全 文 ：北方园艺 2010(1):165 ～ 168 ·生物技术 ·
第一作者简介:赵静(1987-),女,本科在读,研究方向为生物工程。
E-mail:wyzmkm@sohu.com。
通讯作者:李建华(1969-),男 ,博士 ,副教授,现从事分子生物学教
学与研究工作。E-mail:zmkmcn2001@yahoo.com.cn。
基金项目:湖北省教育厅重大资助项目(Z20092601)。
收稿日期:2009-09-20
四种改良 CTAB 法提取大叶朴基因组DNA比较研究
赵 　静 , 叶 　欢 , 李雪松 , 李 建华
(孝感学院 生命科学技术学院,湖北 孝感 432003)
　　摘　要:以大叶朴成熟叶片为试材 ,采用 4种改良 CTAB 法提取大叶朴基因组 DNA ,并比较
其提取效果。结果表明:用这 4种方法均可获得没有发生褐变 、完整性好的 DNA。其中方法 2
(用了低浓度乙醇和高盐去多糖)和方法 4(用了低浓度乙醇去多糖)去多糖的效果更好一些 ,但获
得的 DNA浓度较低;ISSR扩增结果表明 ,4种方法提取的DNA均可用于 ISSR扩增 ,但方法2和
3扩增的效果稍好一些。
关键词:大叶朴;改良CTAB 法;基因组DNA;多糖;褐变
中图分类号:S 687.03.6　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)01-0165-04
　　得到高质量的DNA是分子生物学研究中关键的第
一步。从植物材料中提取基因组 DNA的质量受到多种
因素的影响。在不同植物或同种植物不同时期组织中
存在着不同数量的多糖 、色素以及种类繁多的次生物
质 ,特别是多糖 、酚类在提取过程中可与 DNA共沉淀 ,
形成包裹 DNA的黏稠胶状物 ,难以溶解或产生褐变 ,使
得DNA提取质量较低 ,获得的DNA溶液常常黏度大乃
至呈胶状 ,这些物质如果清除不净则会影响后续研
究[ 1-2] 。如何高效简便地去除多糖 、多酚等次生物质 ,对
提取纯化植物 DNA来说至关重要[ 3] 。
大叶朴(Celtis koraiersis Nakai)属榆科 ,原产我国华
北及辽宁等地 ,它是典型的遮荫兼观叶树种 ,同时 ,大叶
朴树皮纤维可代麻 ,也可用作造纸或人造棉的原料 ,果
可榨油 ,供制肥皂和作润滑剂用。大叶朴成熟叶片较
硬 ,叶色浓绿 ,富含多糖 、色素和多酚等次生物质 ,使得
高质量总 DNA的提取较为困难 ,因此 ,根据适当浓度的
无水乙醇可使多糖沉淀 ,多糖在高盐溶液中的溶解度
大 ,PVP 可有效去除多酚等原理 ,以经典提取植物 DNA
的CTAB 法为基础[ 4] ,设计了 4种改良CTAB 法提取大
叶朴成熟叶片基因组 DNA ,并用琼脂糖电泳 、紫外分光
光度计以及 PCR扩增的方法对这4种提取方法进行了
比较。
1　材料与方法
1.1　试验材料
叶朴成熟叶片采集于孝感市槐荫公园 ,采集后立即
放入冷冻袋 ,带回实验室 ,用 ddH2O 清洗 ,用滤纸吸干
表面残留水分 ,标记分装 ,置-60℃冰箱冷冻保存备用。
1.2　主要仪器和提取试剂
冷冻离心机(Eppendorf),DW-ML 型超低温冷冻储
存箱(中科美夌低温科技有限公司),DYY-7C型电泳仪
(北京六一仪器厂),DYY-IIl型水平电泳槽(北京六一仪
器厂),752N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器
有限公司),FR-200A全自动紫外与可见分析系统(上海
复日科技有限公司),PCR仪(PTC-100 thermocycler)。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP),CTAB-free缓冲液(0.2 mol/ L
Tris-HCl ,50 mmol/ L EDTA ,0.25 mol/L NaCl),β-巯基
乙醇 , 2×CTAB 提取缓冲液(2% CTAB , 0.1 mol/ L
Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA , 1.4 mol/L NaCl , 1%
PVP),氯仿/异戊醇(24∶1),10×CTAB(10%CTAB ,
0.7 mol/L NaCl),无水乙醇 ,饱和酚 , 7.5 mol/ L 的醋
酸铵。
1.3　试验方法
