全 文 ：早期活化标志ＣＤ６９分子的表达，且表达极快，２４　ｈ
ＣＤ６９＋ＣＤ４＋ Ｔ表达量达２８．９％。介导和调节免疫
应答的关键性细胞即为ＣＤ４＋Ｔ细胞，为了完成免
疫系统的精细而迅速的调控，在抗原的再刺激下，
ＣＤ４＋Ｔ细胞可以激活分化，发挥免疫应答调节使机
体维持平衡。ＣＤ４＋Ｔ针对细菌感染等事件，通过细
胞因子的产生与分泌，发挥Ｔｈ细胞的功能，调节细
胞免疫应答和体液免疫应答［１３］。Ｔｈｌ细胞分化途
径是机体对感染、巨噬细胞和活化 ＮＫ细胞的微生
物的应答。许多细胞内感染微生物导致抗原活化的
ＣＤ４＋Ｔ细胞（Ｔｈ０）分化成Ｔｈｌ效应细胞［１４，１５］。免
疫细胞经同种抗原再刺激后诱导细胞活化可以增加
胞内细胞因子的分泌量。实验采用流式细胞术联合
胞内染色检测法检测ＯＶＡ抗原再刺激的细胞胞内
因子分泌的影响，从而达到放大但仍能反应原有细
胞因子分泌格局的目的。结果发现抗原刺激所诱导
活化的ＣＤ４＋Ｔ细胞的ＩＦＮ－γ阳性细胞ＡＢＰ－ＡＷ１
联合ＯＶＡ组明显多于 ＯＶＡ组（Ｐ＜０．０５）。说明
ＡＢＰ－ＡＷ１可促使ＯＶＡ引起有效的Ｔｈ１型细胞介
导的免疫反应，作为免疫增强剂具有一定的研究价
值。
参考文献：
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［收稿日期］２０１３－１０－３０
［基金项目］国家“重大新药创制”科技重大专项“基于新疆天然资源的创新药物孵化基地建设”（编号：２０１１ＺＸ０９４０１－００７）；国家科技支撑计划
项目“新疆特色天然药物现代化开发关键技术研究”（编号：２０１２ＢＡＩ３０Ｂ０１）　［作者简介］仙园园，女，硕士研究生，研究方向：药物制剂与新剂
型研究，电话：１５９８１７０２２６２，Ｅ－ｍａｉｌ：３５８９８１６７０＠ｑｑ．ｃｏｍ　［通讯作者］陈文，男，教授，研究方向：药物制剂与新剂型研究，电话：１３１７９９３０３２６
维药刺山柑果实硫代葡萄糖苷酶解条件的研究及产物的鉴定
仙园园，张华，吴增宝，韩博，陈文　 （石河子大学药学院，新疆 石河子８３２０００）
［摘要］　目的：研究刺山柑果实中硫代葡萄糖苷酶解的影响因素，确定硫苷酶解的最佳条件并分析和鉴定酶解产物。方法：
以刺山柑果实粉末为材料，研究不同的温度、ｐＨ 以及时间等单因素试验和正交试验筛选优化水解硫代葡萄糖苷的最佳条件，
并且利用气相色谱－质谱连用技术分析鉴定了酶解产物。结果：酶解时间为１４０　ｍｉｎ，水解温度为５０℃，ｐＨ 值为７．０是最佳酶
解条件。利用气相色谱－质谱连用技术分析鉴定出３种异硫氰酸酯化合物，占硫苷酶解产物中挥发性化合物总量的８０％。结
论：确定了刺山柑果实中硫代葡萄糖苷酶解的最佳条件，为刺山柑果实的研究提供了一定的理论基础。
［关键词］　刺山柑；硫代葡萄糖苷；异硫氰酸酯
［中图分类号］Ｒ９２７．２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１４）１５－１２５５－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１４．１５．０４
·５５２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ　ｉｎ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．ｆｒｕｉｔ　ａｎｄ　ｉｄｅｎ－
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＸＩＡＮ　Ｙｕａｎ－ｙｕａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｕａ，ＷＵ　Ｚｅｎ－ｂａｏ，ＨＡＮ　Ｂｏ，ＣＨＥＮ　Ｗｅｎ （Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｓｈｉｈｅｚｉ
８３２０００，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ　ｉｎ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ
ｆｒｕｉｔ；ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ
　Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａｆｒｕｉｔ　ｐｏｗｄｅｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ｏｒ－
ｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｄ－
ｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＧＣ－ＭＳ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｌｕ－
ｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｔｉｍｅ　１４０　ｍｉｎ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　５０℃，ｐＨ７．０，ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ　ｂｙ　ＧＣ－ＭＳ　ａｎｄ　ｔｈｅｙ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　８０％ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｖｏｌａｔｉｌｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ　ｉｎ　Ｃａｐｐａ－
ｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａｆｒｕｉｔ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａｆｒｕｉｔ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ；ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓ；ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
　　刺山柑（Ｃａｐｐａｒｉｓ　Ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．）异名老鼠瓜、瓜
儿菜，系白花菜科山柑属植物，在我国主要分布于新
疆天山南北石质低山、丘陵坡地、山麓冲沟或戈壁
滩［１－４］。研究刺山柑的地上部分、成熟的果实和地下
部分发现，其含有丰富的黄酮类、挥发油类、生物碱
类、脂类和糖苷类等化学成分［５－９］。《新疆药用植物
志》中记载，其叶、果、根均能入药，功能祛风除湿，止
痛消肿。民间广泛用其治疗痛风、类风湿性关节炎
以及各种疮疡肿毒［１０］。
硫代葡萄糖苷［１１］（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏ１ａｔｅ）是一类葡萄
糖衍生物的总称。广泛存在于十字花科、白花菜科
等植物的叶、茎和种子中。近年来的研究表明，许多
硫苷分解产物异硫氰酸酯对哺乳动物的肾癌、前列
腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌和肺癌等疾病都有一
定的防御作用，有关植物中天然硫苷成分的研究也
逐渐增多［１２］。因此，本文对刺山柑果实水解产物的
提取进行了工艺优化，并且研究了酶解时间、温度、
ｐＨ 等对硫苷酶解的影响，确定了硫苷的最佳酶解
条件，对其酶解产物的成分进行了 ＧＣ－ＭＳ鉴定与
分析，以期为刺山柑果实物质基础研究提供一定的
参考。
１　材料与方法
１．１　 材料　Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ＢＰ２１１Ｄ）电子天平（北京赛
多利斯仪器系统有限公司）；ＵＶ－２４０１型紫外可见
光分光光度计（日本岛津公司）。
白花菜科植物刺山柑（Ｃａｐｐａｒｉｓ　Ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．）
的干燥成熟果实；异硫氰酸烯丙酯（ＡＩＴＣ，纯度＞
９８％，安徽海贝进出口有限公司，批号２０１１０７０９）；
对照品异硫氰酸甲酯（批号２６６３３，纯度：９８％ ，阿
拉丁试剂公司）；对照品异硫氰酸异丁酯（批号
２０１１１２０３，纯度：９７％ ）和异硫氰酸异丙酯（批号
２０１１１２０３，纯度：９６％）购于上海锐谷试剂公司。
１．２　 标准曲线的制作　异硫氰酸酯类与醇类化合
物作用生成相应的硫代氨基甲酸酯［ＣＳ（ＮＨ２）
ＯＲ］，紫外２４３　ｎｍ处的吸光值在一定范围内与异
硫氰酸酯（ＩＴＣｓ）含量成正比。准确移取异硫氰酸
烯丙酯０．１　ｍｇ，用５０％的乙醇溶解后移至１００　ｍｌ
