全 文 ：中华桫椤 DNA提取及 ISSR分析
应站明 ,黎桂芳 ,王海舟　(萍乡高等专科学校 ,江西萍乡 337000)
摘要　 [目的 ]研究中华桫椤总DNA的提取方法。 [方法 ]采用SDS法和改良CTAB法提取中华桫椤总DNA,通过电泳检测方法进行比
较。 [结果]用改良CTAB法得到的DNA浓度和纯度都较高 ,基本上无蛋白质、多糖等杂质。用改良 CTAB法得到的总 DNA进行ISSR
-PCR扩增 ,谱带清晰 ,获得较好的效果。 [结论]为提取高质量的DNA样品奠定了基础 ,并为探讨中华桫椤自然居群的遗传多样性和
种群遗传结构及进一步保护和利用中华桫椤提供了分子遗传学依据。
关键词　中华桫椤;改良CTAB法;SDS法;ISSR
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)32-16180-02
StudyonTotalDNAExtractionofAlsophilacostularisBakerandItsISSR-PCRAnalysis
YINGZhan-mingetal　(PingxiangColege, Pingxiang, Jiangxi337000)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtostudythetotalDNAextractionmethodsofA.costularisBaker.[ Method] Toinvestigatetheop-
timumDNAextractionmethod, SDSandmodifiedCTABmethodsforisolatinggenomicDNAfromA.costularisBakerleafwerestudied.Thei-
solatedDNAwasexaminedbyultravioletabsorptiontestandagarosegelelectrophoresis.[ Result] TheresultsshowedthatthemodifiedCTAB
methodwassuitableforDNAisolationfromA.costularisBakerplants.ThequalityofDNAcouldmeetISSRrequirementevenextractedonce
bythemodifiedCTABmethod.[ Conclusion] ThestudycanprovidethebasisforextractinghighqualityDNAsample, andcanoferthemo-
leculargeneticsreferenceforexploringthegeneticdiversityandthepopulationgeneticstructureofA.costularisBakeranddeeplyprotecting
andutilizingA.costularisBaker.
Keywords　AlsophilacostularisBaker;CTABmethod;SDSmethod;ISSR-PCR
基金项目　江西省教改项目(JXJG-08-23-5)。
作者简介　应站明(1981-),男 ,江西鄱阳人 ,讲师 ,从事植物系统分类
与资源的教学与研究工作。
收稿日期　 2009-09-04
　　中华桫椤(AlsophilacostularisBaker)又称毛肋桫椤 ,系蕨
类植物门水龙骨目桫椤科桫椤属植物 ,为第四纪冰川孑遗植
物 ,被称为植物界 “活化石 ”,中华桫椤被列为二级濒危物
种 [ 1] 。中华桫椤树形高大 ,具有较高的园林观赏价值 ,可提
取黄酮类等多种化学成分 [ 2] ,其茎秆髓部富含淀粉 ,可提取
淀粉代食品 ,具有较高的药用价值和潜在的经济价值;对研
究古地质气候 、古环境的演变 、保证遗传物种生态系统的持
续利用具有极重要的科学研究价值。目前 ,中华桫椤的研究
主要集中在组织培养 [ 3] 、形态生物学 [ 4]和配子体发育 [ 5]等方
面 ,其分子水平的研究还未见报道。由于中华桫椤中含糖类
和酚类等化学成分 ,因此其 DNA提取具有一定的困难 。而
提取高质量的 DNA样品是进行分子生物学研究的必要前
提 [ 6-8] 。为此 ,笔者利用 SDS法和改良 CTAB法对中华桫椤
总 DNA进行提取 ,用 ISSR-PCR检测所提取的总 DNA模板 ,
以探讨中华桫椤自然居群的遗传多样性及种群遗传结构 ,为
进一步保护和利用中华桫椤提供分子遗传学依据。
