜0.05)。说明UA2、UA3、UA4对细胞增殖作
用明显，UA1虽能对细胞起到一定的增殖作用，但不
明显。各个稀释梯度间无显著性差异(p＞0.05)。
2.4不同浓度熊果酸对丙烯酰胺的抑制作用分析
由图3可见，加入不同浓度的熊果酸均能明显降低
丙烯酰胺对细胞的毒性，且效果显著。同一浓度的熊
果酸在加入丙烯酰胺前后影响不明显，p均大于0.05。
3 讨 论
印度学者Saraswat等发现熊果酸(5～20mg/kg)对
CCl4引起的大鼠肝毒性有保护作用[3]。熊果酸临床表现
有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄
疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有
见效快、疗程短、效果稳定的特点。
本实验通过熊果酸对分离培养的小鼠肝细胞毒性作
用检测，进一步证实了这一点，然而9μmol/L的浓度
虽然对细胞起到了一定的增殖作用，但效果不如稀释后
的好，与稀释1000倍的UA4比较，p值为0.79，虽不
在显著差异范围内，但是从数据上已经明显看出高剂量
的熊果酸对肝脏的保护作用低于低浓度的，再做此实验
之前，我们曾做过NaCl、秋水仙素和熊果酸细胞毒性
比较的实验，实验的数据也显示18μmol/L的熊果酸的
细胞毒性明显高于NaCl，差异显著，正所谓剂量决定
毒性，也可能与本实验所用为熊果酸纯品有关，天然
植物提取物的细胞毒性有待于进一步研究。但还是建议
以后利用熊果酸开发各种功能产品时注意剂量的使用。
丙烯酰胺存在于淀粉类的油炸食品中，而油炸食品
又深受中青年人的喜爱，但却对身体健康有着不利的影
响。实验证明熊果酸能明显抑制其对细胞的损伤作用，
并且不同稀释梯度的熊果酸与加入丙烯酰胺后比较对细
胞的增值作用影响均不显著。
参考文献：
[1] 熊筱娟, 陈武, 李开泉, 等. 乌索酸毒性实验研究[J]. 宜春医专学报,
2001, 13(1): 54.
[2] 吕晓迎, KAPPERT H F.牙科材料细胞毒性评定的新方法[J]. 中华
口腔医学杂志, 1995, 30(6): 377-379.
[3] 孟艳秋, 陈瑜, 王趱, 等. 熊果酸的研究进展[J]. 中国新药杂志, 2007,
16(1): 25-27.
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