的量瓶中，定容至刻度，得其质量浓度为１　ｍｇ·ｍｌ－１
的对照品溶液。分别吸取上述异硫氰酸烯丙酯对照
品溶液２，３，４，５，６，７，８　ｍｌ于１００　ｍｌ量瓶中，再用
５０％的乙醇定容至刻度配制成０．０２，０．０３，０．０４，
０．０５，０．０６，０．０７，０．０８　ｍｇ·ｍｌ－１的对照品溶液。以
５０％乙醇溶液为空白对照，在２４３　ｎｍ处测吸光值，
绘制标准曲线。得回归方程为 Ａ＝８．４３６　４　Ｃ－
０．０８６　４，ｒ＝０．９９９　８，结果表明异硫氰酸酯质量浓
度在０．０２～０．０８　ｍｇ·ｍｌ－１范围内呈良好线性关系。
１．３　方法学考察
１．３．１　精密度考察　取一份供试液按照“１．２”项下
操作，并测定记录吸光度，重复测定６次，结果ＲＳＤ
为０．３１％。
１．３．２　 稳定性考察　取同一份供试液按照“１．２”
项下操作，并测定记录吸光度，每隔１ｈ测定１次，共
测定６次，结果ＲＳＤ为１．９０％。
１．３．３　 重复性考察　按照“１．２”项下操作，制备６
份供试品溶液分别测定记录吸光度，得出 ＲＳＤ为
０．９３％。
１．３．４　 回收率试验　称取刺山柑果实５０　ｇ置于
圆底烧瓶中，精密加入异硫氰酸烯丙酯高、中、低３
·６５２１· 中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
个量，按照“１．２”的项下方法制备９份供试品溶液，
分别测定记录吸光度得出ＲＳＤ为９９．０％。
１．４　样品提取与测定　精密称取刺山柑果实粉末样
品２．５　ｇ置于锥形瓶中，按选择的因素和水平进行水
浴水解，将水解液和渣一起转移到５００　ｍｌ圆底烧瓶
中，按《中国药典》２０１０年版一部附录ＸＤ挥发油测定
项下甲法操作提取挥发油，至无黄色油滴滴下，冷凝
液用盛有５０　ｍｌ无水乙醇的１００　ｍｌ量瓶接收，用纯化
水定容，摇匀后于紫外光２４３　ｎｍ处测吸收值。根据
标准曲线求出样品的异硫氰酸酯（ＩＴＣｓ）含量。
１．５　刺山柑果实中硫苷的最佳水解条件选择
１．５．１　单因素试验　对温度、时间、ｐＨ、维生素Ｃ
（ＶｉｔＣ）添加量、颗粒大小、料液比（水解液为纯化
水）进行单因素实验。温度分别选取２０，３０，４０，５０，
６０，７０，８０℃，时间选取４０，６０，８０，１００，１２０，１４０，
１６０　ｍｉｎ，ｐＨ分别选取２．０，３．０，４．０，５．０，６．０，７．０，
８．０，９．０ＶｉｔＣ添加量（ｍｇ·ｇ－１）选取０，０．５，１．０，
１．５，２．０和２．５　ｍｇ·ｇ－１，颗粒大小（目）分别选取２０，
４０，６０，８０，１００和１２０目，料液比（ｇ／ｍｌ）选取１∶５，１
∶１０，１∶１５和１∶２０　ｇ·ｍｌ－１。
１．５．２　硫代葡萄糖苷水解正交试验　根据单因素
试验结果，选取水解温度（℃）（４０，５０，６０），水解时间
（ｍｉｎ）（１００，１２０，１４０），ｐＨ（５，６，７）３个因素，采取
Ｌ９（３４）正交试验，并得出刺山柑果实硫代葡萄糖苷
水解为异硫氰酸酯的最佳条件。
１．６　硫苷酶解产物的ＧＣ／ＭＳ分析
１．６．１　硫苷酶解产物的提取　根据硫苷最佳酶解
条件，精密称取刺山柑果实粉末样品５０　ｇ置于锥形
瓶中，过６０目筛在５０℃、ｐＨ７．０、料液比１∶１０（ｇ／
ｍｌ）的条件下进行水浴水解１２０　ｍｉｎ，将水解液和渣
一起转移到５００　ｍｌ圆底烧瓶中，按中国药典２０１０
年版一部附录ＸＤ挥发油测定项下甲法操作提取挥
发油，至无黄色油滴滴下，乙醚萃取溜出液后，用无
水硫酸钠干燥并回收，得有特殊气味的淡黄色透明
液体。
１．６．２　ＧＣ－ＭＳ检测条件　色谱条件：ＨＰ－５毛细管
色谱柱（６０　ｍ ×０．２５　ｍｍ，０．２５μｍ）；进样口温度：
２５０℃；检测器温度：２３０℃；分流比：５０∶１；载气：高
纯氦（９９．９９９％）；流量：０．５　ｍｌ·ｍｉｎ－１；进样量：２
μｌ；升温程序：起始温度４０℃保持１　ｍｉｎ，以１０℃·
ｍｉｎ－１升温至１００℃保持５　ｍｉｎ，再以１０℃·ｍｉｎ－１
升温至１７０℃保持１０　ｍｉｎ，最后以５℃·ｍｉｎ－１升温
至２７０ ℃保持２０　ｍｉｎ。质谱条件：离子源温度：
２３０℃；四级杆温度：１５０℃；ＥＩ源电子能量：７０　ｅＶ；
接口温度：２８０℃；质量扫描范围：５０～４５０　ａｍｕ。
２　结果
２．１　 单因素试验　异硫氰酸酯是硫苷的主要水
解产物刺山柑水解的单因素实验结果见图１。结
果表明：随着时间的延长，硫代葡萄糖苷在黑芥子
酶的水解下，异硫氰酸酯的含量升高，当水解时间
到１２０～１４０　ｍｉｎ时，已经水解。随着温度的上升，
异硫氰酸酯的含量先增长后减小，这可能由于刺
山柑果实中的黑芥子酶在５０℃左右时，它的酶活