1　材料与方法
1.1　材料　中华桫椤:采自于我国云南屏边大围山自然保
护区(22°57′N、103°42′E)。野外采集未完全伸展的拳卷状
中华桫椤嫩叶 ,置于自封口塑料袋中 ,用手轻压排去袋内空
气 ,封口 ,尽量置于阴凉处存放 [ 9] 。
主要试剂:①十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取缓冲
液:100 mmol/LTris-HCl(pH值 8.0), 1.4 mol/LNaCl, 20
mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 2%CTAB, 1%聚乙烯基吡咯
烷酮(PVP), 0.4%巯基乙醇(注:巯基乙醇在使用之前加入 ,
室温保存);②CTAB沉淀缓冲液:100 mmol/LTris-HCl(pH
值 8.0), 10 mmol/LEDTA, 1%CTAB(室温保存);③十二烷
基磺酸钠(SDS)提取液:100 mmol/LTris-HCl(pH值 8.0),
50 mmol/LEDTA(pH值 8.0), 500 mmol/LNaCl, 2%β巯基
乙醇 , 20%PVP。
1.2　方法
1.2.1　改良 CTAB法 [ 10] 。具体步骤为:取叶 ,用消毒的剪刀
剪碎 ,置于 -40℃冰箱中快速冷冻 1 ～2 h,取出后快速研磨;
分装于 3个 1.5ml的离心管中 ,快速加入 0.5ml提前预热的
CTAB提取缓冲液 ,充分混匀;65℃水浴保温 1 ～4 h,冷却至
室温;加入等体积的氯仿∶异戊醇 ,充分混匀后 , 12 000 r/min
离心 10 min;重复上一步骤 2次;取上清液 ,加入 4倍体积的
CTAB沉淀缓冲液 ,混匀 ,室温静置 5 ～ 60 min, 12 000 r/min
离心 5 min;取沉淀 ,悬浮于 400 μl1mol/L的 NaCl溶液中;
加入 2.5倍体积的 -20 ℃的无水乙醇中 , 12 000 r/min离心
5min;用 70%乙醇漂洗沉淀 2次 ,吹干 ,溶于 100 μlTE中;
置于 -20℃冰箱中保存备用。
1.2.2　SDS提取法 [ 11] 。对采集的叶片组织进行如下处理:
取叶 ,用消毒的剪刀剪碎 ,置于 -40 ℃冰箱中快速冷冻 1 ～ 2
h,取出后快速研磨;将浆状的叶片粉末转入 2 ml离心管中 ,
加入 1 mlSDS提取液 ,混匀 , 65℃水浴 , 12 000 r/min离心 10
min;将上清液转入到新的离心管中 ,加入等体积的氯仿∶异
戊醇(24∶1),上下颠倒 15 min,混匀 , 12 000 r/min离心 10
min;重复上一步骤 1 ～ 2次 ,直到界面层的沉淀物质很少后
进入下一步骤;加入 2.0 ～ 2.5倍体积的冰冻的无水乙醇 ,沉
淀 5 ～ 10 min;10 000 r/min4 ℃离心 10 min,加入 400 μl1
mol/L已灭菌的 NaCl溶液溶解 DNA;随后加入 2.0 μlRNA
消化酶 ,摇匀后置于 37 ℃水浴锅中水浴 30 min;再加入 2.0
～ 2.5倍体积的冰冻的无水乙醇 ,沉淀 5 ～ 10 min;10 000
r/min离心 10 min,弃去上清液 ,用 70%乙醇洗沉淀 2次 ,干
燥 ,加入 20μl的 TE溶解 DNA,置于冰箱中待用。
1.3　ISSR-PCR初始扩增体系及程序　将改良的 CTAB法
所得的 DNA按以下步骤进行 ISSR-PCR检测 ,扩增选用 814
号引物 ,其序列为:5′-CTCTCTCTCTCTCTCTA-3′。扩增反应
责任编辑　姜丽　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(32):16180-16181, 16189
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.32.133
条件为 [ 12] :20 μlPCR反应体积 , 1×PCRbufer, 2.5 mmol/L
Mg2+ , 0.2 mmol/LdNTP, 0.2 μmol/L引物 , 1.5 UTaq酶 , 50
ng中华桫椤模板 DNA。扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94
℃变性 30 s, 50 ℃复性 45 s, 72℃延伸 90 s, 35个循环;72 ℃
延伸 7 min;4 ℃保存 。
2　结果与分析