1.3.1　方法 1　称取约6 g 的叶片 ,沿叶脉撕碎后加入
到有少量石英砂和 PVP 的研钵中在冰上研磨至匀浆。
取 0.2 g 的匀浆分别加入到 12支 1.5 mL 的 EP管中。
加入 1 mL预冷的CTAB-f ree缓冲液 ,加入 5μL的 β-巯
基乙醇。剧烈震荡后冰浴 30 min ,期间每隔一定时间颠
倒摇匀。冰浴结束后以 3 000 rpm离心 5 min ,弃上清
液 ,立即加入 500μL 预热的(65℃)2×CTAB 提取缓冲
液 ,再加入10μL的 β-巯基乙醇 ,65℃水浴 60 ～ 80 min ,
期间每隔一定时间颠倒摇匀。水浴结束后以10 000 rpm
离心5 min ,取上清液 ,加 50 μL 的预热的(65℃)2×
CTAB 提取缓冲液 ,混匀5 min ,再加入 500 μL的氯仿/
异戊醇(24∶1),摇匀10 min后 ,10 000 rpm离心 5 min ,
取上清。加入 500 μL 的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶
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1),轻轻颠倒摇匀 10 min ,10 000 rpm 离心 8 min。取上
清液 ,加入500μL的氯仿/ 异戊醇(24∶1),轻颠倒摇匀
10 min ,10 000 rpm离心 5 min。取上清液于另 1个 EP
管中 ,加入2倍-20℃预冷的无水乙醇 ,轻轻摇匀(此时
应能看到 DNA的絮状沉淀)。将絮状沉淀用毛细血管
挑取到另 1个加了 1 mL 70 %乙醇的 EP 管中 ,轻轻颠
倒几次 ,12 000 rpm 离心 3 min ,弃净乙醇 ,再用 70%乙
醇清洗 1次 ,风干(可在 37℃烘干约10 min);以 100 μL
无菌双蒸水溶解DNA ,备用。
1.3.2　方法 2　在方法 1的第(2)步加入预热的 2×
CTAB 提取缓冲液的同时加入0.35倍体积的无水乙醇 ,
同时将方法 1的第(6)步改为取上清液于另一 EP 管中 ,
先加入 50μL 7.5 mol/ L的醋酸铵 ,然后再加入等体积
-20℃预冷的无水乙醇。
1.3.3　方法3　将方法1的第(6)步改为取上清液于另
1个 EP管中 ,先加入 50 μL 7.5 mol/L 的醋酸铵 ,然后
再加入等体积-20℃预冷的无水乙醇。
1.3.4　方法 4　在方法 1的第(2)步加入预热的 2×
CTAB 提取缓冲液的同时加入0.35倍体积的无水乙醇。
2　结果与分析
2.1　电泳检测
取5μL DNA样品在 1.0%琼脂糖凝胶 ,电泳缓冲
液为 0.5×TBE ,电压为 100 V的条件下电泳80 min ,溴
化乙锭染色 ,在FR-200A全自动紫外与可见分析系统上
观察 DNA 分子的大小 、完整性 、电泳条带的清晰度 ,并
进行拍照(图 1)。从图 1可以看出 ,这 4种方法提取的
DNA完整性都较好。用方法1(未用 0.35倍无水乙醇 ,
也未用醋酸铵 ,泳道 1 、2 、3)和方法 3(醋酸铵 ,泳道 7、8 、
9)提取的DNA总量比用方法 2(0.35倍无水乙醇 ,醋酸
铵 ,泳道 4、5 、6)和方法 4(用 0.35倍无水乙醇 ,而未用醋
酸铵)的要多一些 ,但点样孔中有明显的发亮现象 ,表明
方法 1和 3样品中的蛋白质或多糖未除尽 ,而方法 2和
4 ,特别是方法 2样品点样孔很干净。
图1 4种方法提取的DNA 电泳图
　　注:M:Markers;1、2 、3为方法 1;4 、5 、6为方法 2;7、8 、9为方法 3;10 、
11 、12为方法 4。
2.2　紫外吸收检测
从上述 12份DNA样品中分别取50μL DNA溶液
用水稀释 40倍 ,用 752N型紫外可见分光光度计 ,分别
在波长为230、260 、280 nm 处进行紫外吸值的检测 ,将检
测结果进行单变量方差分析(见表1)。
　　表 1 4种DNA提取方法的DNA 紫外吸收值
方法 OD230 OD260 OD280 OD260/OD280 OD260/OD230
1 4.35±1.47A 9.24±4.03Aa 4.87±1.85Aa 1.90±0.71 2.11±0.22
2 1.05±0.37B 2.28±0.51Bb 1.26±0.48Bb 1.81±0.05 2.17±0.25
