全 文 ：笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究
何晶龙 彭 超 王 欣 郭德军 * 王志博
（黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江 大庆 163319）
摘要 从口感好、自然发酵的笃斯越桔果汁中分离出 140 株酵母菌。 经过对酵母菌产气、产酒精情况的测定以
及发酵酿酒后感官评定，筛选出 4 株酵母菌，分别编号为 C13、C18、D07 和 D15。 对这 4 株酵母菌进行形态学和
生理学特征鉴定以及 26SrDNA D1/D2 区序列分析， 最终鉴定出 4 株酵母菌为同一种菌， 即酵母属（Saccha-
romyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 结合商业葡萄酒活性干酵母进行比较分析，选择优良菌株
D15 作为实验菌株，测定其生物特性，结果表明 D15 具有较好的发酵特性、耐受特性和快速生长特性。 D15 在
20 °Bx、pH 3.5 笃斯越桔果汁中 24 ℃发酵 9 d，残糖量为 2.8 g/L，酒精度（V/V）为 12.5%，可以作为笃斯越桔酒酿
造的优选菌株。
关键词 笃斯越桔； 酿酒酵母； 筛选； 鉴定； 性能
文章编号 1009-7848（2011）03-0077-13
笃斯越桔（Vaccinium uliginosum Linn.）别名
都柿、蓝莓、甸果，主要产于我国大兴安岭北部（黑
龙江、内蒙古）和吉林长白山地区[1]。笃斯越桔果实
为小浆果， 成熟时为深紫色或蓝色， 营养价值极
高，具有防止脑神经老化，改善大脑记忆和智能，
对抗自由基，抗氧化，防衰老，减少胆固醇积累，改
善心血管机能，防治心脏病，缓解眼疲劳，明目以
及防癌、抗癌等独特功效，因此被国际粮农组织列
为人类五大健康食品之一[2-4]。
笃斯越桔果多汁、味酸甜爽口，果汁呈玫瑰红
色， 可以制成多种加工品， 其中用笃斯越桔加工
的果酒，色泽鲜艳，醇香柔绵，酒质清亮，可滋补健
身、消食健脾、舒筋活血、清除疲劳，具有较大的市
场潜力。 从低温自然发酵的笃斯越桔果汁中筛选
出 1 株产酒精量较高的酵母菌，对其进行形态学、
生理学、 分子生物学的分类鉴定， 并对酵母的生
长、耐受和发酵特性进行测定，为其进一步应用提
供理论依据。
1 材料
1.1 原料
笃斯越桔，购于内蒙古牙克石；蔗糖，食用级，
市售。
1.2 试剂
酵母菌鉴定生化管， 购于杭州天和微生物有
限公司；STES（0.2 mol/L Tris-Cl、0.5 mol/L NaCl、
0.01 g/L SDS、0.01 mol/L EDTA）；TE （0.1 mol/L
Tris-Cl、0.01 mol/L EDTA）； 琼脂糖凝胶回收试剂
盒，购于杭州爱思进生物技术有限公司。
1.3 培养基
YPD液体培养基、麦芽汁琼脂培养基，灭菌备
用。
糖度 18 °Bx，pH 3.5的笃斯越桔果汁。
1.4 仪器与设备
T6 新世纪紫外-可见分光光度计， 北京普析
通用仪器有限公司；EDC-810基因扩增仪，北京东
胜创新生物科技有限公司；JY04S 凝胶成像系统，
北京君意东方电泳设备有限公司；SHP-250 型生
化培养箱，上海森信仪器有限公司。
2 方法
2.1 酵母菌的分离
从口感良好、 低温自然发酵的笃斯越桔果汁
中取发酵液 1 mL，梯度稀释至 10-7。选择适当稀释
度 （10-3～10-4）， 取 50 μL 稀释后的菌液涂布于含
收稿日期： 2010-06-28
作者简介： 何晶龙，男，1982 年出生，硕士生
通讯作者： 郭德军
Vol． 11 No． 3
Jun． 2 0 1 1Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 11 卷 第 3 期
2 0 1 1 年 6 月
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
8%乙醇的 YPD 平板，28 ℃培养 2~3 d。 挑取形态
整齐、大小均匀的单个菌落镜检、编号。 将酵母菌
单菌落进一步以划线方式在麦芽汁琼脂培养基分
离纯化 2～3次。
2.2 酵母菌的初筛
在糖度为 18 °Bx 的 YPD 液体培养基中，以
酵母菌在杜氏管中产气情况为指标， 筛选产气量
大，起酵时间在 24 h 内的酵母菌株；以产酒精度
为指标，根据 GB/T 15038-2006，使用酒度计法测
量发酵液的酒精度，筛选产酒精度（V/V）在 8.0%
以上的酵母菌；以感官情况为指标，参考《葡萄酒
工业手册》及 GB/T 15308-2006，请 3 位品评人员
对酵母菌发酵后的越桔酒的色泽、香气、口味、风
味进行品评打分。筛选平均分数在 65分以上的酵
母菌。 感官评定标准见表 1。
澄清透明（4～5 分） 稍有浑浊或沉淀（2～4 分） 大量浑浊或沉淀（0～2 分）
香气 30 分
果香纯正、优雅，酒香浓厚（20～30
分）
果香，酒香较淡（10～20 分） 果香，酒香极淡（0～10 分）
滋味 40 分
酒体丰满， 醇厚协调， 酸甜适口
（30～40 分）
酒味较淡 ，较酸 ，较甜 （15～30
分）
酒味极淡， 过酸， 过甜或过苦
（0～15 分）
典型性 20 分
典型完美，优雅，有笃斯越桔特有
风格（15～20 分）
笃斯越桔特色风格不充分 （5～
15 分）
笃斯越桔特色风格极不充分 ，
不具有典型特征（0～5 分）
紫红（4～5 分） 深紫或浅红（2～4 分） 黑色或颜色特别浅（0～2 分）
