全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 4期，第 799-803页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.4, 799-803
技术改进
Upgraded Technology
RAPD分析用白花丹参叶片 DNA的提取方法
叶文静 韩纪举 蔡洪信 赵晓民 夏作理 *
泰山医学院,泰安, 271000
*通讯作者, zuoli-xia@163.com
摘 要 本研究采用改良 CTAB法和 SDS法提取新鲜白花丹参叶片的基因组 DNA，初步筛选 RAPD扩增
引物。结果表明改良 CTAB法提取的 DNA较 SDS法质量好，随机引物 p2扩增条带相对较为清晰。再利用
p2随机引物对 2种方法提取的 DNA进行 RAPD检测比较，结果显示仅改良 CTAB法能扩增出有效条带，
说明改良 CTAB法更适合用于白花丹参基因组 DNA的 RAPD检测分析。本文将为白花丹参叶片 DNA的
提取提供方法学参考。
关键词 白花丹参, DNA提取, RAPD,改良 CTAB法
The Extraction Methods of Leaf Genomic DNA of Salvia miltiorrhiza Bge
f.alba for RAPDAssays
Ye Wenjing Han Jiju Cai Hongxin Zhao Xiaomin Xia Zuoli *
Taishan Medical College, Taian, 271000
* Corresponding author, zuoli-xia@163.com
DOI: 10.3969/gab.029.000799
Abstract In this study, we extracted the genomic DNA from the fresh leaves of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba
by using an improved CTAB method and SDS method and preliminarily screened RAPD amplification primers.
The results showed that the DNA quality of improved CTAB method was better than SDS method. On the other
hand, the amplification bands of random primer 2 was clearer than others. Then we carried out RAPD assays
comparison between these two methods with random primer 2, the result displayed that we got the efficiency
fragments only by the improved CTAB method, which illuminated that the improved CTAB method was more
suitable for RAPD assays analysis for the genomic DNA of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba. So the improved
CTAB method was more proper for genomic RAPD assay of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba. Consistent with
these results, this paper would provide a methodology reference for extracting the genomic DNA from the fresh
leaves of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba.
Keywords Salvia miltiorrhiza Bge f.alba, DNA extraction, RAPD, Improved CTAB method
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RAPD (random amplified polymorphic DNA)是上
世纪 90 年代发展起来的一项 DNA 指纹图谱技术
(Williams et al., 1990)。RAPD技术具有快速、简便、经
济、规范等优点，无疑是对中药材鉴定的重要补充