2.1　改良 CTAB法和 SDS法提取 DNA结果　用 SDS法提
取总 DNA,由于中华桫椤中酚类 、糖类等物质过多 ,提取效果
不理想(图 1)。点样孔中有 EB吸收说明有多糖和蛋白质存
在 ,拖带现象也较严重 ,有少量的 RNA存在 , DNA完整性差 ,
部分 DNA可能被 DNA酶降解 ,多酚物质和多糖的影响较
大 ,不适宜严格的分子标记试验。用改良 CTAB法提取 ,中
华桫椤样品总 DNA在 0.8%的琼脂糖凝胶上电泳结果见图
2。由图 2可知 ,扩增条带很整齐 , DNA质量较高 ,蛋白质少 ,
无拖带现象 , DNA完整性比较好。经过紫外分光光度计测定
的 DNA的 A260 /A280值均在 1.750 ～ 2.050, 表明总 DNA的浓
度及纯度均符合试验要求 。 2种方法提取的中华桫椤总
DNA分子量大概都在 23kb,但改良 CTAB法提取的总 DNA
质量较优于 SDS法提取的总 DNA。
2.2　ISSR-PCR检测结果　使用改良的 CTAB法提取得
到的 DNA能扩增出清晰的条带 ,没有弥散等现象 ,而且特征
条带多达 10条。这说明用改良 CTAB法提取的 DNA质量较
好 ,谱带清晰 ,能用于进一步的分子标记分析及其他分子生
图 1　SDS法提取中华桫椤总 DNA电泳图
Fig.1　AgarosegelelectrophoresisoftotalDNAfromAlsophila
costularisbySDSmethod
图 2　改良 CTAB法提取中华桫椤总 DNA电泳图
Fig.2　AgarosegelelectrophoresisofDNAfromAlsophilacostu-
larisbyimprovedCTABmethod
图 3　改良CTAB法提取所得的中华桫椤 DNA的 ISSR-PCR扩增结果
Fig.3　ISSR-PCRamplificationresultsofDNAextractedfromAlsophilacostularisbyimprovedCTABmethod
物学试验研究 。
3　讨论
那冬晨等研究表明 ,某些植物细胞中含有大量的酚类 、
多糖等物质 ,影响 DNA的提取 ,所以不同植物材料 、不同试
验目的都需要对 DNA提取方法进行适当的改进和优化 ,实
现对 DNA的有效提取 [ 13] 。桫椤细胞中含有大量的黄酮类 、
酚类和多塘等多种物质 [ 14] 。因此 ,给其总 DNA的提取带来
很大的困难。 20世纪 80年代以后国内外普遍采用 CTAB法
提取植物总 DNA。CTAB是一种去污剂 ,既能裂解细胞又能
有效沉淀多糖 ,它能与核酸形成复合物 ,在高盐溶液中是可
溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定程度时 ,从溶液中沉淀 ,通过
低温离心就可将 CTAB-核酸的复合物与变性蛋白 、多糖类
物质分开。但其主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较
少的植物的 DNA提取 ,并不适合富含多酚类物质的茶叶基
因组 DNA的提取 [ 15] 。对于富含多酚 、多糖的植物组织 ,通过
增加提取缓冲液中 β-巯基乙醇用量 ,可以有效地控制酚类物
质的氧化褐变及 DNA的降解。除去蛋白质的步骤中 ,适当
增加氯仿∶异戊醇的量和使用次数 ,有利于更加完全地去除
蛋白质 ,从而提高产物的纯度。
该研究对 CTAB法进行改良 ,也起到一定的效果 ,有效
地去除了此类杂质 ,提高了 DNA的纯度 。虽然 SDS法提取
的 DNA有浓度高和 DNA不易被 DNA酶降解等优点 [ 15] ,但
结果显示该法对中华桫椤的 DNA提取效果不佳。使用改良
CTAB法提取 DNA不但得率较高 ,而且操作较简单 ,所得产
物杂质较少 ,降解程度轻 ,并可提取到高质量的 DNA,完全符
合 ISSR-PCR等分子检测的要求 。改良 CTAB法中快速冷冻
后迅速研磨和加入氯仿∶异戊醇(沉淀核酸)后剧烈振荡 ,且
选择的离心速度为 12 000 r/min等处理均能提高中华桫椤
DNA的提取效果 。从试验结果看来 ,改良 CTAB法提取所得
的中华桫椤的 DNA无论从纯度 、得率看 ,其效果都比 SDS
法好。
(下转第 16189页)
1618137卷 32期　　　　　　　　　　　　　　　　应站明等　中华桫椤DNA提取及 ISSR分析
7360-7365.
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