3 1.89±0.56B 4.11±1.40Ab 2.25±0.63Ab 1.80±0.13 2.15±0.13
4 1.31±0.32B 2.67±0.65Bb 1.40±0.29Bb 1.89±0.16 2.04±0.18
　　在波长为230、260 、280 nm 处的紫外吸值分别反应
的是 DNA提取样品中小分子杂质、核酸和蛋白质的含
量。纯的 DNA样品 OD260/OD280 应为 1.8 , OD260/
OD230应大于 2.0。OD260/OD280大于 1.9时 ,表明有
RNA污染 ,小于1.6时 ,表明样品中存在蛋白质或酚污
染;OD260/OD230小于 2.0时 ,表明溶液中有残存的盐
和小分子杂质 ,如核苷酸 、氨基酸 、酚等。从表 1可以看
出 ,方法1提取的 DNA样品的OD230值极显著地大于
用方法 2 、3 和 4 提取的 DNA 样品的 OD230 值(P<
0.01),而方法 2、3和 4提取的DNA样品间的 OD230值
差异不显著(P>0.05);方法 1提取的 DNA 样品的
OD260和OD280值极显著地大于用方法2和 4提取的
DNA样品的OD260和 OD280值(P<0.01),方法 1提
取的 DNA样品的 OD260和 OD280值显著地大于用方
法 3提取的 DNA 样品的 OD260 和 OD280 值(P <0.
05),而方法 2 和 4提取的 DNA 样品间的 OD260和
OD280值差异不显著(P>0.05);4种方法提取的 DNA
样品间的OD260/OD28和OD260/OD230值差异不显著
(P>0.05),其中 ,OD260/OD28值在 1.80 ～ 1.90之间 ,
OD260/OD230值在 2.04～ 2.17之间。上述结果表明方
法1提取的DNA样品中DNA的含量明显高于方法2 、3
和 4 ,这 4种方法对蛋白质和核苷酸 、氨基酸 、酚等小分
子杂质的去除效果都比较好。
图 2　4 种方法提取的 DNA ISSR扩增电泳图
　　注:M:Markers;1、2、3为方法 1;4、5 、6为方法 2;7、8 、9为方法 3;10、
11、12为方法 4。
2.3　PCR扩增
为了进一步检验这4种方法提取 DNA的质量 ,以
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所提DNA为模板 ,用1条 ISSR引物(引物序列为(AG)8
C),在 PTC-100 PCR自动扩增仪上进行 PCR扩增。
PCR扩增条件及扩增程序为:94℃预变性5 min ,接着以
94℃45 s ,53℃45 s ,72℃90 s ,循环 44次 ,最后在 72℃
延伸 7 min。1.2%琼脂糖凝胶 , 90 V 电泳约 1 h 后在
FR-200A全自动紫外与可见分析系统下观察 、拍照(结
果如图 2)。从图 2可以看出 ,4种方法提取的 DNA样
品都可用作 ISSR研究 ,不过用方法 2、3提取的样品扩
增出的条带 ,特别是大片段条带要亮一些。
3　讨论
大叶朴等植物成熟叶片的细胞中含有较多的多糖 、
酚类 、色素等次生物质 ,这些物质在 DNA 提取过程中易
与DNA 共沉淀 ,形成粘稠的胶状物难于溶解或产生褐
变。由于多糖可以抑制许多酶的活性 ,因此受多糖污染
的DNA 样品无法用于进一步的分子生物学研究[ 5] ,去
除多糖 、防止酚类等次生物质褐变成为提取高质量大叶
朴基因组 DNA的关键问题。
去除多糖有多种方法 ,但常用有 2种:一是在 DNA
提取过程中以浓度乙醇沉淀多糖[ 6] ;二是在沉淀 DNA
时 ,加入高盐溶液 ,使多糖不随DNA沉淀[ 7] 。该研究采
用4种改良的 CTAB 方法提取大叶朴成熟叶片基因组
DNA ,其中方法 1没有用低浓度乙醇或高盐去多糖 ,方
法2用了低浓度乙醇和高盐去多糖 ,方法 3仅用了高盐
去多糖 ,方法4侧仅用了低浓度乙醇去多糖。用琼脂糖
凝胶电泳 ,溴化乙锭染色的方法检测DNA样品 ,在紫外
灯下点样孔中发亮的物质主要是蛋白质 、多糖及其它一
些次生代谢物质[ 8] 。表 1中 4 种方法提取的 DNA的
OD260/OD280值表明 ,这 4种方法提取的 DNA 样品
中 ,蛋白质去除得都比较干净 ,而从图 1可以看出 ,用方
法2和 4提取的DNA样品在电泳检测时点样孔比较干
净 ,这说明方法2和4去多糖及其他一些次生代谢物质
