全 文 ：文章编号:1006-1126 (2007)01-0050-03
大叶栎总 DNA 两种提取方法的比较
基金项目:广西科学基金项目 (桂科字 0542024)。
作者简介:梁文汇 , 男 , 广西大学林学院硕士研究生。
通讯作者:黄寿先 (1956-), 男 , 教授 , 博士。
梁文汇 , 梁　机 , 黄寿先＊ , 谢素平 , 周传明
(广西大学林学院 , 南宁　530005)
摘　要:对大叶栎的总 DNA 两种提取方法进行对比试验 , 从外观 、 浓度 、 A260/ A280 、 A260/ A230、 电泳检查
和 ISS R扩增对所提取到的 DNA 进行对比 , 结果显示用改良 CTAB 法提取的 DNA 在各方面都达到 ISS R扩增的
要求 , 是大叶栎总 DNA 提取的较好方法。
关键词:大叶栎;DNA提取;ISSR;改良 CTAB 法
中图分类号:S722.3　文献标识码:A
Comparison of Two Total DNA Extraction Methods for Castanopsis fissa
LIANG Wen-hui , LIANG Ji , HUANG Shou-xian , XIE Su-ping , ZOU Chuan-ming
(Forestry Colleg e of Guangxi University , Nanning 530005 , Guangxi)
Abstract:Two total DNA ex t raction methods of Casta nopsis f issa were compared in the paper.By
studying the appearance , concentration , A260/ A280 , A260/A230 and elect rophoresis , and comparing the
total DNA ex tracted from ISSR analy sis , the result showed that the improved CTAB method w as suitable
for I SSR analysis , and it w as a bet ter DNA ex traction method of Casta nopsis f issa.
Key words:Casta nopsis f issa ;dNA ex traction ;ISSR ;improved CTAB method
　　大叶栎 (Castanopsis f issa.)又名裂壳锥 、黧
蒴栲 、乌叶子 , 壳斗科栲属 , 亚热带林区主要树种
之一[ 1] , 天然次生林先锋树种[ 2] , 大叶栎生长快 ,
对土壤要求不严 。可多代长期萌芽更新 , 采伐后萌
芽生长快 , 枯枝落叶多且易分解 , 有利于林地的可
持续利用[ 3] 。但在广西只有桂东地区的苍梧县一
带有大面积连片分布 , 而其他地区均为较小面积或
零星分布 , 大叶栎的种质资源保护面临严峻的考
验 , 为了利用 ISS R标记对广西大叶栎的遗传多样
性进行研究 , 为大叶栎种质资源的保护和利用提供
科学依据 , 本文对大叶栎总 DNA 的两种提取方法
进行对比试验 , 以期找到适合 ISSR标记的 DNA
提取方法 。
1　材料方法
1.1　材料
用硅胶干燥法保存大叶栎的叶样 , 采 5 ～ 10 g
新鲜发育近乎完全的鲜嫩叶子放到带拉锁的自封袋
中 , 加入 50 ～ 100 g 干燥的硅胶 , 保证硅胶的质量
为新鲜叶子的 10倍 , 摇动袋子使硅胶与叶子充分
接触 , 叶子 12小时内干燥 , 野外采样过程中一旦
发现硅胶变粉红色要及时更换 , 干燥的叶样带回实
验室 , 常温下保存用于 DNA提取。
1.2　DNA提取方法
方法 1:参考 CTAB裂解-硅珠吸附法[ 4] 。
方法 2:改良 CTAB法[ 5] (参考 Doyle&Doyle
第 36 卷　第 1 期
2007 年 3 月 　　　　　　　　　　　　　
广 西 林 业 科 学
Guangxi Forestry Science
　　　　　　　　　　　　　　　Vol.36　No.1
Mar.2007
的方法进行改良)。
1.3　DNA 检测方法
1.3.1　外观判断
通过观察沉淀的 DNA 的颜色和 DNA 干燥后
的情况初步判断 DNA的质量 。
1.3.2　核酸测定仪测定
用Bio Photometer 核酸测定仪检测 DNA 的浓
度 , A260/A280 , A260/A230
1.3.3　电泳检查
用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 的浓度 、
纯度及降解程度。所用电泳仪为 ECP3000三恒多
用电泳仪 , DYCR-314电泳槽 。
1.3.4　ISSR扩增
用为 Biometre 050 -801 TGradient 96PCR仪
进行 ISSR扩增 , 2.0%琼脂糖凝胶电泳检查所提
取的 DNA是否达到要求 。
扩增体系:20μL 体系中含有 ddH2O14.7μL 、
2μL 10 ×PCR buffer 、 dNTP1.6μL 、 1U TaqDNA
聚合酶 、 0.5μL primer和模板 0.5 μL (大约含 50
ng), TaqDNA 聚合酶和 dNTP 购自宝生物工程
(大连)有限公司。反应程序:(1)94℃预变性 5
