全 文 ：红 毛 丹(Nephelium lappaceum)属 无 患 子 科
(Sapindaceae)韶子属(Nephelium)热带多年生常绿
乔木植物， 原产于马来西亚和印度尼西亚， 是著名
的热带珍稀水果之一， 与荔枝、 龙眼同科， 现广泛
分布于东南亚、 中美洲等地区[1]。 红毛丹的果皮多
毛， 果壳含抗氧化和抗菌活性成分， 果肉富含磷、
镁、 硫、 钙、 锌、 铁和锰， 具有极高的食用和药用
价值[2-4]。 目前， 红毛丹的研究范围主要集中在栽
一种高质量的红毛丹基因组
DNA提取方法①
林兴娥 1)② 葛 宇 1) 周兆禧 1)
臧小平 1) 王甲水 1) 肖正新 2) 马蔚红 1)③
(1 中国热带农业科学院海口实验站 海南海口 570102；
2 海南省保亭县国营农场管理局 海南保亭 572300)
摘 要 为了提取高质量的红毛丹基因组 DNA， 本研究以红毛丹叶片为试材， 比较改良 CTAB法、 改良 SDS法和
试剂盒法对红毛丹叶片 DNA的提取效果。 结果表明： 3种方法均可从红毛丹叶片中提取 DNA， 但由于改良 CTAB
法通过多次洗涤， 并联合使用 PVP和 β-巯基乙醇处理， 可有效去除红毛丹叶片中的多糖、 多酚和蛋白质等物
质， 所获得的 DNA纯度高且完整性较好， 可用于 SRAP-PCR等分子标记分析。 此结果为后续分子生物学等相关研
究奠定了基础。
关键词 红毛丹 ； DNA提取 ； 改良 CTAB法 ； SRAP
分类号 Q949.755.5
A High-quality Extraction Method for Genomic DNA of Rambutan
（Nephelium lappaceum）
LIN Xinge1) GE Yu1) ZHOU Zhaoxi1)
ZANG Xiaoping1) WANG Jiashui1) XIAO Zhengxin2) MA Weihong1)
(1 Institute of Banana and Plantain, CATAS, Haikou, Hainan 570102;
2 Bureau of State Farm, Baoting, Hainan 572300)
Abstract To obtain high-quality rambutan gDNA used for SRAP-PCR analysis, total DNA was
comparatively extracted from fresh leaves by using variant methods of the improved CTAB, improved
SDS and a commercial plant genomic DNA Kit respectively. The results showed that all three methods
were available for DNA extraction from rambutan leaf, but improved CTAB method by adding
β-mercaptoethanol and PVP with rinse and two times washing, could effectively remove polyphenols,
polysaccharides, protein and other substances of samples. The yield high-quality DNA from fresh leaves
could be used for SRAP-PCR analysis.
Keywords rambutan (Nephelium lappaceum) ; DNA extraction ; improved CTAB method ; SRAP
① 基金项目 ： 海南省自然科学基金项目(No. 20153062)； 2014年南亚热带作物研究所基本科研业务费专项(No.
1630062014018)。
收稿日期： 2015-06-08； 责任编辑/黄东杰； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 林兴娥(1981～)， 女， 硕士， 研究实习员， 主要研究方向为热带优稀果树种质资源学与遗传育种，
E-mail:linxinge0410@163.com。
③ 通讯作者： 马蔚红， 女， 研究员， E-mail:zjwhma@163.com。
Vol．35, No．8
