全 文 ：第 26 卷第 6 期
2 0 07 年 1 1月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Jo u rn a l o f F o o dS ei en c a n eB i do t e eh n o l o gy
V
o l
.
26
N
o v
.
N
o
.
6
2 0 07
文章编号 : 6 7 15 一 16 59 ( 2 7 0 0) 06 一 0 023 一 4 0
高速逆流色谱分离芝麻菜种子中的硫代葡萄糖营
沈莲清 , 许明峰
( 浙江工 商大学 食品与生物工程学院 , 浙江 杭州 31 0 03 5)
摘 要 : 比较 了各种溶剂系统对高速逆流 色谱法 分离硫代 葡萄糖普的影响 , 考察 了高速逆流 色谱
的流速 、 转速和进样量对提取效果的影响 。 用 V ( 正丁 醇 ) : V ( 乙睛 :) V ( 1 5% 的硫酸按溶液 ) -
1
, 0
.
5
,
2
.
4作为溶剂系统上相作流动相 , 在体积流量为 1 . 0 m L / m in 、 转速为 6 0 r/ m in 的条件
下 , 成功地从 甲醇粗提物中分离了硫代葡萄糖普 , 并用高效液相色谱 法测定硫代 葡萄糖普 , 纯度达
到 9 5 . 2% 。
关键词 : 芝麻菜种子 ; 硫代葡萄糖普 ;高速逆流色谱 ;高效液相色谱
中图分类号 : T S 2 01 . 2 文献标识码 : A
S e P a r a t i o n o f G l u c o s i n o l a t e f r o m E r u c a s a t i v e S e e d b y H i g h
一
S P e e d
C o u n t e r
一
C u r r e n t C h r o m a t o g r a P h y
S H E N I
创
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一
q i n g
,
X U M i n g
一
f e n g
( C o l le g e o f F o o d S e ie n e e a n d B io t e e h n o l o g y E n g in e e r in g
,
Z h ej i a n g G o n g s h a n g U n iv e r s it y
,
H a rt g z h o u 3 1 0 0 3 5
,
(二h i n a )
A b s t r a c t
:
In t h e m a n u s e r i p t
,
t h e e f f e e t s o n d i f f e r e n t s o l v e n t s y s t e m f l o w r a t e
, r o t a r y s P e e d a n d
s a m p l e v a l u e f o r e x t r a e t
o b t a i n e d b y H S C C C w i t h
g l u e o s i n o l a t e f r o m E r u c a 、 a t i刃 e s e e d w e r e s t u d i e d
.
G l u e o e r u e i n w a s
a b i n a r y p h a s e S o l v e n t s y s t e m e o m p o s e d o f E t ( ) H
一
A C N
一
1 5% ( N H
,
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:
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:
( l
: 0
.
5 , 2
.
4 )
.
T h e m o b i l e p h a s e w a s
m L / m i n
,
w h i l e t h e a p p a r a t u s r o t a t e d a t
t h e u p p e r p h a s e a n d p e r f o r m e d a t a f l o w r a t e a t 1
.
0
6 0 0 r / m i n
.
T h e r e s u l t o f h i g h p e r f o r m a n e e l l q u id
e h r o m a t o g r a p h i c r e v e a l e d t h a t t h e p u r i t y w a s 9 5
.
2%
.
K e y w o r d s : E r u c a s a t i别 e s e e d ; g l u e o s i n o la t e ; H S C C C ; H P I , C
花科
物 L’
硫代葡萄糖昔 ( g l uc os in ol a et )广泛存在于十字
( C ur ic fe er a ) 植物中 , 是最 主要 的次生代谢产
。 到目前为止 , 已经发现 1 2。 多种硫 昔 Zj 。
据侧链 R 基团的不同 ,可以把硫昔分为 : 脂肪类 、
噪类和芳香类川 。 在十字花科相应 内源黑芥 子酶
( t h i o g l u e o s id c g l u e o h y d r o l a s e
,
E C 3
.
2
.
3
.
1 ) 的作
用下 ,硫昔容易水解生成异硫氰酸盐 、 ,硫氰 酸盐和
睛类等化合物川 , p H 、侧链 R 基团和金属离子的不
同将影响各产物 的形成 LS」。 最近几年发现 ,硫昔 的
降解产物可以抑制真菌和微生物的生长 , 同时还发
现某些硫昔还具有抗癌的作用 , 这主要是通过降解
产物激发人体免疫力而起作用 。 硫昔 的降解产物
根叫
收稿 日期 : 2 0 0 7一 0 3一 2 8 .
基金项 目 :浙江省重大科技项 目 ( 2 0 04 C 120 05 ) .