min , (2)94℃变性 45 s , (3)52.5℃退火 45 s ,
(4)72℃延伸 1 min45 s , 从第二步到第四步循环 ,
共40个循环 , (5)72℃完全延伸 7 min , (6)4℃
保存 。所用引物为 810 , 由上海生工合成 。
2　结果分析
2.1　外观分析
优质的 DNA沉淀为白色 , 干后透明 。如果干
后仍然为白色 , 说明含有蛋白质较多;若干后为白
黄色至棕色 , 则意味着含有较多的酚类杂质;胶冻
状 , 则常常含有多糖[ 6] 。本试验中 , 用硅珠吸附
法是看不到沉淀的 DNA生成的 , 故无法从外观上
判断其质量 , 而用改良的 CTAB 法提取的 DNA 符
合上面的标准 , 沉淀的 DNA为白色 , 干后透明。
2.2　核酸测定仪测定
两种提取方法的 DNA 试样测定结果见表 1。
由表 1可以看出:方法1所提取的DNA浓度偏低 ,
全部用原液来测定 , 其浓度在 27 ～ 50 μg/mL 之
间 , 而方法 2所提取到的 DNA经过 1 到 9倍的稀
释后 , 浓度仍在 93 ～ 142 μg/mL 之间 , 说明了方
法 2的产量要比方法 1的要高得多 , ISSR标记要
求的 DNA的量并不是很严格 , 两种方法在浓度上
都可以达到要求;A260/A280 比值若在 1.80 左
右 , 则 DNA 比较纯;若大于 1.80 , 则含有 RNA;
若小于 1.80 , 则含有蛋白质 , 需要去除[ 6] 。用硅
珠吸附法所提取的 DNA 溶液的 A260/A280 在
1.24 ～ 1.42之间 , 偏小 , 说明含有较多的蛋白质 ,
可以考虑用酚-氯仿抽提 , 但是其 DNA的产量不
高 , 再抽提的过程中 DNA 的浓度会进一步降低 ,
而用改良的 CTAB法提取的 DNA , 其 A260/A280
在 1.60 ～ 1.78之间 , 说明纯度较高。
2.3　琼脂糖电泳检查
对用改良 CTAB 法和硅珠吸附法提取的 DNA
样品 , 用 0.8%琼脂糖电泳检测 , 结果见图 1。从
图 1可以看出改良 CTAB 法提取到的大叶栎 DNA
模板在浓度 、 纯度和重复性方面均比硅珠吸附法
好 , 同时改良 CTAB 法提取的模板纯度较高 , 点
样孔也没有杂质。
表 1　核酸测定仪测定两种方法提取的模板
方法 编号 浓度/ (μg/ mL) A260/A280 A260/A230 备注
硅珠吸附法 1 38 1.35 0.3 原液
硅珠吸附法 2 28 1.42 0.5 原液
硅珠吸附法 3 58 1.24 0.8 原液
硅珠吸附法 4 50 1.36 0.4 原液
硅珠吸附法 5 27 1.31 1.0 原液
硅珠吸附法 6 33 1.40 0.8 原液
改良 CTAB法 7 93 1.67 1.70 吸 180μL+180μLTE
改良 CTAB法 8 142 1.60 1.61 吸 50μL+180μLTE
改良 CTAB法 9 136 1.60 1.61 吸 20μL+180μLTE
改良 CTAB法 10 104 1.78 1.98 吸 20μL+180μLTE
改良 CTAB法 11 98 1.75 1.76 吸 50μL+180μLTE
改良 CTAB法 12 128 1.78 2.02 吸 20μL+180μLTE
51第 1 期　　　　　　　　梁文汇 , 梁　机 , 黄寿先 , 等:大叶栎总 DNA 两种提取方法的比较
2.4　ISS R扩增
图 2.两种方法提取的模板 ISSR 扩增结果 。
从图 2可以看出硅珠吸附法提取到的 DNA 也可以
扩增出来 (如 1), 但是不稳定 , 重复性不好 (如
2 、 3), 有的还比较模糊 (如 4), 但是用改良
CTAB法提取的 DNA 比较清晰 , 重复性好 , 所以
用改良 CTAB法提取的大叶栎 DNA 模板更好 , 可
以达到 ISSR扩增的要求。
3　小结与讨论
通过以上的 2 种方法的对比 , 用改良 CTAB
法提取的大叶栎 DNA 模板可以达到 ISS R扩增的
要求 , 效果比硅珠吸附法好 。通过试验发现 , 在大
叶栎总 DNA提取的过程中应注意几个问题 。 (1)
在使植物细胞壁有效破碎的同时尽量保持 DNA 的
完整性 , 防止 DNA降解 , 在抽提过程中各项操作
均应温和进行 , 避免剧烈振荡和过度搅拌 。(2)为
了防止 DNase 的降解作用 , 提取时所用的器具 、
研钵 、离心管 、溶液等都必须经过高压灭菌。同时
在提取液中加入了二价金属离子螯合剂 EDTA 来
消除外源及内源 DNase活性[ 7] 。 (3)选用发育近
乎完全而鲜嫩的大叶栎叶片作为提取 DNA的材料
较好 , 因为过嫩的叶片中蛋白质 、糖类含量多 , 不
利于 DNA的较好抽提 , 而过老的叶片表面蜡质层
较厚 , 不利于充分研磨破碎细胞以完全地释放出
DNA 。(4)用 RNase消化 RNA , 能达到纯化 DNA
的目的 。 (5)在加入 TE 溶解样品 DNA 前 , 使
DNA 沉淀在空气中干燥 , 完全地除去 CTAB 、 氯
仿 、 异戊醇 、 异丙醇及乙醇等小分子物质是非常必
要的 。
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52 广 西 林 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　　　　第 36 卷