(许腊英等, 2006; Shinde et al., 2007)。在动植物、微生
物种属鉴定、亲缘关系划分以及生物多样性分析等
领域有着广泛的应用(Akbulut et al., 2009; Emadpour
et al., 2009)。DNA指纹图谱技术用于中药材的质量
标准化，将对中药现代化、规范化研究管理和应用起
到重要作用(华国栋等, 2005,中国医学研究与临床,
3(3): 43-47)。郭宝林等(2000,中草药, 31(12): 951-954)
选取代表厚朴主要分布区的 11个产地 33个材料作
为样本，利用 RAPD技术进行聚类分析，分别建立了
相关 RAPD指纹库。胡珊梅等(2002)运用 RAPD技术
对福建、江西、四川产的泽泻进行基因检测分析，得到
321个 RAPD标记，其中多态性标记68个，发现道地
基因组学与应用生物学
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性药材建泽泻与川泽泻有较近的遗传距离，两者与
江泽泻均有较远的遗传距离，与历来认为的建泽泻
与川泽泻质量较好的评价标准一致。由于 RAPD方
法需要的检品量少，所以非常适于伪品较多的名贵
药材及易混药材，如冬虫夏草、番红花、麝香、天然牛
黄和熊胆等的鉴别。特别是对以组织形式入药的动
物类中药，由于形态、组织和化学鉴别都存在困难，
RAPD方法就显得更为重要了。
丹参(Salvia miltiorrhiza)始载于《神农本草经》，
后被《本草纲目》等记载，具有“活血化淤、消肿止痛、
养血安神”的功效。山东地区丹参资源主要为野生紫
花丹参、种植紫花丹参和种植白花丹参。白花丹参是
山东特有珍稀物种，是丹参的白花变型。白花丹参除
了具有丹参的生物活性和用途外，还对治疗血栓性
脉管炎具有独特疗效(王峰祥等, 2009,中国现代中药,
11(8): 17-18)。
随着对泰山特有道地药材白花丹参药效特异性
研究的深入，近年来逐渐出现涉及白花丹参的多种
分子标记研究报道。王冰等(2007)利用 AFLP分子标
记技术，对来自中国 27个不同地理居群的丹参遗传
多态性进行了分析，从分子水平上比较了丹参的分
子差异，认为白花丹参与来自烟台的丹参居群联系
较为紧密。邓科君等(2009)针对丹参 EST进行 SSR
标记挖掘，进行了丹参居群间多样性分析以及鼠尾
草属植物种间可转移性验证。王庆浩和张伯礼(2009)
利用 TRAP分子标记技术在分子水平上鉴别了 4个
不同产地的丹参品种，显示丹参的遗传多样性水平
极低，各种质间亲缘关系很近，认为不同地区间的丹
参遗传分化并不十分显著，其原因有待进一步探讨。
RAPD技术可以不知道研究对象的基因组序列信息
进行研究，因而在目前绝大多数动植物中药材 DNA
序列尚不清楚的情况下，在中药材品种研究方面
RAPD标记就显得更具有应用前景(邵鹏柱和曹晖,
2004,复旦大学出版社, pp.102-103)。本研究预期建
立适合 RAPD分析的白花丹参新鲜叶片 DNA提取
方法，为随后建立重复性强、稳定性好的白花丹参
RAPD扩增反应体系，进一步在分子水平上鉴别其
近缘品种提供基础。
1结果与分析
1.1改良CTAB法提取白花丹参叶片 DNA
采用改良的 CTAB法提取白花丹参叶片DNA，
通过电泳检测可以看到(图 1)，所提取的白花丹参
叶片基因组 DNA普遍都于点样孔附近有一条清晰
的亮带，谱带齐整，没有弥散现象，说明 DNA比较完
整，降解少。点样孔内均很干净，说明酚类、多糖等杂质
去除得比较彻底，所得DNA可用于进一步的实验。
1.2 SDS法提取白花丹参叶片 DNA
采用 SDS法提取白花丹参叶片 DNA，电泳检测
结果显示(图 2)所获得的 DNA完整，点样孔内干净，
表明所提取的 DNA纯，几乎不含多糖等杂质。
1.3 DNA纯度测定
用紫外分光光度计测量得到 DNA样品的吸光
度比值，读取 OD260/OD280和 OD260/OD230的平均值。
OD260/OD280的比值在 1.8 左右表示 DNA 纯度相当
高，符合要求纯度高的纯化 DNA其 OD260/OD280在
1.6~1.8之间，低于 1.6则说明含有蛋白质或苯酚杂
质，高于此范围表明样品中含有 RNA。OD260/OD230应
当大于 2.0且小于 2.4，一般小于 2.0说明有胍基或
巯基乙醇等小分子盐类残留。改良 CTAB法和 SDS
法提取的基因组 DNA 的测量结果分别如表 1 所
示。两种方法的 OD260/OD230均偏小，可能与低温乙
图 1改良 CTAB法提取白花丹参叶片 DNA的电泳检测
注: M: λ-Eco14Ⅰ片段; 1~2:样本 1; 3~4:样本 2
Figure 1 The electrophoresis assay for genomic DNA extracted
by the improved CTAB method from Salvia miltiorrhiza Bge f.