2015年8月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第35卷第8期
Aug． 2015
16- -
林兴娥 等 一种高质量的红毛丹基因组DNA提取方法
培、 繁殖、 病虫防治、 果实采后保鲜、 化学成分分
离提取等应用技术方面[5-7]， 而在无性系资源评价、
育种改良、 基因组变异、 重要性状遗传与分子形成
机制等基础领域的研究尚未开展。 借助分子标记技
术， 检测基因组DNA水平的遗传变异已成为物种进
化分析、 种质资源评价、 分子遗传育种等研究的重
要策略。 而提取高质量的DNA是开展相关工作的技
术基础。
随着现代分子生物学的巨大进步， 已经发展出
许多植物 DNA提取的方法， 广泛应用的 CTAB法、
SDS法、 尿素法等均通过裂解植物细胞， 释放蛋白
质等内含物于有机溶剂中， 从而使核酸分离在水相
中。 但由于不同物种、 部位在组织结构、 化学成分
等方面存在差异， 不同方法对具体实验材料的提取
效果差异很大。 红毛丹的组织细胞中含有大量的多
酚、 多糖及其他脂类、 色素等次生代谢物质[8-10]，
采用常规方法分离出来的DNA易被多酚氧化呈现褐
色， 同时由于DNA溶液粘稠， 采用多次酚-氯仿抽
提也不能得到高质量的 DNA， 并且在多次抽提过程
中易受机械剪切作用而发生降解， 不能作为PCR模
板进一步分析使用。 本试验通过对比改良CTAB法、
改良SDS法和商品化试剂盒 3种方法的提取效果，
旨在选择一种简便、 快捷、 经济的高质量红毛丹基
因组 DNA提取方法， 为进一步开展红毛丹 SRAP等
分子标记方面的相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料均取自海南省保亭热作所红毛丹种质
资源圃， 采集无病虫害的叶片放入冰壶中带回实验
室， 置于-80℃超低温冰箱内保存备用。 本研究随
机选取3个样品作为试验材料， 每个样品重复3次。
1.2 方法
1.2.1改良 CTAB法
改良 CTAB法参照李明芳等[1]的方法， 在叶片
研磨时预先加入PVP粉末， 研磨成粉末后加入2×
CTAB提取液和 β-巯基乙醇， 离心取上清后分别用
等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异
戊醇(24∶1)进行振荡抽提 DNA。 具体操作方法为：
称取幼嫩叶片 0.2g， 加入 0.03gPVP和液氮磨成
细粉， 然后转入 2.0mL预冷冻离心管中， 再加入
800μL65℃预热的CTAB提取液[2%(m/V)CTAB， 100mmol/L
Tris·HCl， 20mmol/LEDTA， 1.4mol/LNaCl， 2%(m/V)PVP， pH
调至 8.0]和 20μLβ-巯基乙醇充分混匀 ， 65℃温
浴 30 min， 期间轻摇 2次； 水浴完成后离心(15℃，
12000r/min)15min取上清液， 加入等体积的酚∶氯
仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提上清液， 颠倒使之充分
混匀， 离心(4℃， 12000 r/min)15 min取上清； 再加
入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次， 颠倒混
匀， 离心(4℃， 12000 r/min)15 min取上清； 加入等
体积的异丙醇， 混匀后可见丝状或絮状沉淀， 即为
DNA粗提物， 用 70%乙醇洗涤 3遍， 吹干 ； 加入
100μL超纯水溶解DNA， 再加入0.5μLRNaseA液
(10mg/mL)， 37℃水浴消化 30min， 最后将获得的
DNA置于-20℃保存备用。
1.2.2改良 SDS法
改良SDS法参照曹辉庆等[12]的方法， 在叶片研
磨时预先加入PVP粉末， 研磨至粉末后加入SDS提
取缓冲液和 β-巯基乙醇， 离心取上清后分别用等
体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊
醇(24∶1)进行振荡抽提DNA。 具体操作方法为： 称取
幼嫩叶片0.2g， 加入0.03gPVP和液氮磨成细粉，
然后转入 2.0mL预冷冻离心管中， 再加入 800μL
65℃预热的 SDS提取缓冲液[100 mmol/L Tris·HCl(pH
8.0)， 50mmol/L EDTA(pH 8.0)， 50mmol/L NaCl， 2%(m/V)
PVP， 2%SDS溶液(m/V)]和 20μLβ-巯基乙醇充分混