性最高，当温度升高时，黑芥子酶失去活性。当
ｐＨ在接近中性的条件下，其水解后异硫氰酸酯的
含量最高。有研究报道，黑芥子酶的最适ｐＨ５～
７［１３］。ＶｉｔＣ的加入能明显增加异硫氰酸酯的含
量，有报道，黑芥子酶能被 ＶｉｔＣ激活，增加其水解
速率［１４］。随着料液比的增大，水解后异硫氰酸酯
的含量上升，当料液比到１∶１０（ｇ／ｍｌ）时，异硫氰
酸酯的含量与之后的结果相差不大。随着颗粒大
小的变细，刺山柑果实水解后异硫氰酸酯的含量
增大，然后又变小，变小的可能性是由于刺山柑粉
太细以后，其里面的黑芥子酶的活性遭到迫坏，影
响其水解效果。
图１　单因素实验结果
Ｆｉｇ　１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
２．２　硫代葡萄糖苷水解的正交试验结果　异硫氰
酸酯是硫苷的主要水解产物，所以以异硫氰酸酯的
含量为指标考查水解工艺，设计了Ｌ９（３４）正交试
验。试验结果见表１，方差分析结果见表２。通过正
交试验结果分析表可以看出，提取刺山柑中总异硫
氰酸酯的最佳条件为Ａ２Ｂ３Ｃ３，即水解温度为５０℃，
水解时间为１４０　ｍｉｎ，ｐＨ为７。又根据极差Ｒ的大
·７５２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
小判断，各因素作用的主次顺序为 Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即水
解温度＞水解时间＞ｐＨ。通过正交实验方差分析
得出：水解温度对总异硫氰酸酯的含量影响显著。
从各个因素的Ｆ值大小可看出，各因素对产品总异
硫氰酸酯含量影响的主次顺序为Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即水解
温度＞水解时间＞ｐＨ，这与用极差Ｒ 的判断结果
一致。
表１　因素水平表
Ｔａｂ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ
水平
因　　素
Ａ（水解温度）／℃ Ｂ（水解时间）／ｍｉｎ　Ｃ（ｐＨ值）
１　 ４０　 １００　 ５
２　 ５０　 １２０　 ６
３　 ６０　 １４０　 ７
表２　直观分析表
Ｔａｂ　２　Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒｍ
试验号
因　　素
（Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （Ｄ）
指标
（异硫氰酸酯含量％）
１　 １　 １　 １　 １　 ０．２０
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ０．２１
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ０．２９
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ０．２８
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ０．３４
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ０．３３
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ０．１５
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ０．１９
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ０．２４
Ｋ１ ０．２３３　 ０．２１　 ０．２４　 ０．２６
Ｋ２ ０．３１７　 ０．２４７　 ０．２４３　 ０．２３
Ｋ３ ０．１９３　 ０．２８７　 ０．２６　 ０．２５３
Ｒ　 ０．１２４　 ０．０７７　 ０．０２　 ０．０３
表３　方差分析表
Ｔａｂ　３　ＡＮＯＶＡ　ｔａｂｌｅ
偏差平方和 自由度 Ｆ比 Ｆ临界值 显著性
Ａ　 ０．０２４　 ２　 ２４　 １９ ＊
Ｂ　 ０．００９　 ２　 ９　 １９
Ｃ　 ０．００１　 ２　 １　 １９
Ｄ　 ０．００１　 ２　 １
误差 ０　 ２
　　通过验证试验得到了最佳提取刺山柑中硫代葡
萄糖苷水解产物异硫氰酸酯的工艺条件，即水解温
度为５０℃，水解时间为１４０　ｍｉｎ，ｐＨ 为７，得率为
０．３４％。
２．３　 硫苷酶解物的 ＧＣ－ＭＳ鉴定　经 ＧＣ－ＭＳ分
析，刺山柑果实中硫苷酶解物主要分离出３个峰，总