作者简介 : 沈莲清 ( 194 6一 ) , 女 , 江苏苏州人 . 教授 , 博导 , 主要从事农产品加工及 天然活性物质提取方 面的研究 .
通讯作者 : 许明峰 ( 1 9 8 1一 ) , 男 , 浙江长兴人 , 农产品加工及天然活性物质提 取硕 士研 究生 . E m a ; l : c x x m f@ 163 . c o m
食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 2 6 卷
是抗癌药的重要组成部分 , 其提取和纯化方法正 日
益引起人们的关注 。 目前已有很多方法用 于分离
提取硫昔 , 比如离子交换法 和 H P L C , 但只能得到
很少量 的硫昔侧 。 吴谋成工7一 等用 D E A E s叩 h a d e x
A
一
25 葡聚糖凝胶柱阴离子交换与高效液相色谱联
用分离的方法 , 分别从甘蓝型油菜种子和芥菜型油
菜种子中各提纯分离出一种硫代葡萄糖昔 , 得到了
较纯的化合物 。 作者选择高速逆流色谱可快速 、大
量地提取硫昔 , 具有一定的理论和现实意义 。 芝麻
菜属 十字花科植物 , 原产 于我国云南 , 是一种重要
的植物油和蛋白质来源 ,近年来风行于印度和巴基
斯坦闭 , 作者报道 了从芝麻菜种子 中提取 、 分离硫
代葡萄糖昔的方法 。
1 材料与方法
1
.
1 材料与仪器
1
.
1
,
1 材料 芝麻菜种子 , 成都市特色种业研究
所提供 ;硫昔标准品 , S i g m a 公司提供 。
1
.
1
.
2 试 剂 甲醇 , 乙酸 乙醋 , 正丁醇 , 乙睛 , 甲
醇 , 乙睛 。
1
.
1
.
3 仪器 高速逆流色谱仪 ( H SC C C一 D 4 0 ) : 浙
江工商大学食品与生物工程研究所研制 ; 岛津公司
高效液相色谱仪 : 由 L C 一 20 A T 泵 、 S P仆 20 A 紫外检
测器 、 柱温箱组成 ; L O O Y E Z X 9 8一 1 型旋转蒸发仪 :
上海申胜仪器 厂制造 ; L G J一 10 型冷冻干燥 机 : 北京
四环科学仪器厂制造 。
1
.
2 测定方法与指标
高效液相色谱方法 鉴定提纯物的纯度 。 色谱
条件 : 色谱柱 , S h im a d z u V P一O D S , 2 5 0 m m 又 4 . 6
m m ;流动相为乙睛 + 3 m m ol / L 四甲基嗅化钱溶液
(体积比 1 0 ` 9 0) ;体积流量 1 . 0 m L / m in : 紫外检测
波长 2 3 0 n m ; 柱温 2 5 oC 。
1
.
3 实验方法
1
.
3
.
1 硫代葡萄糖普的提取 为了保证硫昔不被
酶解 ,首先必须使酶失活 。 采用 高温钝化的方法 ,
把芝麻菜种 子加人 到沸腾 的甲醇中灭酶 30 m in 。
然后用粉碎机粉碎 , 并用沸腾的甲醇对原料进行提
取 ,每次 l h , 共进行 3 次 , 可 以萃取出其中的大部
分硫昔 。 对甲醇提取物进 行浓缩 , 将浓缩得到的膏
状物溶于适量水 , 再以等量 乙酸乙醋对其进行脱脂
处理 ,连续 3 次 。 将水相旋转蒸发至 含水量 较少
时 ,再对其进行冷冻干燥 , 就可得到粗样品 。
1
.
3
.
2 硫代葡萄糖普逆流 色谱分 离条件的选择
选择合适的溶剂系统 、 转速 、 流速和进样量 , 用高速
逆流色谱技术 ,分离单种硫代葡萄糖昔 。 逆流色谱
技术的关键在于溶剂系统的选择 。 硫代葡萄糖昔
是一类水溶性化合物 ,作者选用的是一个含盐的高
极性溶剂系统叫 , 以正丁醇 、 乙睛 、 盐溶液为系统组
分 , 试验不同的 比例及盐溶液浓度的有关参数 , 找
到对硫营分离较为有效的系统 。
2 结果与分析
2
.
1 溶剂系统的选择
在试验过程中 , 首先是 T L C 分析初选 ,测定被
分离组分在溶剂系统 的上 相和下相的溶解分配情
况 , 再通 过小型 的逆流色谱仪实验 以确定其可行
性 ,最终选定合适的溶剂系统 , 结果见表 1 。
表 1 不同溶剂系统
T a b
.