匀， 65℃温浴30min， 期间轻摇2次； 水浴后离心
(15℃， 12000 r/min)15 min， 取上清液， 后续操作同
1.2.1。
1.2.3试剂盒法
称取幼嫩叶片 0.2g， 加入液氮充分研磨， 用
天根生化科技(北京)有限公司生产的 DNA secure
plantKit(D2485-01)新型植物基因组 DNA提取试
剂盒进行DNA提取， 具体操作见产品说明书。
1.2.4DNA质量检测
取DNA样品5μL用 ddH2O稀释混匀 20倍， 用
紫外分光光度计测定其 OD230nm、 OD260nm、 OD280nm值。
根据 OD260nm值估测其浓度， 根据 OD260nm/OD280nm值
和 OD260nm/OD230nm值 估 测 其 纯 度 。 DNA浓 度＝
OD260nm×测定样品体积×稀释倍数； DNA得率＝DNA
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2015年8月 第35卷第8期热带农业科学
浓度×总样品体积/样品鲜重。
取DNA样品 8μL， 加入 3μL溴酚蓝上样缓冲
液， 用 1%琼脂糖凝胶电泳 120V电泳 18min后拍
照， 判断DNA的质量和完整性。
1.2.5SRAP分子标记验证提取效果
以3种提取方法获得的样品DNA为模板， 采用
引物组合ME5/EM3进行SRAP-PCR扩增， 以检测3种
DNA提取方法的效果。 SRAP-PCR反应体系为20μL，
其中含 DNA模板 20 ng、 dNTPs 0.2mmol/L、 引物
0.4μmol/L、 rTaq酶0.8U、 Mg2+2.0mmol/L。 扩增程
序为： 94℃预变性5min； 94℃变性1min， 35℃复性
1min， 72℃延伸70s， 5个循环； 94℃变性1min，
50℃复性1min， 72℃延伸70s， 35个循环； 72℃
延伸 5min， 4℃保存。 扩增反应结束后取 5μL扩
增产物进行电泳， 染色后在紫外凝胶成像仪上观察
并拍照分析。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法所得 DNA的纯度和得率
用紫外分光光度法测定DNA纯度时， 一般情况
下， 若1.9＞OD260nm/OD280nm值＞1.8时， 说明该DNA
样品受杂质污染最少， 质量最佳； 若 OD260nm/OD280nm＞
1.9时， 表明DNA样品可能受到少量RNA的污染； 如
果其比值小于1.8， 则说明有蛋白质等杂质存在[13]。
由表1可知， 改良CTAB法提取出的DNA质量较好，
纯度较高， 杂质量少， 说明 DNA样品中的蛋白质、
酚类和多糖去除充分， 较好地避免了RNA污染， 可
很好的满足后续实验的需求； 改良SDS法提取得到
的DNA呈褐色， 含有较多的蛋白质、 酚类和多糖等
杂质， 纯度较低； 试剂盒法提取DNA得率最低， 这
是由于红毛丹叶片含有丰富的多糖， 提取过程中多
糖很容易形成粘稠的胶状物质， 难于溶解， 堵塞柱
子造成DNA得率低。
2.2 琼脂糖凝胶电泳
从图1可知， 3种方法均能从红毛丹的叶片中
提取出完整的DNA， 其大小均在4.5kb以上。 但改
良SDS法提取的DNA量相对较少， 同时含有胶状粘
稠杂质， 提取效果的稳定性差； 而采用改良 CTAB
法提取的DNA量明显高于改良SDS法， 其电泳条带
明显比改良SDS法的亮， 提取效果的稳定性好； 试
剂盒提取3个材料DNA所得的效果并不相同， 有些
材料的DNA条带较亮， 有些较暗， 条带亮度与DNA
产量呈正相关， 少数点样孔存在微弱荧光， 表明有
蛋白质污染， 还存在少量RNA污染， 这可能是加入
RNase A量不足或37℃水浴消化时间过短造成。 综
合考虑， 改良CTAB法可较好的去除蛋白质和多糖，
DNA质量较好， 最适于红毛丹成熟和幼嫩叶片基因
组DNA的提取。
2.3 SRAP-PCR扩增验证
为了进一步评价改良 CTAB法、 改良 SDS法和
试剂盒法提取的DNA质量对后续试验的影响， 分别
以3种提取方法获得的DNA为模板， 对其
进行 SRAP-PCR扩增检测。 由图 2可知 ，
改良 CTAB法提取的 DNA模板均可扩增出
比较清晰的条带， 且稳定性好； 试剂盒法
提取的DNA纯度高， 但不同背景的植物材
料差别较大， SRAP-PCR扩增结果稳定性
较差； 而改良SDS法提取的DNA未成功扩
表1 3种方法提取的红毛丹叶片DNA纯度和质量的比较
DNA提取方法 OD260nm/OD280nm
DNA浓度
/(μg·mL-1)