alba leaf
Note:M: λ-Eco14Ⅰ fragment; 1~2: Sample 1; 3~4: Sample 2
图 2 SDS法提取的白花丹参叶片 DNA电泳检测
注: M: λ-Eco14 Ⅰ片段; 1: 样本 1; 2: 样本 2; 3: 样本 3; 4: 样
本 4
Figure 2 The electrophoresis assay for genomic DNA extracted
by SDS method from Salvia miltiorrhiza Bge f.alba leaf
Note: M: λ-Eco14 Ⅰ fragment; 1: Sample 1; 2: Sample 2; 3:
Sample 3; 4: Sample 4
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醇沉淀有关。
1.4 RAPD扩增
1.4.1 RAPD扩增引物的初步筛选
所提取 DNA 经过 PCR 扩增 RAPD 多态性检
测，Ready-to-go RAPD反应试剂盒所提供的 6 条随
机引物中有 4条成功扩增出条带(图 3)，表明该方法
所提取的白花丹参 DNA完全可以满足 RAPD分析
的要求。同时，p2随机引物的扩增条带相对较为清
晰，故选择 p2随机引物用于进一步的扩增。
1.4.2 p2随机引物 RAPD扩增 2种方法提取白花丹
参基因组 DNA的比较
对改良 CTAB方法和 SDS方法提取的白花丹
参叶片基因组 DNA 同时进行 p2 随机引物引导的
RAPD扩增检测(图 4)。SDS法提取的两例叶片 DNA
均无扩增条带，而改良 CTAB法提取的 DNA则能扩
增出清晰的预期条带，表明改良 CTAB法提取的白花
丹参的基因组DNA能够进行下游 RAPD检测分析。
2讨论
由于中药植物本身含有复杂多样的次生代谢产
物，因此 DNA提取的方法要求复杂，需要不断改进
(郭宝林等, 2000,中草药, 31(12): 951-954)。中药材
DNA提取要解决的主要问题是在提取过程中去除
多酚、多糖等杂质，并防止 DNA的降解。最常见的
DNA提取方法为 CTAB法和 SDS法。CTAB法因提
取的 DNA纯度高、效果稳定，成为提取植物 DNA的
经典方法。该方法比较适用于草本植物和不含酚类
或含酚类较少的植物 DNA提取。但对木本植物和酚
类含量丰富的植物，适当提高 CTAB的浓度也可以
得到质量较高的 DNA (侯艳霞等, 2009)。郝岗平等
(2006)用 4×CTAB提取液从白花丹参中分离出可直
接用于 AFLP分析的高质量 DNA。在提取 DNA的
过程中加入抗氧化剂物质(PVP, Vc和 β-巯基乙醇
等)，有效地抑制了酚类物质的氧化，更有效地抑制了
DNA的氧化，保证了高质量 DNA的提取成功。
本文针对 RAPD分析，尝试应用改良 CTAB方法
和 SDS法比较提取富含多糖和多酚的白花丹参鲜叶基
因组DNA。和 SDS方法相比，CTAB法OD260/OD280比
值更好，说明改良 CTAB法提取的 DNA蛋白质污染
少，酚类杂质去除得更干净；虽然两者的纯度测定
OD260/OD230均小于 1，这可能与操作时乙醇沉淀的低
温处理有关，但是改良 CTAB法提取的基因组 DNA
纯度检测比值均要明显高于 SDS法。用纯度较好的
改良 CTAB法提取的基因组 DNA进行 RAPD扩增
引物的初步筛选结果表明，6条随机引物当中有 4条
可以有效扩增。多次重复实验结果表明，其中 p2随
机引物(5-AACGCGCAAC-3)的扩增条带相对清晰，
且在同一个实验室的同一台 PCR仪上进行的 PCR，
RAPD分析用白花丹参叶片 DNA的提取方法
The Extraction Methods of Leaf Genomic DNA of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba for RAPD Assays
表 1不同提取方法所得 DNA的紫外分光光度法检测
Table 1 The UV assays for different extraction methods
方法
Methods
改良 CTAB法
Improved CTAB method
SDS法
SDS method
OD260/OD280
1.67
1.15
OD260/OD230
0.77
0.48
图 3 RAPD扩增产物的电泳结果
注: M: DL2000 DNA分子量标记; 1:随机引物 p1; 2:随机引物
p2; 3:随机引物 p3; 4:随机引物 p4; 5:随机引物 p5; 6:随机引
物 p6
Figure 3 Agarose gel electrophoresis result of RAPD amplified
products
Note: M: DL2000 DNA molecular Marker; 1: Random primer
p1; 2: Random primer p2; 3: Random primer p3; 4: Random
primer p4; 5: Random primer p5; 6: Random primer p6