优 良 差
项目
分 类
外观
色泽 5 分
澄清度 5 分
表 1 笃斯越桔酒感官评分细则
Table 1 The bylaws of sense organ score of Vaccinium uliginosum
2.3 酵母菌的复筛
结合商业葡萄酒活性干酵母， 以起始发酵时
间、产酒精度及感官评定为指标，对初筛后的酵母
菌进行复筛， 选择 1 株优良酵母菌作为后续实验
菌株。 筛选方法与本文 2.2 节基本相同， 不同之
处： 1）将 YPD 液体培养基换为笃斯越桔果汁，其
糖度为 18 °Bx，pH 3.5。 2）以感官评定为指标的筛
选过程中，请 10 位品评人员对不同酵母菌发酵酿
制的笃斯越桔酒进行色泽、香气、口味和风味的双
盲评定，并采用典型均衡非完全分块设计（BIB）进
行评定，评定标准见表 1。
2.4 酵母菌形态学特征观察
对筛选后的酵母菌进行细胞形态学、 菌落特
征、子囊孢子、假丝孢子、掷孢子观察，确定其形态
特征[5]。
2.5 酵母菌生理学特征鉴定
将酵母菌接种到发酵糖类、同化碳源、同化氮
源、分解尿素的酵母菌鉴定生化管中，观察其产气
及生长反应情况。此外，对筛选后的酵母菌进行分
解熊果苷试验、分解淀粉化合物试验、产酯测定、
牛奶胨化或凝固试验、脂肪分解试验、无维生素培
养基中的生长试验、抗放线菌菌酮试验、明胶液化
试验，根据所有生理生化特征的鉴定结果，通过查
找酵母菌鉴定手册鉴定待测菌株[6]。
2.6 酵母菌 26S rDNA D1/D2 区序列分析鉴定
2.6.1 酵母基因组 DNA 提取 玻璃珠法 [7]提取 4
株酵母菌基因组。
2.6.2 26S rDNA D1/D2 区的 PCR 扩增 以酵母
基因组为模板 ， 使用上游引物 5′ -GCATAT-
CAATAAGCGGAGGAAAAG -3′和下游引物 5 -
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′扩增菌株的 26S
rRNA基因[8]。
PCR 反应条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性
1 min，52 ℃退火 1min，72 ℃延伸 1 min 20 s；循环
30次；72 ℃延伸 8 min；4℃储存。
PCR 反 应 体 系 ：10 ×PCR buffer 5 μL，10
mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 上、 下游引物各 1
μL，Taq 酶 1 μL，模板 DNA 1 μL，加 ddH2O 至 50
μL。
2.6.3 26S rDNA 测定与分析 对 PCR 产物进行
78
第 11 卷 第 3 期
琼脂糖凝胶电泳， 使用凝胶回收试剂盒回收目的
片段，送到上海生工生物工程有限公司测序。
对已经获得的基因序列，利用 BLAST 软件在
GenBank 核酸序列数据库 （http：//www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast）中进行同源序列搜索，比较供试菌株
与已知酵母菌相应序列的相似程度。 通过与已知
酵母菌相应序列的比较， 最终鉴定供试菌株的酵
母菌的种属， 相似程度在 99%以上的视为同一个
种。 最后利用 DNAMAN VerSion6 系统软件构建
实验菌株及相关模式菌株的 26S rRNA D1/D2 区
序列同源树。
2.7 酵母菌的生长特性测定
2.7.1 最适生长温度 将酵母种子液按 2%接种
量接入 YPD液体培养基中，分别在 24、26、28、30、
32、34、36 ℃温度下恒温培养 10 h， 测定培养液
OD660值， 依据 OD660值的大小确定其最适生长温
度。
2.7.2 最适生长 pH 将酵母种子液按 2%接种量
接入 YPD 液体培养基中，分别在 pH 2.0、3.0、4.0、
5.0、6.0、7.0、8.0 条件下恒温培养 10 h， 测定培养
液 OD660 值， 依据 OD660 值大小确定其最适生长
pH。
2.7.3 最适转速 将酵母种子液按 2%接种量接
入 YPD 液体培养基中， 其中 YPD 液体量与瓶体
积比为 1∶2.5，分别在 120、140、160、180、200、220、
240 r/min 转速下恒温培养 10 h，测定培养液 OD660
值，依据 OD660值大小确定其最适转速[9]。
2.7.4 生长曲线的测定 将酵母种子液按 2%接
种量接入 YPD 液体培养基中，在最适生长条件下
每隔 2 h 测定培养液 OD660值， 根据 OD660值绘制
酵母菌生长曲线。
2.8 酵母菌耐受性能的测定
2.8.1 酒精耐受性 将灭菌后的 YPD 琼脂培养
基降温至 50 ℃， 按 10%、12%、14%、16%、18%、
20%、22%、24%、26%体积分数加入乙醇， 接种新
鲜酵母菌，在 YPD 固体平板进行生长实验 [10]。 28
℃培养 1 周后，观察培养基表面是否形成醭、环或
岛。 用阳性“+”表示形成，阴性“-”表示不形成。 如
果同一水平重复试验中有极少数形成， 用弱阳性
“+-”表示。与此同时用葡萄酒活性干酵母作对照。
2.8.2 渗透胁迫耐受性 配制含有 KCl 的 YPD
固体培养基， 使培养基中 KCl 浓度分别为 0.7、
1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L， 接种新鲜
酵母菌进行生长实验[11]。28 ℃培养 2 d后观察生长
