全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:191-194
文章编号:1001-6880(2012)02-0191-04
收稿日期:2010-07-01 接受日期:2010-11-03
基金项目:国家自然科学基金项目(20775092)
* 通讯作者 Tel:86-731-88830833;E-mail:jiangxinyu@mail． csu． edu． cn
固相萃取-反相高效液相色谱法
分析粗裂地钱中的黄酮类化合物
周计生，陈晓青，蒋新宇*
中南大学化学化工学院，长沙 410083
摘 要:建立了粗裂地钱中四种黄酮类化合物的固相萃取高效液相色谱分析方法。样品经 95% 乙醇溶液提取
后，用 C18固相萃取小柱预处理，采用甲醇∶乙腈∶ 0． 5%乙酸(150∶ 100∶ 150，V/V)为流动相，C18色谱柱(150 mm ×
4． 6 mm，5 μm)进行分离与测定。低、中、高浓度下方法的回收率为 89． 70% ～ 97． 95%，RSD 小于 6%。结果表
明，该法简便快速，节省溶剂，分析结果准确可靠，重复性好，可用于粗裂地钱中四种黄酮类化合物的含量分析。
关键词:粗裂地钱;黄酮类化合物;固相萃取;反相高效液相色谱
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Determination of Flavonoids in Marchantia paleacea by
Reverse Phase HPLC with Solid-Phase Extraction
ZHOU Ji-sheng，CHEN Xiao-qing，JIANG Xin-yu*
School of Chemistry and Chemical Engineering，Central South University，Changsha，410083，China
Abstract:A method was developed for the simultaneous determination of four flavonoids in Marchantia paleacea by SPE-
HPLC． The sample was extracted by 95% ethanol and purified through the Solid Phase Extraction column with C18 as
stationary phase． Kromasil C18(150 mm ×4． 16 mm，5 μm)was taken as chromatographic column． The mobile phase was
composed of methanol-acetonitrile-0． 5% acetic acid (150∶ 100∶ 150，V/V)． All analytes showed good linearity in the
test ranges and the recoveries were 89． 70% -97． 95% ． Satisfactory precisions were obtained with relative standard devia-
tions less than 6% ． The method was proved to be simple，accurate，and repeatable，and can be used for the content analy-
sis of flavonoids in M． paleacea．
Key words:Marchantia paleacea;flavonoids;Solid Phase Extraction;RP-HPLC
地钱属植物(Marchantia)属于苔藓植物门
(Bryophyta) ，苔纲(Hepaticae) ，地钱目(Marchantia-
les) ，地钱科(Marchantiaceae) ，为叶状体苔类。地钱
属植物广布于各地［1］，其中我国有 10 多种地钱属植
物，除地钱(M． polymorpha)以外还有拳卷地钱(M．
convoluta)、粗裂地钱(M． paleacea)和风兜地钱 (M．
diptera)等。地钱药用历史悠久，民间记载了许多地
钱属植物的应用，如粗裂地钱具有清热利湿、解毒敛
疮功效，主治湿热黄疸、疮痈肿毒、毒蛇咬伤、水火烫
伤、刀伤、骨折、抗菌等，还具有细胞毒性，抗真菌、抗
微生物、肌肉松弛等生物活性［2］。
粗裂地钱化学成分主要包括挥发油［3］、联苄类
和双联苄类化合物［4，5］、黄酮类化合物等［6］，目前关
于黄酮类化合物大多采用液-液萃取作为前处理手
段［7］和梯度洗脱高效液相色谱法测定［8，9］，操作繁
琐，测定时间长，且样品萃取不完全，重现性较差。
本研究采用 C18固相萃取法作为反相高效液相色谱
分析的前处理方法，对粗裂地钱中黄酮类化合物进
行分离与测定，操作简单，节省时间与溶剂，分析结
果准确可靠，重复性好，结果令人满意。
1 实验部分
1． 1 仪器、试剂和原料
岛津 LC-2010A 型液相色谱仪，二极管阵列
(PDA)检测器，LC-solution 色谱工作站。真空旋转
蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司) ;UV-9600 紫外
检测器(北京瑞利仪器有限公司) ;C18固相萃取小柱
(500 mg，6 mL，Varian公司 ) ，使用前先用 5 mL 甲
醇，再用 5 mL 二次水活化。