1 T h e d i fe
r e n t s o lv e n t sy s t e m
编号 溶剂系统 体积比例
l 正丁醇一 乙睛一 5 %硫酸钱溶液 1 : 。 . 5 , 1 . 6
2 正 丁醇 一 乙睛一 5 %硫酸馁溶液 0 . 5 ` l , 1 . 6
3 正丁醇 一 乙睛 一 15 %硫酸钱溶液 0 . 5 , 2 , 2 . 2
4 正丁醇 一 乙睛一 15 %硫酸钱溶液 1 : 。 . 5 , 2 . 4
对芝麻菜种子粗提物进行 T L C 分析 , 结果见
图 1 的 0 号所示 。 由图 1 可见 , 该粗样品中至少含
有 A 、 B 、 C 、 D 4 种主要成分 。 因为 T L C 板上某斑点
颜色的大小 、 深浅程度与该斑点所代表的物质在溶
液中的浓度相关 , 故可 以通过 T L C 分析判定各物
质在某一溶剂系统中的分配情况 。 从图 1 看出 , 在
各个溶剂系统中除了组分 A 与组分 B 外 , 其它各组
分的分配情况变化不大 , 且两组分在 2 号 系统和 4
号系统中的分配 系数与在其它系统中的分配 系数
有较大差距 。 又因为在 2 号系统中 A 、 B 、 C 3 种组
分的分配系数相似 , 不 易于三者的分离 , 故选择 4
展开剂 : 氯仿一甲醇一水 (体积比 10 , 10 : l)
显色剂 :质皿分数 巧%的硫酸乙醇溶液
T h e er s u lt o f s e P a r a t io n u n d e r t h e e i r e u m s ta n e e
o f 0
.
7 9 s a m Pl e D e
v e lo P P in g s o lv e n t s y s te m :
c h lo r o fo r -m m e t h a n o l
一
w a t e r ( 1 0
, 1 0
, l )
C o .o r iz i n g a g e n t : 15 %
s u lf u r i e a e i企 e n t h a n o l 5 0 -
IU t i o n
一.1.图
g
…F
第 6 期 沈莲清等 :高速逆流色谱分 离芝麻菜种子中的硫代葡萄糖普
2
.
2 体积流 t 对 H S C C C保留率的影响
将高速逆流色谱仪的转速设为 6 0 r/ m ni , 分
别测定流动相在 0 . 5 、 1 . 。 、 1 . 5 、 2 . 0 m L / m in 的条
件下固定相的保留率 , 测定流动相体积流量对固定
相保留率的影响 。 H S C CC 一 D 40 O 型 高速逆流色谱
仪的转速为 60 O r /m in 时 , 流动相体积流量对固定
相的保留率的影响见图 2 。 从图 2 可以看出 , 在转
速固定时 , 随着流动相体积流量的增大 , 固定相的
保留率呈下降的趋势 。 当流动相的体积流量为 0 . 5
m L / m in 和 1 . 0 m L / m in 时 , 固定相保留率分别为
86
.
5%和 82 . 6% ;当流动相 的体积流量增加到 1 . 5
m L /m in 时 , 固定相的保留率降到 75 . 8 % ; 当流动
相的体积流量增加到 2 . 0 m L /m in 时 , 固定相的保
留率降低到 6 2 . 4% 。 可见低流量时保留率较高 ,但
低流量也会导致分离效率的降低 。 综合考虑保留
率和分离效率的影响 , 选取体积流 量为 1 . 0 m l丫
1l l l n 。
1 0 0
尸
柱转速固定为 6 0 O r / m in , 分别测定进样量为 0 . 5 、
1
.
0
、
1
.
5
、
2
.
0 9 (均溶解在 20 m L 由固定相和流动
相等体积组成的溶剂系统中 )时的分离情况 。 比较
其分离效果以确定该逆流色谱仪较为有效的最大
进样量 。
进样 0 . 5 9 和 1 . 0 9 时 , A 与 B 组分可以分离
开来 ;当进样为 1 . 5 9 时 , 各组分有少量交叉 ; 当进
样 2 . 0 9 时 ,分离效果很差 ,各组分有很严重的交叉
现象 。 图 4 即为进样 1 . 5 9 时对收集样品 T L C 分
析的结果 。
100
n“UO口孟U
岁\哥翻毕霉侧呵
0 2 0 0 4 0 0 600 800 1 0 0 0
转澎 ( r /m in )
图 3 不同转速对固定相保留率的影响
F i.g 3 T h e e fe
c t o f r o t a r y s Pe d o n th e r e t e n ti o n r a t io
o f s t a t io n a r y Ph as e
. `…’ 。 一 : ” ” ”…” ” . … …
2 6 1 0 1 4 18 2 2 2 6 飞2 }3 4 3 8 4 2 4 6 5 0 5 4 5 8 6 2
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甘00`U
岁、铸翻举霉侧呵
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- - - - L - - - - - -一 - 二- - - - - - - - 目 J一~ - ~ - - - - - 盛 - ~一 - - -
0 0
.