状况，观察方法同 2.8.1 节。 与此同时用葡萄酒活
性干酵母作对照。
2.8.3 SO2耐受性 向 YPD 液体培养基中分别加
入偏重亚硫酸钾， 使培养基中 SO2质量浓度分别
为 50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L，接种
新鲜酵母菌进行生长实验。 28 ℃培养 2 d后，将含
有培养液的试管衬于黑线的纸前，观察浑浊度。浑
浊，用阳性“+”表示；稍有浑浊但不明显，用弱阳性
“+-”表示；不浑浊，用阴性“-”表示。与此同时用葡
萄酒活性干酵母作对照。
2.8.4 高温耐受性 将新鲜酵母菌接种到 YPD
斜面培养基， 分别于 37、38、39、40、41、42 ℃条件
下培养 2 周后观察生长状况， 观察方法同 2.8.1
节。 与此同时用葡萄酒活性干酵母作对照。
2.8.5 低温发酵性 将新鲜酵母菌接种到含有杜
氏管糖度为 20 °Bx 的 YPD 液体培养基中， 分别
在 12、14、16、18、20、22 ℃低温条件下做发酵实
验。 培养 7 d 后， 以产气状况表征其低温发酵性
能。产气，用阳性“+”表示；不产气，用阴性“-”表示。
2.8.6 高糖耐受性 在含有 72% 、74% 、76% 、
78%、80%、82%的葡萄糖 YPD 斜面培养基进行生
长实验，28 ℃培养 2 周后观察生长状况 [12]，观察方
法同 2.8.1节。与此同时用葡萄酒活性干酵母作对
照。
2.8.7 低 pH耐受性 在 pH 1.5、1.8、2.0、2.2、2.4、
2.6 的 YPD 液体培养基中接种新鲜酵母菌进行生
长试验，28 ℃培养 2 d后以生长状况表征低 pH 耐
受性。 观察方法同 2.8.3节。 与此同时用葡萄酒活
性干酵母作对照。
2.9 酵母菌发酵性能的测定
将酵母种子液接入 20 °Bx、pH 3.5 笃斯越桔
果汁中，在 24 ℃条件下发酵。 起始发酵后每 24 h
检测发酵果汁中的酒精度和残糖量， 进而确定酵
母菌的发酵性能。
3 结果与分析
3.1 酵母菌的分离
选择分离较好的 10-3、10-4稀释度平板， 根据
笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 79
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
菌落特征和细胞特征，初步分离到 140株酵母菌。
3.2 酵母菌的初筛
以起酵时间为指标， 从分离的 140 株酵母菌
中筛选出 63 株起酵时间在 24 h 以内的酵母菌
株；以酒精度为指标，对 63 株酵母菌进一步筛选，
结果筛选出 12 株产酒精度在 8.0%以上的酵母
菌；以感官评定为指标，对 12 株酵母菌再次筛选，
最终筛选出 4株平均分数 65分以上的酵母菌。将
这 4株酵母菌分别编号为 C13、C18、D07和 D15。
3.3 酵母菌的复筛
3.3.1 起酵时间的测定 观察酵母菌在杜氏管中
产气情况，对酵母菌起始发酵时间进行测定，结果
见图 1。
由图 1可知，酵母菌 D15起始发酵时间最短，
为 10 h。其次是 C13和 D15，起始发酵时间分别为
12、13 h。 葡萄酒活性干酵母起始发酵时间最长，
为 20 h。
3.3.2 酒精度的测定 以酒精度为指标， 对酵母
菌发酵酿酒后的酒精度进行测定，结果见图 2。
由图 2可知， 酵母菌 D15发酵酿酒后产酒精
度最高，达到 11.2%。 其次是 D07 和 C13，产酒精
度分别为 10.5%和 10.2%。葡萄酒活性干酵母产酒
精度最低，为 8.2%。
3.3.3 感官评定 采用典型均衡非完全分块设计
（BIB）进行评定。 BIB 数据见表 2，最终结果见图
3。 对评定分数进行方差分析，分析结果见表 3。
25
20
15
10
5
0
起
酵
时
间
/h
12
15
10
13
20
C13 C18 D15 D07 活性干酵母
菌株
图 11 起酵时间测定结果
Fig.1 The determination result of super-ferment time
12
10
8
6
4
2
0
10.2 9.8
10.5 11.2
8
酒
精
度
（ V
/V
）
C13 C18 D15 D07 活性干酵母
菌株
图 2 酒精度测定结果
Fig.2 The determination result of alcoholicity
1 74 70 87
2 78 81 65
3 73 75 60
4 82 77 58
5 63 83 61
6 73 73 80
7 79 70 76
8 71 83 66
9 75 65 62
10 67 73 84
C13 C18 D07 D15
品评员
菌株
活性干酵母
表 2 用 BIB 设计对笃斯越桔酒感官评定
Table 2 The sense evaluation of Vaccinium uliginosum wine by BIB design
80
第 11 卷 第 3 期
100
80
60
40
20
0
感
官
评
定
分
数
75
68
77 82
62
C13 C18 D07 D15 活性干酵母
菌株
图 3 感官评定结果
Fig.3 The results of sense evaluataion
菌株 y 变异来源 SS df MS F 值 Pr＞F a = 0.05
D15 82 处理间 1480.80 4 370.200 29.10 <0.0001 A
D07 77 处理内 318.00 25 12.720 B