DNA得率
/(μg·g-1FW)
改良CTAB法 (1.81±0.06) (706.23±326.23) (353.11±16 )
改良SDS法 (1.15±0.33) (587.36±1 9.74) (293.68±8 .87)
试剂盒法 (1.21±0.19) (111.47±38 70) (55.74±19 35)
图1 不同方法提取红毛丹基因组DNA的电泳图
说明： A： 改良CTAB法； B： 改良SDS法； C： 试剂盒法。
4.5
2.0
0.2
kb
A
4.5
2.0
0.2
kbB
4.5
2.0
0.2
kb
C
M 1 2 3
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林兴娥 等 一种高质量的红毛丹基因组DNA提取方法
3 讨论与结论
目前， 关于去除荔枝、 龙眼组织中多糖、 多
酚、 蛋白质等杂质的研究报道较多。 如易干军等[14]
比较了传统 SDS法和 CTAB法提取荔枝基因组 DNA
的效果， 结果表明2种方法均不适宜荔枝DNA的提
取； 分别在CTAB缓冲液中加入 50mmol/L的 β-巯
基乙醇、 5%PVP和 10 mmol/LNa2S2O5， 比较结果发
现加入 10mmol/LNa2S2O5提取的DNA质量较好。 刘
锴栋等[15]采用改良 2×CTAB法即在缓冲液中加入
β-巯基乙醇和 PVP， 且把温浴时间延长至 2h， 可
有效去除野生龙眼叶片中大部分多糖、 多酚、 单
宁、 色素等物质， 提取到的 DNA呈乳白色絮状沉
淀 ， 质量较高。 肖璇等[16]采用改良的 CTAB法和
SDS法， 即在核裂解之前先破碎细胞， 将存在于细
胞质中的次生物质去除后再裂解细胞核， 细胞核裂
解后用氯仿/异戊醇连续抽提 2次以上， 去除了大
部分蛋白和色素 ， 同时将 CTAB浓度提高到 3%
(m/V)， 增强了裂解细胞和去杂质的能力， 在改良
SDS法中异丙醇沉淀前加入1/5体积的5mol/LNaCl，
进一步去除细胞碎片及其他杂质， 提取到的DNA纯
度高。 目前关于红毛丹DNA提取的研究尚未见报道。
本试验在参考前人研究的基础上， 结合红毛丹的特
性， 主要通过预先在材料中加入PVP粉末再进行研
磨， 然后转入含2%(V/V)β-巯基乙醇和2%(m/V)PVP
的提取液中， 无论材料的老嫩程度， 均可有效防止
褐变及多糖形成的胶状物质。 改良 CTAB法较改良
SDS法提取到的DNA纯度更高， 呈乳白色， 可有效
去除色素。 通过PCR检测， 结果发现提取的DNA可
用于后续研究。
从本试验结果可看出， 不同的红毛丹品系间得
到的DNA纯度和产率不一致， 可能是由于不同红毛
丹品种中多糖和酚类的组成和含量具有一定的差
异。 植物组织中多酚、 多糖等代谢物质随着组织器
官的成熟而增加[16-19]， 因此， 在改良 CTAB法的基
础上， 还需根据红毛丹不同的品系、 取材部位、 发
育程度及试验要求等进一步调节试验成分的组成，
以便探索一种更好的操作方法， 最终得到更高质量
的DNA。
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糖、 色素等反应抑制物。 综上所述， 改良CTAB法提
取的红毛丹基因组DNA纯度高， 杂质去除充分， 通
用性好， 完全可满足SRAP等分子标记分析的需要。
4.5
2.0
0.5
0.2
kb
改良CTAB法 试剂盒法 改良SDS法
M 1 2 3 1 2 3 M 1 2 3
图2 3种方法提取红毛丹基因组DNA的SRAP-PCR扩增电泳图
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(上接第8页)
球茎是香蕉着生根系、 叶片和吸芽的重要器
官， 是整个植株储存养分的中心[3]， 也是吸芽早期
维持正常生长的养分来源。 如果吸芽没有长出足够
根系就脱离球茎， 就会严重影响吸芽自身的正常生
长。 比如此次台风的打击， 在蕉园中出现了连根倒
和半倒两种不同的倒断形式， 连根倒的母株所抽生
的吸芽会因为缺乏养分供给导致生长缓慢， 吸芽的
高度、 叶片数都明显低于半倒植株。 而健壮的香蕉
植株是香蕉稳产高产的基础[3]， 因此对于蕉园中连
根拔起的母株， 对其产生的吸芽要适当采取生根、
补肥措施， 缩小与其他母株产生的吸芽的差异， 使
蕉园中吸芽生长整体保持一致， 保证吸芽长成的母
株具有相同的生长期。
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