冰乙酸、乙醇(均为 AR 级) ，甲醇、乙腈(均为
色谱纯) ;槲皮素、芹菜素、4，5，6-三羟基-3，7-二甲
氧基黄酮和 5，7，4-三甲氧基黄酮对照品由中国药
品生物制品鉴定所提供。地钱原料采于湖南衡阳地
区，经湖南师范大学生命科学学院刘应迪教授鉴定
为粗裂地钱(Marchantia paleacea)。
1． 2 色谱条件
色谱柱:Kromasil C18柱(150 mm × 4． 6 mm，5
μm);流动相为甲醇∶乙腈∶ 0． 5% 乙酸(150∶ 100∶ 150，
V /V) ;流速 0． 7 mL /min;检测波长 350 nm;柱温 25
°C;进样量为 20 μL。
1． 3 标准溶液的配制
分别准确称取对照品槲皮素 15 mg，4，5，6-三
羟基-3，7-二甲氧基黄酮 10 mg，芹菜素 10 mg，5，7，
4-三甲氧基黄酮 8 mg，加甲醇约 50 mL，微热溶解，
冷却至室温，加少量冰醋酸，置 100 mL容量瓶中，加
甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为 150、
100、100 mg /L和 80 mg /L的对照品储备液。
1． 4 样品溶液的制备
新鲜粗裂地钱全草洗净，晾干，粉碎至过 100 ～
200 目筛。称取干燥粗裂地钱粉末 20 g，用 95%乙
醇溶液回流提取三次，合并提取液。提取液以 4000
r /min 离心分离 20 min，取上层清液浓缩成褐色浸
膏，浸膏用甲醇溶解定容在 100 mL 容量瓶中。然
后取 0． 5 mL 溶液上已活化的 C18固相萃取小柱，先
用 5 mL 20% 的甲醇淋洗，再用 5 mL 70% 的甲醇
洗脱，收集 70% 的甲醇洗脱液，定容到 10 mL 容量
瓶中，用 0． 45 μm 针头过滤器过滤，既得供试样溶
液。对照品和供试品色谱图见图 1。
图 1 (a)样品色谱图和 (b)标准混合对照品色谱图
Fig. 1 Chromatograms of sample (a)and a mixture of standards (b)
1． quercetin 槲皮素;2． 4，5，6-Trihydroxyl-3，7-dimethoxyflavone 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮;3． apigenin 芹菜素;4． 5，7，4-Tri-
methoxyflavone 5，7，4-三甲氧基黄酮
2 结果与讨论
2． 1 色谱分离条件的选择
试验中先后采用乙腈-水、甲醇-水等多种流动
相体系进行分离，结果乙腈-水保留时间短、峰型紧
密、分离效果差;甲醇-水分离效果好，但保留时间过
长。由于黄酮化合物酚羟基在水溶液中容易发生电
离，电离后其极性增强，在固定相表面形成双重保留
机理，色谱峰脱尾严重，定量分析误差较大。如果加
入少量酸性调节溶液，如乙酸，可使黄酮类化合物电
离受到抑制，使分离效果和峰形得到改善。经实验
研究后使用甲醇∶ 乙腈 ∶ 0． 5% 乙酸(150 ∶ 100 ∶ 150，
V /V)作为流动相，流速为 0． 7 mL /min，使色谱峰得
到了很好的分离，结果较好。
2． 2 检测波长的选择
对四种黄酮类对照品溶液在 200 ～ 400 nm 进行
UV 扫描，发现四种黄酮类物质在 350 nm 波长处有
最大吸收，故选择 350 nm 作为检测波长。
2． 3 样品前处理
采用热回流提取法，考察了甲醇及 30%、50%、
70%、95% 乙醇作为提取溶剂时 4 种黄酮的提取效
果，发现以甲醇及 95% 乙醇为提取溶剂时黄酮的
提取率较高且二者相当，但甲醇作为提取物毒性较
大，故采用 95% 乙醇为提取溶剂。
地钱中除黄酮类物质外，还含有油脂类物质，蜡
质，色素等弱极性物质。该类物质会影响黄酮类物
质的检测，并且在本实验的流动相条件下不能完全
洗脱，在 C18柱上残留积累使色谱系统的反压增大，
并降低柱效，故样品分析前需作脱脂处理。一般文
291 天然产物研究与开发 Vol. 24
献报道用正己烷、石油醚等非极性有机溶剂进行脱
脂，但是用有机溶剂脱脂时间长，操作麻烦，还会在
一定程度上造成黄酮类物质损失，影响分析结果，因
此实验研究用固相萃取小柱进行样品预处理。取已
知质量浓度的混合标准溶液进固相萃取小柱，配比
一系列甲醇洗脱液，收集洗脱液进行 HPLC 测定，通
过计算四种黄酮物质的回收率来选择洗脱剂。槲皮
图 2 槲皮素和 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮洗脱
曲线
Fig. 2 Elution curve of Quercetin and 4，5，6-Trihydroxyl-
3，7-dimethoxyflavone
1．槲皮素;2． 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮
素和 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮洗脱曲线如
图 2。芹菜素和 5，7，4-三甲氧基黄酮的洗脱曲线
与槲皮素和 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮的洗
脱曲线相似。
从图中可以看出 20% 的甲醇无法将所需物质
洗脱，70% 的甲醇能完全洗脱。经色谱分析 30%
的甲醇水溶液中开始出现槲皮素和 4，5，6-三羟基-
3，7-二甲氧基黄酮，70% 的甲醇水溶液中槲皮素和