C13 75 总变异 1798.80 29 B
C18 68 C
活性干酵母 62 D
表 3 BIB 方差分析及 Duncan 多重比较结果
Table 3 The results of BIB variance analysis and Duncan multiple comparison
由图 3可知， 酵母菌 D15发酵酿酒后感官评
定分数最高，为 82 分；其次是 D07 和 C13，感官评
定分数分别为 77 和 75。 葡萄酒活性干酵母感官
评定分数最低，为 62分。由表 3可以看出，在不同
菌株 BIB试验的方差分析中，F值为 29.10，P值 ＜
0.0001，说明不同菌株发酵酿酒差异显著，10 位评
定员的评定分数可靠。 在 α ＝ 0.05 水平下，D15、
D07、C18、 活性干酵母发酵酿酒后感官评定差异
显著；D07 和 C13 差异不显著。 综合上述分析可
知， 与其它菌株相比，D15 发酵酿酒感官评定最
好。
综合各指标筛选结果，D15 比其它菌株起始
发酵时间短，产酒精度高，感官评定好，可作为后
续实验菌株。
3.4 酵母菌的鉴定
3.4.1 形态学特征 对酵母菌进行形态学鉴定，
结果表明，4 株酵母菌表现相同的形态学特征，具
体特征见表 4。
项目 形态学特征 项目 形态学特征
细胞形态 圆形或椭圆形 透明程度 不透明
表面状况 光滑而湿润 气味 有酿酒香味
凸起情况 凸起 子囊孢子的形成 产生子囊孢子，每个细胞 1～3个子囊，大多 2个子囊在细胞两侧。
边缘情况 整齐
菌落形状 圆形
表面光泽 无光泽 假丝孢子的形成 不形成假丝
菌落质地 松软粘稠 掷孢子的形成 不形成掷孢子
菌落颜色 乳白色
表 4 笃斯越桔中酵母菌形态学特征鉴定结果
Table 4 Identification results of morphological characterization for Vaccinium uliginosum yeast
笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 81
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
由表 4 可知，根据对子囊孢子、假死孢子、掷
孢子的观察，并结合酵母菌鉴定手册，可以初步判
定 4株菌为酵母菌属。
3.4.2 生理学特征鉴定 参照啤酒酵母， 对 4 株
酵母菌进行生理学特征鉴定。 在酵母菌糖类发酵
试验中，杜氏管产气量达到满管用阳性“+”表示，
半管用弱阳性“+-”表示，不产气用阴性“-”表示。
同化碳源试验中，将生化管衬于带有黑线的纸前，
观察浑浊度。 浑浊用阳性“+”表示，稍有浑浊但不
明显用弱阳性“+-”表示，不浑浊用阴性“-”表示。
同化氮源试验、抗放线菌酮试验、无维生素培养基
中的生长试验，观察方法与同化碳源试验相同。分
解熊果苷试验，培养基呈褐色用阳性“+”表示，否
则用阴性“-”表示。 产酯试验，产生酯类香气用阳
性“+”表示，否则用阴性“-”表示。产生类淀粉化合
物试验，显蓝色用阳性“+”表示，否则用阴性“-”表
示。牛奶胨化或凝固试验，培养基胨化或凝固用阳
性“+”表示，否则用阴性“-”表示。 脂肪分解试验，
培养基底部有白垩状沉淀用阳性“+”表示，否则用
阴性“-”表示。 尿素分解试验，生化管液体变红用
阳性“+”表示，否则用阴性“-”表示。 明胶液化测
试，液化用“+”表示，否则用阴性“-”表示，具体结
果见表 5。
发酵糖类
葡萄糖 + + + + +
蔗糖 + + + + +
麦芽糖 + + + + +
乳糖 - - - - -
半乳糖 +- +- +- +- +-
棉子糖 + + + + +
蜜二糖 - - - - +
同化碳源
半乳糖 + + + + +
蜜二糖 + +- +- + +
乳糖 +- + +- + +
纤维二糖 +- - - +- -
海藻糖 +- +- + + +
阿拉伯糖 + +- +- + +
可溶性淀粉 - - - - -
木糖 - - - +- -
山梨糖 - - - - -
乙醇 - - - - -
甘油 + + + + +
山梨醇 + + +- + +
卫矛醇 - +- +- + +
肌醇 - - - - -
赤藓醇 - - - - -
甘露醇 + + + + +
阿东醇 - +- - - -
C13 C18 D07 D15
项目
酵母菌种编号
啤酒酵母
表 5 笃斯越桔中酵母菌生理学特征鉴定结果
Table 5 Identification results of physiological characterization of Vaccinium uliginosum yeast
82
第 11 卷 第 3 期
硫酸铵 + + + + +
KNO3 - - - - -
盐酸乙胺 + + + + +
其它指标
分解熊果苷 - - - - -
产生类淀粉化合物 - - - - -
产酯 + + + + +
牛奶胨化或凝固 + + + + +
脂肪分解 - - - - -
无维生素培养基 + + + + +
抗放线菌酮 - - - - -
尿素分解 + + + + +
明胶液化 - - - - -
同化氮源
项目
酵母菌种编号
啤酒酵母
C13 C18 D07 D15
（续表 5）
注：阴性：- 阳性： + 弱阳性。
由表 5 可知，4 株菌生理学特征相似，通过查
阅酵母菌鉴定手册，初步推断这 4 株酵母为酵母
属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces
cerevisiae）。
3.4.3 26SrDNA D1/D2 区的 PCR 扩增 通过对
4 株酵母酵母菌基因组 DNA 提取和 26SrDNA
D1/D2 区 PCR 扩增，目的片段长度约 600 bp。 琼
脂糖电泳检测结果见图 4。
将 PCR 目的片段回收， 送上海生物公司测
序，使用 NCBI 网站 Blast 在线软件程序进行相似
性分析，最终鉴定出目的菌株，鉴定结果见表 6。
Marker C13 C18 D07 D15
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
图 4 胶回收前电泳图
Fig.4 Electropherogram before gel reclamation
编号 序列长度 Genebank 接受号 同源菌株 保守区域/% 最大同源性/%
C13 574bp EU386759.1 酿酒酵母 C545 97 100
C18 576bp EU386754.1 酿酒酵母 A27-4-2 97 99
D07 577bp EU386748.1 酿酒酵母 A27-3-1 97 99
D15 572bp EU368740.1 酿酒酵母 C545 97 100
表 6 26SrDNA D1/D2 区的 PCR 扩增鉴定结果
Table 6 Amplification identification results of PCR for 26SrDNAD1/D2 region
采用 DNAMAN VerSion6 系统软件构建 26S
rRNA D1/D2区序列同源树，结果见图 5。
3.5 酵母菌生长特性
对优良酵母菌 D15 的生长曲线、最适生长温
度、最适生长 pH 及恒温摇床最适转速进行测定，
结果发现，培养 6 h 时后，测定结果 OD660 值大于
1.000。由于分光光度计理论测量范围在 0～1之间，
因此需对菌液进行适当稀释，稀释倍数为 10倍。
笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 83
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
100%
100%
90%
90%
94%
91%
86%
74%
73%
38%
39%
汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni）
葡萄酒孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）
马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）
C13
D15
酵酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
C18
D07
克鲁维酵母菌（Saccharomyces kluyveri）
C18
D07
克鲁维酵母菌（Saccharomyces Kluyveri）
发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）
美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）
普地有孢圆酵母（Torulaspora pretoriensis）
图 5 鉴定的酵母菌种与相关种 26S rRNA 基因序列的同源树
Fig.5 Homology tree of identification of yeast species and related species 26S rDNA gene sequence
由图 6～图 8 可以看出，酵母菌 D15 最适生长
温度为 30℃，在该条件下对应的 OD660值为 0.712；
最适 pH 为 6.0，对应的 OD660 值为 0.734；最适转
速为 200 r/min，对应 OD660值为 0.716。由图 9可以
看出， 酵母菌 D15在 6 h后进入快速生长期，16 h
进入稳定期，30 h进入衰亡期。
D15
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
OD
24 26 28 30 32 34 36 38
温度/℃
图 6 笃斯越桔酿酒酵母的最适生长温度
Fig.6 The optimum growth temperature
of Vaccinium uliginosum yeast
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
OD
2 3 4 5 6 7 8 9
D15
pH
图 7 笃斯越桔酿酒酵母的最适生长 pH
Fig.7 The optimum growth pH of
Vaccinium uliginosum yeast
D15
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
OD
图 9 酵母菌 D15 的生长曲线
Fig.9 Growth curve of D15 yeast
时间/h
D15
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
OD
120 140 160 180 200 220 240 260
转速/r·min-1
图 8 笃斯越桔酿酒酵母的最适转速
Fig.8 The optimum speed of rotation
for Vaccinium uliginosum yeast