图 4随机引物 p2对改良 CTAB法和 SDS法提取的白花丹参
叶片基因组 DNA的 RAPD扩增检测
注 : M: DL2000 DNA 分子量标记 ; 1,2: 改良 CTAB 法 ; 3,4:
SDS法
Figure 4 RAPD amplification assays of genomic DNA extraction
from Salvia miltiorrhiza Bge f.alba leaves by improved CTAB
method and SDS method respectively with the random primer p5
Note: M: DL2000 DNA molecular Marker 1,2: Improved CTAB
method; 3,4: SDS method
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基因组学与应用生物学
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扩增结果条带要更清晰、可重复性更好(杨竹雅等,
2009)，可以应用于进一步的实验当中。
进一步分析表明，经 SDS法提取相同组织的基
因组 DNA虽然电泳检测无降解，但用 p2随机引物
进行 RAPD不能扩增出有效目的条带，说明 SDS法
不适合用来提取白花丹参组织的基因组 DNA进行
RAPD检测。
通过以上比较，我们认为改良 CTAB法能够有
效提取白花丹参的基因组 DNA进行下游RAPD检测
分析。本实验为下一步应用 RAPD手段分析白花丹
参和其近缘种紫花丹参，以期获得重现性好、专属性
强的 RAPD指纹图谱打下基础。
3材料与方法
3.1供试材料
白花丹参(Salvia miltiorrhiza Bge f.alba)鲜叶片组
织取自泰山医学院校区的花期植株，均经本校药学
院鉴定。
3.2试剂与仪器
低温台式离心机 3K30 (Sigma)，Icycler温度梯度
PCR扩增仪(Bio-rad)，Quantity ONE凝胶成像分析系
统(Bio-rad)，北京六一 DYY-Ⅲ水平电泳装置，紫外
分光光度计(Amarsham)。RAPD引物(p2: 5-AACG
CGCAAC-3)购自美国 GE 公司，Tris、NaCl、EDTA、
β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、琼脂糖、十六烷基三甲基溴
化铵(CTAB)和 SDS等购自 Sigma公司。RAPD反应
试剂盒(Ready-to-go RAPD analysis beads)购自美国
GE公司。
3.3改良 CTAB法提取丹参叶片 DNA
采用改良后的 CTAB法(林光美等, 2010;段中岗
等, 2009)提取丹参叶片 DNA。与 CTAB法相比，提取
缓冲液 (2×CTAB, 100 mmol/L Tris-Cl, 20 mmol/L
EDTA, 1.4 mol/L NaC1)中加入了 2% β-巯基乙醇和
4% PVP，其它实验操作按照参考文献进行。
3.4 SDS法提取丹参叶片 DNA
采用醋酸钾 /SDS沉淀法(邵鹏柱和曹晖, 2004,
复旦大学出版社, pp.36-37)提取丹参叶片 DNA，并在
裂解缓冲液中加入了 10 mmol/L的 β-巯基乙醇。
3.5 DNA定性定量检测
3.5.1 DNA分子完整性检测
取 10 μL基因组 DNA溶液在 1.0%琼脂糖凝胶
(含 10 μg/mL EB)上，于 1×TAE 电泳缓冲液中，在
5 V/cm的电场强度下电泳 1 h。以 λ-Eco14Ⅰ片段作
为标记物，比较 DNA分子量大小。凝胶在 Gel Doc
系统下观察，图像存入计算机。
3.5.2 DNA浓度和纯度检测
取一定量的 DNA溶液稀释 40 倍后，用 Amar-
sham 紫外分光光度计测定其在 260 nm、280 nm 和
230 nm 下的吸光度，读取 DNA 的浓度；依据读取
的 OD260/OD280和 OD260/OD230之比值判断 DNA纯度：
OD260/OD280的比值在 1.8左右表示 DNA纯度相当高，
低于 1.6则说明含有蛋白质或苯酚杂质。OD260/OD230
应当大于 2.0且小于 2.4，在此范围之外说明有污染，
一般小于 2.0说明有胍基或巯基乙醇残留。
3.6 RAPD 扩增引物的初步筛选
根据 Ready-to-go RAPD 反应试剂盒说明书进
行，分别用试剂盒提供的 6条随机引物进行基因组
DNA的扩增，初步筛选 RAPD的扩增引物，扩增程序
为：95℃预变性 4 min，然后接 45个循环 95℃ 1 min，
36℃ 1 min，72℃ 2 min。扩增产物在 1%的琼脂糖凝
胶上电泳分离，溴化乙锭染色，Gel Doc凝胶成像分
析系统观察分析。
3.7 p2随机引物 RAPD扩增不同方法提取白花丹参
基因组 DNA的比较
用初步筛选出的扩增条带最清晰的 p2随机引
物扩增两种不同方法提取的白花丹参叶片基因组
DNA。扩增程序以及后面步骤均同 3.6叙述。
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