的效果比较好 ,特别是方法 2 ,即同时使用低浓度乙醇和
高盐去多糖 ,效果最理想。观察图1中各方法提取DNA
条带的亮度及表1中各方法提取 DNA紫外分光光度计
的OD260值 ,方法2和4提取的 DNA的浓度显著低于
方法 1和 3 ,这可能是由于多糖的许多理化性质与 DNA
很相似 ,很难将它们分开 ,去除多糖的同时往往也有相
当数量的 DNA被裹携走了 ,造成DNA产量的减少[ 5] 。
在去多酚 ,防褐变方面 ,该研究采取了低温操作 ,使
用PVP 、CTAB 和 β-巯基乙醇等综合措施。PVP 是一
种高分子合成树脂 ,可溶于水 、乙醇及氯仿 ,工业上常用
作澄清剂 、稳定剂 ,它不吸附DNA ,但能与多酚类物质形
成不溶性的络合物而沉淀 ,防止多酚物质氧化成醌类 ,
避免溶液变褐[ 9-10] 。CTAB 除了可溶解生物膜 ,释放核
酸外 ,还能有效地去除多酚 ,抗氧化剂 β-巯基乙醇能提
供巯基 ,与多酚类物质竞争氧 ,能在一定程度上防止酚
氧化成醌 ,避免样品的褐化。该研究所用的 4种提取
DNA的方法在磨样时均加入少量 PVP 并在冰上操作 ,
在 CTAB 提取缓冲液加入1%PVP ,在不含CTAB 的缓
冲液和 CTAB 提取缓冲液中加分别加入了 5 μL 和
10μL的 β-巯基乙醇 ,这些措施不但有效地排除材料中
的多酚类物质的干扰 ,所获得的 DNA样品没有发生褐
变 ,而且能保持 DNA 的纯净和完整性。另外 ,用不含
CTAB 的缓冲液预洗 ,可洗掉部分次生物质[ 11-12] ,预洗时
应充分振荡 ,使缓冲液和材料充分接触混合 ,离心后颠
倒离心管彻底弃除上清液 ,离心速度不可太大 ,离心速
度太大的话会将离心管中的材料压得太紧 ,不利后续操
作 ,该试验以3 000 rpm 离心 5 min ,取得了较好的效果。
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Comparative Research of Four Kinds of Modified CTAB Extraction of
Genomic DNA of Celtis koraiensis Nakai
ZHAO Jing , YE Huan , LI Xue-song , LI Jian-hua
(College of Life Science and Technology , Xiaogan University , Xiaogan ,Hubei 432003)
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·生物技术· 北方园艺 2010(1):168～ 171
鸳鸯茉莉不同外植体诱导愈伤组织研究初探
袁 　媛 , 连芳青
(江西农业大学园林与艺术学院 ,江西南昌 330045)
　　摘　要:以鸳鸯茉莉花瓣 、叶片 、茎段为外植体 ,MS为基本培养基 ,探索外植体取材季节和部
位对污染的影响;分析植物生长调节剂的种类 、浓度对不同外植体诱导愈伤组织的影响和最适组
合。结果表明:在3 、4月取材比 5 、6月好 ,12月取材效果较差;通过花瓣能成功诱导出健康的愈
伤组织 ,但诱导率较低(27.1%),平均出愈时间为 23 ～ 25 d ,3种外植体中以嫩叶诱导愈伤组织的
效果最好(87.1%),平均出愈时间最短 ,为 18 ～ 20 d;茎段愈伤组织诱导率其次(68.1%),平均出
愈时间为 21 ～ 23 d;2 ,4-D、6-BA对以花瓣为外植体诱导愈伤组织的影响达显著水平 ,花瓣诱导愈
伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/ L+2 ,4-D 1.0 mg/ L ,2 ,4-D对叶片
诱导愈伤组织的影响达显著水平 ,叶片诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 2.0 mg/L+
NAA 1.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L ,2 ,4-D 、6-B对茎段诱导愈伤组织的影响达到极显著水平;MS
+6-BA 3.0 mg/ L+KT 3.0 mg/ L+NAA 1.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L 最适合茎段诱导愈伤组