84
第 11 卷 第 3 期
3.6 酵母菌耐受性
3.6.1 酒精耐受性 酵母菌 D15 与葡萄酒活性
干酵母酒精耐受性见表 7。
由表 7 可知，D15 耐受乙醇量为 22%（体积分
数）， 而葡萄酒活性干酵母耐乙醇量为 18%，D15
比葡萄酒活性干酵母高出 4%，与孙尤海 [13]、刘素
纯[14]报道的酵母菌耐乙醇量 20%相比高出 2%；与
申彤[15]报道的酵母菌耐乙醇量 22%相同。 综合上
述分析，D15酒精耐受性能较好。
3.6.2 渗透胁迫耐受性 酵母菌 D15 与葡萄酒
活性干酵母渗透胁迫耐受性见表 8。
由表 8 可知，D15 耐 KCl 浓度为 1.6 mol/L，而
葡萄酒活性干酵母耐 KCl 浓度为 1.2 mol/L；D15
耐 KCl 浓度与郭亭 [16]报道的 1.0 mol/L 相比，耐渗
透胁迫性较好。
3.6.3 SO2耐受性 酵母菌 D15 与葡萄酒活性干
酵母 SO2耐受性见表 9。
由表 9 可知，D15 耐 SO2质量浓度为 250 mg/
L， 而葡萄酒活性干酵母耐 SO2 质量浓度为 150
mg/L，D15 比葡萄酒活性干酵母耐 SO2 质量浓度
高。 与孙佳平[17]、颜璐洁[18]报道的耐 SO2 200 mg/L
相比，耐受性较好；与李筝[19]、程超[20]报道的试验结
果相同；与崔铁忠 [21]、赵祥杰 [22]报道的耐 SO2 325
mg/L 和 400 mg/L 相比， 耐受性较低。 综上分析，
D15耐受 SO2能力良好。
3.6.4 高温耐受性 酵母菌 D15 与葡萄酒活性
干酵母高温耐受性见表 10。
由表 10 可知，D15 耐受最高温度为 40 ℃，而
葡萄酒活性干酵母耐受最高温度 39 ℃，两者耐受
高温的能力相近。与吴帅[23]、李剑芳[24]报道的 35℃
和 36.5℃相比，耐高温性能好；与王晓菲 [25]报道的
结果相同；与薛军霞 [10]、刘畅 [26]报道的 42 ℃和 50
℃相比，耐高温性能较差。 综合上述分析，D15 具
有良好的耐高温性。
3.6.5 低温发酵性 酵母菌 D15 与葡萄酒活性
干酵母低温发酵性能见表 11。
由表 11 可知，D15 最低发酵温度 16 ℃，而葡
萄酒活性干酵母最低发酵温度 18 ℃， 两者相比
较，D15低温发酵性能较好。
3.6.6 高糖耐受性 酵母菌 D15 与葡萄酒活性
干酵母高糖耐受性结果见表 12。
由表 12 可知，D15 能够耐受 80%葡萄糖质
量分数。对活性干酵母高糖耐受性进行单独测定，
结果表明，活性干酵母耐受 50%葡萄糖质量分数。
D15 与活性干酵母相比， 耐受性较强。 与颜璐
洁 [18]、刘畅 [26]、薛军霞 [10]和刘素纯 [14]报道的耐受
50%和 70%葡萄糖质量分数相比， 高糖耐受性能
较好。 综上所述，D15耐高糖性能较好。
3.6.7 低 pH 耐受性 在预备实验中发现 D15 在
pH 3 的培养液中仍能生长，因此，将 pH 范围设定
在 3.0 以下。 酵母菌 D15 与葡萄酒活性干酵母低
pH耐受性见表 13。
由表 13可知，D15能够耐受 pH 2.0以上的培
养液。对葡萄酒活性酵母进行测定，其耐受 pH 3.5
以上的培养液。 两者比较，D15低 pH的耐受能力
比葡萄酒活性干酵母好。 其与赵祥杰[22]、王晓菲[25]
报道的酵母菌 pH 2.5 相比，耐受能力要好；与薛
军霞 [10]研究的低 pH 耐受性相同；与李剑芳 [24]、申
彤 [15]研究的低 pH 耐受性参数 1.6 和 1.8 相比，稍
高。 综合上述分析，D15低 pH耐受性较好。 经测
定， 笃斯越桔果汁 pH 范围在 2.7～3.2， 因此 D15
适合在酸度高的条件下发酵。
综合酵母菌 D15 耐受性实验结果，D15 耐受
性能中各指标都较活性干酵母好， 与文献报道的
最优值相比较，酒精耐受性、渗透胁迫耐受性、低
温发酵性能、高糖耐受性较好；而高温耐受性、SO2耐
受性、低 pH 耐受性较文献报道差，但综合而言，
D15耐受性能良好，适合在笃斯越桔果汁中发酵。
D15 + + + + + + + +- -
活性干酵母 + + + + + +- - - -
10 12 14 16 18 20 22 24 26
菌株
酒精量/%
表 7 酿酒酵母酒精耐受性实验结果
Table 7 Experimental result of alcohol toleration for Saccharomyces cervisiae
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 85
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
D15 + + + + + +- +- - -
活性干酵母 + + + +- - - - - -
0.7 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4
菌株
KCl/mol·L-1
表 8 酿酒酵母渗透胁迫耐受性实验结果
Table 8 Experimental result of diosmosis toleration for Saccharomyces cervisiae
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
D15 + + + + + +- - -
活性干酵母 + + + +- - - - -
50 100 150 200 250 300 350 400