4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮回收率都在 96%
以上。70% 的甲醇水溶液中芹菜素和 5，7，4-三甲
氧基黄酮回收率也在 94% 以上。所以用 20% 的
甲醇作为清洗剂，70% 的甲醇作为洗脱剂能完全洗
脱分离所需分析的物质。
2． 4 回归方程及检测限
分别量取四种对照品溶液适量，加甲醇稀释制
成标准系列进样测定。以标准溶液质量体积浓度 C
(mg /L)对色谱峰面积 A 进行线性回归，结果表明:
各组分在各自浓度范围内线性关系良好，回归方程、
线性范围、相关系数及检出限(S /N = 3)见表 1。
表 1 校准曲线及检出限
Table 1 Calibration curve and detection limits
对照品种类
Component
线性范围
Lingear range /
(mg /L)
回归方程
Regression
equation
相关系数
r2
检出限
Detection Limit
(mg /L)
Quercetin槲皮素 1． 5 ～ 30 A = -52197 + 43176C 0． 9986 0． 4
4，5，6-Trihydroxyl-3，7-dimethoxyflavone
4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮
1． 0 ～ 20 A = -582 + 60148C 0． 9982 0． 8
Apigenin 芹菜素 1． 0 ～ 20 A = -1566 + 59247C 0． 9992 0． 7
5，7，4-Trimethoxyflavone 5，7，4-三甲氧基黄酮 0． 8 ～ 16 A = -441 + 72580C 0． 9995 0． 3
2． 5 方法的精密度
在 1． 2 色谱条件下，对四种混合对照品溶液重
复进样 5 次，测得峰面积，计算得 RSD 为槲皮素 2．
7%，4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮 1． 53%，芹
菜素 2． 01%，5，7，4-三甲氧基黄酮 1． 41% (n = 5)。
2． 6 方法的回收率
采用加标回收法，选取含量已知的粗裂地钱样
品，按高、中、低浓度分别精密加入四种混合标准品，
按“1． 4”节所述方法制备样品溶液，制成高、中、低 3
个供试品溶液，在上述色谱条件下，进样 20 μL进行
测定。计算回收率，结果见表 2。
表 2 方法的回收率(n = 3)
Table 2 Precision and recovery of the method (n = 3)
样品成分
Component
样品量
Background
(μg)
加入量
Added
(μg)
测得量
Detected
(μg)
回收率
Recovery
(%)
RSD
(%)
Quercetin槲皮素 8． 69
2． 00
4． 00
8． 00
10． 23
12． 37
16． 18
95． 70
97． 40
96． 94
1． 19
1． 07
1． 26
391Vol. 24 周计生等:固相萃取-反相高效液相色谱法分析粗裂地钱中的黄酮类化合物
4，5，6-Trihydroxyl-3，7-dimethoxyflavone
4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮
9． 74
2． 70
5． 40
10． 8
12． 10
14． 83
19． 62
97． 27
97． 95
95． 52
1． 91
2． 41
2． 15
Apigenin芹菜素 7． 55
2． 80
5． 60
11． 20
9． 92
12． 34
17． 41
95． 85
93． 84
92． 88
3． 12
2． 97
3． 75
5，7，4-Trimethoxyflavone 5，7，4-三甲氧基黄酮 6． 33
2． 60
5． 20
10． 40
8． 01
10． 87
15． 47
89． 70
94． 11
92． 47
3． 63
5． 36
4． 31
结果表明该方法回收率高，精密度也令人满意，
可用于粗裂地钱中黄酮类化合物的准确分析。
2． 7 样品测定
按 1． 4 节方法于日间重复处理同一样品 3 次，
在上述色谱条件下，分别进样 20． 0 μL，按外标法测
定，结果见表 3 。
表 3 样品测定结果
Table 3 Analytical results of samples
样品成分
Component
测定值
Measured value
(mg /kg)
平均值
Average value
(mg /kg)
Quercetin槲皮素 8． 71 8． 68 8． 73 8． 70
4，5，6-Trihydroxyl-3，7-dimethoxyflavone 4，5，6-三羟基-3，7-二甲氧基黄酮 9． 76 9． 73 9． 75 9． 75
Apigenin芹菜素 7． 57 7． 54 7． 55 7． 55
5，7，4-Trimethoxyflavone 5，7，4-三甲氧基黄酮 6． 36 6． 32 6． 34 6． 34
3 结论
本文建立了固相萃取-反相高效液相色谱分析
粗裂地钱中黄酮类化合物的方法，方法有效地去除
了 HPLC 分析中的干扰成分，4 种黄酮化合物分离
良好，提高了分析结果的准确性，并节省溶剂与时
间，简便实用，可快速分析粗裂地钱中的黄酮化合
物。
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