织。
关键词:鸳鸯茉莉;外植体;生长调节剂;愈伤诱导率
中图分类号:S 685.16　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)01-0168-04
　　鸳鸯茉莉(Brun felsia lati folia Benth.)是茄科(So-
lanaceae)鸳鸯茉莉属常绿矮灌木 ,花多单生 ,有时数朵组
成聚伞花序。花冠高脚碟形 ,径约 3.8 cm ,花具芳香。
花期 4 ～ 10月。性喜温暖湿润气候 ,不耐寒。要求肥沃
疏松 、排水良好的微酸性土壤。喜肥 ,不耐涝 ,不耐强
光[ 1-3] 。
鸳鸯茉莉初开时为淡紫色 ,后变为淡雪青色 ,最后
变为白色 ,由于开花有先后 ,在同一植株上同时能看到
不同颜色的花 ,故又得名“双色茉莉” 。具有“一卉能熏
一室香 ,炎天犹觉玉肌凉”的诗意和极高的观赏价值 ,深
第一作者简介:袁媛(1988-)女 ,湖北人, 在读硕士 ,现主要从事园
林植物栽培与繁育研究工作。 Email:ho tleyy258@163.com。
通讯作者:连芳青(1953-),女 ,教授 ,硕士生导师,现从事园林花卉
栽培学教学与科研工作。 E-mail:lianfangqing@163.com。
收稿日期:2009-09-10
得人们的喜爱[ 3] 。鸳鸯茉莉不结实或结实很少 ,繁殖方
式多采用扦插 、高空压条 ,但繁殖系数较低 ,扦插生根较
难 ,生根率仅8.9%,且生根所需时间长 ,扦插苗生长势
差[ 4] 。远不能满足日益增长的市场需求 ,通过组织培养
技术可有效提高其繁殖系数。鸳鸯茉莉是木本植物 ,一
般用茎段作外植体组织培养分化再生植株 ,自1986年报
道过成功离体培养双色茉莉嫩叶后[ 5] ,以愈伤组织途径
再生植株的报道很少。探索建立愈伤无菌体系的最适
外植体类型及诱导培养基对以后探索愈伤增殖 、分化出
芽 、小苗生根最适培养激素组合进而通过后一种再生途
径成功获得完整植株奠定基础。此外 ,首次以花瓣为外
植体 ,探索产生愈伤组织到分化成完整植株的可行性。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为江西农业大学花卉教学基地温室大棚
内生长多年的3盆鸳鸯茉莉。
Abstract:Four improved CTAB methods were used to extract genomic DNA from mature leaves of Celtiskoraiensis Nakai
and the extraction effect of the 4 methods was compared.The results showed that the 4 methods obtained no browning
and intact genomic DNA.The method 2(low concentration ethanol and high salt were used to remove polysaccharide)and
4(only low concentration ethanol was used to remove polysaccharide)had the better effect of removing polysaccharide but
with lower DNA concentration than the method 1 and 3.The ISSR amplification results showed that the genomic DNA
extracted by the 4 methods could be used for ISSR amplification but the DNA from the method 2 and 3 had the better
effect of ISSR amplification than the other three methods.
Keywords:Celtis koraiensis Nakai;modified CTAB;genomic DNA;polysaccharide;browning
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