菌株
SO2/ mg·L-1
表 9 酿酒酵母 SO2耐受性实验结果
Table 9 Experimental result of SO2 toleration for Saccharomyces cervisiae
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
D15 + + + + - -
活性干酵母 + + + +- - -
37 38 39 40 41 42
菌株
温度/℃
表 10 酿酒酵母高温耐受性实验结果
Table 10 Experimental result of high temperature toleration for Saccharomyces cervisiae
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
D15 - - + + + +
活性干酵母 - - - + + +
12 14 16 18 20 22
菌株
温度/℃
表 11 酿酒酵母低温发酵性能实验结果
Table 11 Experimental result of low temperature fermentation performance for Saccharomyces cervisiae
表注：阴性：-，阳性：+。
D15 + + + + + -
活性干酵母 - - - - - -
72 74 76 78 80 82
菌株
葡萄糖/%
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
表 12 酿酒酵母高糖耐受性实验结果
Table 12 Experimental result of high glucose toleration for Saccharomyces cervisiae
D15 + +- + + + +
活性干酵母 - - - - - -
1.5 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
菌株
pH
注：阴性：-；阳性：+；弱阳性：+-。
表 13 酿酒酵母低 pH 耐受性实验结果
Table 13 Experimental result of low pH toleration for Saccharomyces cervisiae
86
第 11 卷 第 3 期
3.7 酵母菌发酵性能
以残糖量、酒精度为指标，对酵母菌 D15与葡
萄酒活性干酵母发酵性能进行测定， 测定结果见
图 10、图 11。
由图 10、图 11 可以看出，随着时间的增加，
D15产酒精度速度较葡萄酒活性干酵母快。在 20
°Bx、pH 3.5 笃斯越桔果汁中 24 ℃起始发酵 9 d
后，酒精度为 12.5%，而同等条件下葡萄酒活性干
酵母酿酒后产酒精度为 9.8%， 两者比较，D15 在
酒精度产量方面优于葡萄酒活性干酵母。 在残糖
量方面，随着时间的增加，D15 含糖量下降速度较
快，发酵笃斯越桔果汁 9 d 后残糖量为 2.8 g/L，而
葡萄酒活性干酵母残糖量为 37.3 g/L， 两者比较，
D15 发酵能力优于葡萄酒活性干酵母。 D15 产酒
精度与王丽威 [27]、王晓斐 [25]、何志刚 [28]报道的酵母
菌发酵产酒精度 12.9%、14.1%、15.0%相比， 产量
较低，但是与孙佳平 [17]、刘素纯 [14]报道的酒精度
8.7%、10.0%相比，产酒精度较高。D15发酵后的残
糖量比李筝[19]报道的葡萄酒发酵后残糖量为（1.53
土 0.33）g/L 稍高， 但仍能达到 GB15037-2006 葡
萄酒糖含量小于 4 g/L 的要求。 综上所述，酵母菌
D15发酵性能较好，适合在笃斯越桔果汁中发酵。
4 讨论
本实验中酿酒酵母菌的筛选指标与以往报道
有所不同， 不仅考虑以酵母菌发酵性能为指标进
行筛选， 更重要的是从酿酒后感官评定的角度去
分离筛选，突出了发酵酒感官评定的重要性。除了
理化鉴定外， 增加了 26S rDNA D1/D2 区序列分
析，操作简单方便，鉴定结果准确可靠，克服了某
些酵母菌属、 种在形态学及生理生化特性方面差
异极不显著的缺点[29-31]。 此外，分离筛选的纯种酿
酒酵母来源于低温自然发酵的笃斯越桔果汁，与
外来引入的葡萄酒活性干酵母或其它原料分离的
酵母菌相比，具有较强的适应能力，尤其是其耐受
能力表现更为突出。 筛选到的优良酿酒酵母 D15，
能耐受 pH 2.0 以上的培养液、22%的酒精、80%葡
萄糖，相对于其它外源酿酒酵母，能够在酸度及糖
度较高的笃斯越桔果汁中更好的生长和发酵。
酿酒酵母 D15相对于葡萄酒活性干酵母具有
良好的发酵性能。 1）具有较快的发酵速度和较短
的起始发酵时间，D15 起酵时间为 10 h，在工业生
产上可以大大缩短主发酵时间， 提高笃斯越桔酒
的生产效率。 2）发酵后产酒精度较高，残糖量较
低，D15 在 20 °Bx、pH 3.5 笃斯越桔果汁中 24 ℃
起始发酵 9 d后，酒精度为 12.5%，残糖量为 2.8 g/
L，达到 GB15037-2006葡萄酒产酒精度 7.0 以上、
残糖量小于 4 g/L 的要求。 3） 发酵后感官性能较
好，用 D15酿造的笃斯越桔酒色泽为紫红色，具有
纯正优雅、清新爽净、酒体丰满等典型的笃斯越桔
风味特征。
D15
活性干酵母
14
12
10
8
6
4
2
0
酒
精
度
/%
（ V
/V
）
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