离子流如图２所示，质谱分析结果见表４。对采集
到的质谱图利用 ＮＩＳＴ数据库检索，对刺山柑果实
挥发油中的成分进行分析，并对照文献［１５－１６］得
出，其中在出峰时间为１４．５，２２．０及３５．７　ｍｉｎ时的
匹配度最高，试验共成功鉴定出异硫氰酸盐３种，占
挥发性物质的８０％。并与对照品出峰时间一致，得
目标成分分别为异硫氰酸甲酯、异硫氰酸异丙酯及
异硫氰酸异丁酯。
表４　验证试验表
Ｔａｂ　４　Ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
第１组 第２组 第３组 平均 ＲＳＤ
总异硫氰酸酯含量／％ ０．３２　 ０．３４　 ０．３１　 ０．３２　 ４．７
图２　刺山柑果实中异硫氰酸盐的总离子流图
Ｆｉｇ　２　Ｔｈｅ　ＧＣ－ＭＳ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ　ｉｎ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉ－
ｎｏｓａ　Ｌ．
表５　异硫氰酸盐主要成分
Ｔａｂ　５　Ｍａｊｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＧＣ－ＭＳ
组分名称 出峰时间／ｍｉｎ 相对含量／％
异硫氰酸甲酯 １４．５　 ６４．０７
异硫氰酸异丙酯 ２２．０　 １２．８１
异硫氰酸异丁酯 ３５．７　 ３．１２
３　讨论
本实验运用单因素和正交试验，以刺山柑果实
硫代葡萄糖苷的水解产物异硫氰酸酯的含量为指标
研究刺山柑果实硫代葡萄糖苷的水解工艺，建立异
硫氰酸酯的含量测定方法，得到了最佳提取刺山柑
中硫代葡萄糖苷水解产物异硫氰酸酯的工艺条件，
即水解温度为５０℃、水解时间为１４０　ｍｉｎ、ｐＨ７，初
步完成了刺山柑中硫代葡萄糖苷水解产物异硫氰酸
酯提取工艺的优化。并对最终异硫氰酸盐组分做了
ＧＣ－ＭＳ技术分析测定，共成功鉴定出３种异硫氰酸
盐组分异硫氰酸甲酯、异硫氰酸异丙酯、异硫氰酸异
丁酯，且含量占硫苷酶解产物中挥发性化合物总量
的８０％，为将这一长期应用于民间具有确切抗痛
风、类风湿关节炎的民族药开发成新药奠定基础。
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［收稿日期］２０１３－０９－２９
［基金项目］国家自然科学基金项目（编号：３０８７０２４９，８１１７３５０９）　［作者简介］丁伟杰，学士，主任药师，电话：１３６５９８８２９６８　Ｅ－ｍａｉｌ：４６３６４５９６８
＠ｑｑ．ｃｏｍ　［通讯作者］楼一层，博士，教授，主任药师，电话：０２７－８７８５９０１９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｏｕｙｉｃｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
Ｄ１０１型大孔吸附树脂分离纯化红蓼总黄酮工艺研究
丁伟杰１，胡盈１，陈娈１，印凯文１，赵祥２，楼一层２　 （１．武汉市普仁医院，湖北 武汉４３００８１；２．武汉理工大学，湖北 武
汉４３００７０）
［摘要］　目的：筛选出适宜红蓼总黄酮纯化的大孔树脂，研究影响分离纯化的主要因素，确定最佳工艺参数。方法：采用分光
光度法测定红蓼总黄酮含量，通过静态及动态吸附－解吸方法筛选最佳树脂，以总黄酮回收率为主要指标，优化工艺条件。结
果：回收率和解吸率最佳为Ｄ１０１大孔树脂，最佳工艺条件为：样品浓度２．２１３　ｍｇ·ｍＬ－１、ｐＨ＝４、用量１０３．３　ｍｇ·ｇ－１；３　ＢＶ水
洗、４　ＢＶ５０％乙醇洗脱，总黄酮回收率为５６．２％，纯度为７２．３％。结论：Ｄ１０１大孔树脂用于红蓼中总黄酮的提取纯化，回收率
较高，纯度好。
［关键词］　Ｄ１０１大孔树脂；红蓼；总黄酮；分离纯化；工艺研究
［中图分类号］Ｒ９４３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１４）１５－１２５９－０４　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１４．１５．０５
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｃｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＰｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ
ｂｙ　Ｄ１０１　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｎ
ＤＩＮＧ　Ｗｅｉ－ｊｉｅ１，ＨＵ　Ｙｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｌｕａｎ１，ＹＩＮＧ　Ｋａｉ－ｗｅｎ１，ＺＨＡＯ　Ｘｉａｎｇ２，ＬＯＵ　Ｙｉ－ｃｅｎｇ２（１．Ｗｕｈａｎ　Ｐｕｒｅｎ
ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ　４３００８１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕ－
ｈａｎ　４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＰｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ　ｗｉｔｈ　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｎ　ａｎｄ　ｅｓ－
ｔａｂｌｉｓｈ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｓｔａｔｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｓ－
ｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＰｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ　ｗｉｔｈ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅ　ｔｙｐｅ
Ｄ１０１　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｎ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ．
Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓａｍｐｌｅ　ａｍｏｕｎｔ　１０３．３　ｍｇ·ｇ－１，ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ２．２１３　ｍｇ·ｍＬ－１　ａｔ　ｐＨ４；ａｎｄ　ｅｌｕ－
ｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｗａｓ　５０％ａｌｃｏｈｏｌ　ｗｉｔｈ　４　ＢＶ，ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ｗａｓ　３　ＢＶ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｒｅａｃｈｅｄ
５６．２％ ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　７２．３％．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｏ　ｕｔｉｌｉｚｅ　ｔｈｅ　Ｄ１０１　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒ－
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ　ｉｓ　ｆｅａｓｉｂｌｅ，ｓｈｏｗｓ　ｈｉｇｈ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｄ１０１　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｎ；Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ；ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｔｅｃｈｎｉ－
ｃａｌ　ｓｔｕｄｙ
　　红蓼为蓼科植物荭草Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｏｒｉｅｎｔｌｅ　Ｌ全
草，别名天蓼、大蓼、石龙等，其性味凉辛有毒，具有
祛风除湿、清热解毒、活血、截疟的功效［１］。研究表
明，红蓼的黄酮类成分具有良好的抗肿瘤活性，该药
·９５２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５