5 1
.
0 1
.
5 2
.
0 2
.
5
体积流量 / (m L /m in )
图 2 不同体积流 t 对固定相保留率的影响
F ig
.
2 E f fe e t o f d i fe er
n t f l ow
r a t e o n t h e 理 te n t io n r a t io
o f s t a t i
o n a yr P h留e
2
.
3 转速对 H SC C C 保留率的影响
将流动相的体积流量设为 1 . 0 m L / m in 并保持
恒定 ,分别测定转速在 2 0 0 、 4 0 0 、 6 0 0 、 SO o r /m i n 时
固定相 的保留率 , 测 定转速 对固定相保留率的影
响 。
流动相的体积流量为 1 . 0 m L /m in 时高速逆流
色谱仪转速的变化对 固定相保留率的影响见 图 3 。
从图 3 可以看出 , 当转速为 2 0 0 : /m i n 和 4 o o r /m i n
时 , 固定相的保留率分别为 54 . 1% 和 73 . 1% ; 当转
速达 到 60 0 : / m in 时 , 固 定 相 的 保 留 率 达 到
8 2
.
6% ;随着转速 的增大 , 固定相 的保留率相应增
大 。 当转速为 8 0 0 : / m in 时 , 固定相保留率达到了
83
.
5 %
, 可见转速越 高保留率较高 , 但考虑到仪器
承受力有限 ,故选取转速为 60 0 r/ m in 。
2
.
4 进样量对分离效果的影响
将流动相体 积流量固定为 1 . 0 m L / m in , 色谱
展开剂 : 氯仿一 甲醇一 水 ( 10 ; 10 , 1) , 显色剂 : 巧%硫酸 乙醇
溶液
图 4 进样 t 为 1 . 5 9 时的分离结果
Fi g
.
4 T h e r es u lt o f 哭 P a r a t io n u n d e r th e e i r c u m s t a n c e
o f 1
.
5 9 s a m P le
2
.
5 高效液相色谱图分析
当选用 V (正丁醇 ) , V (乙睛 ) , V ( 15 %的硫酸
钱溶液 ) 一 1 , 0 . 5 , 2 . 4 溶剂体系 , 体积流量 1 . 0
m L / m i n
、 转速 为 6 0 0 r / m i n 时一 个组 分 的 H P I了 C
图谱见图 5 。
通 过 H IP 尤 检 测 可 知 , 样 品 的纯 度 达 到 了
9 5
.
2%
, 从而 可知高速逆 流色谱具有 很好 的分离
效率 。
3 结 语
)I 对逆流色谱分流芝麻菜种子中的硫代葡萄
糖昔的溶剂系统进行 了研究 ,找到 了合适 的溶剂系
l 6 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 6 2卷
统正丁醇一乙睛一 5 1 %硫酸按溶液 (体积 比 l : 。. 5 ,
2
.
4 )
。
2 ) 采用柱容积 4 0 0 m L 的 H S C CC 一 D 4 0 0 型高
速逆流色谱仪分离芝麻菜种子粗提物 ,可 以分离得
到较纯的样品组分 。
3) 研究了影响逆流色谱分离的主要参数 : 流动
相流量 、 色谱柱转速 、 进样量等对固定相的保留率
及分离效果的影响 ,优化了分离条件 。
09一.61
nUCOnU八”“0.、曰4,ú,ùl
奋口曰
协91 .61n八Unnn伟、ú,`,.二
沂川口
0
0 5 1 0 15 2 0 2 5 3 0
时间 /m in 0 5 10 1 5 20时间 /m i n
25 3 0
柱规格 : S h , m a d z u V P一 ( ) D S 2 5 0 m m x 4 . 6 m m l . D . ; 流动相 : 乙睛 : 3 m m o l / L 四甲基澳化钱溶液 ( 1 0 : 90 ) 流速 : 1 . O m l /m in ; 检测波长 : U V 检
测器 2 3 0 n m
图 5 标准品和样品的 H P L C 谱图
F ig
.
5 T h e H P L C e h n
,m a to g r a m o f t h e s ta n d a dr a n d th e as m P le
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(责任编 辑 : 李春丽 )