时间/h
图 10 酒精度随时间变化曲线
Fig.10 Change curves of alcohol content with time
D15
活性干酵母
300
250
200
150
100
50
0
糖
含
量
/g·
L-
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
时间/h
图 11 糖含量随时间变化曲线
Fig.11 Change curves of residual sugar content with time
笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 87
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
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88
第 11 卷 第 3 期
研究显示过瘦也易患结肠癌
据新华社新加坡 5 月 3 日电 一项针对新加坡华族的研究显示， 过瘦人群与过胖人群一
样，患结肠癌的风险均比较高。
据新加坡《海峡时报》3日报道，这项研究由新加坡国立大学和美国明尼苏达大学研究人员
合作完成，研究对象是 5万多名新加坡华族人，论文将刊登在美国《癌症》杂志 6月号上。
研究人员根据身高体重指数（BMI）区分研究对象。 他们发现，身高体重指数低于 18.5的过
瘦人群，罹患结肠癌的风险比身高体重指数在 21.5 至 24.4 之间的“理想体重”人群高 33%，而
身高体重指数高于 27.4的过胖人群则比“理想体重”群体高 46%。
身高体重指数是衡量人体健康状况的一个参考指数，其计算方法为体重（公斤）除以身高
(米)的平方。
研究人员在其论文中提出的一项解释是，过瘦人群罹患结肠癌的风险较高，可能与一种
叫作 “DNA氧化应激损伤” 的轻微炎症有关， 这种炎症破坏患者的免疫系统， 让癌细胞得以
增殖。
Study on Screening， Identification and Properties of Vaccinium Uliginosum Yeast
He Jinglong Peng Chao Wang Xin Guo Dejun* Wang Zhibo
（College of Food， Heilongjiang Bayi Agricultrual University， Daqing 163319， Heilongjiang）
Abstract The 140 yeast strains were isolated from natural fermentation Vaccinium uliginosum wine with satisfactory
taste by preliminary screening tests. Then the 4 yeast strains with good gas production， high alcohol quantity production
and good sensory assessment， had been screened by re-screening and labeled successively as No. C13， No. C18， No.
D07， No. D15. Finally 4 yeast strains were identfied belongs to Saccharomyces cervisiae by the identification of morphol-
ogy， physiology and 26S rDNA D1/D2 region sequence analysis. Through comparative analysis with commercial active dry
wine， the final best strain D15 as empirical strains was selected， and the biological properties of strains D15 was deter-
mined，and the results showed that it had better fermentation performance， higher tolerance and faster growth properties.
9 d after the D15 fermentation of 20 °Bx， pH 3.5 Vaccinium uliginosum juice， the concentration of residual sugar was
2.8 g/L， Ethanol concentration was 12.5， so D15 can be rendered as optimizing strains of Vaccinium uliginosum wine
brewing.
Key words Vaccinium uliginosum； Saccharomyces cervisiae； screen； identification； performance
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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笃斯越桔中酿酒酵母菌的筛选、鉴定及特性研究 89