全 文 ：工艺技术 食品工业科技
Vol.30 , No.01 ,2009
2009年第 01期 195　
刺山柑叶子中黄酮的超声波提取
及抑菌研究
李国庆 ,韩志国 ,李　佳 ,李雪峰 ,苏力坦 ·阿巴白克力＊
(新疆大学生命科学与技术学院 ,新疆乌鲁木齐 830046)
摘　要:目的:运用超声波辅助法提取刺山柑叶子中黄酮类物质 。对刺山柑叶子提取液不同萃取组分进行抑菌实验 。
方法:通过正交实验法探讨提取工艺的最佳条件 。采用琼脂平板扩散法观察抑菌圈的大小及测量最低抑菌浓度
(MIC, mg/mL)。结果:最佳工艺条件:乙醇浓度 75%,超声时间为 50min,料液比为 1∶25 ,提取周期为 5次 。抑菌实验
中正丁醇萃取组分和乙酸乙酯萃取组分的抗菌活性明显强于石油醚萃取部分 。结论:刺山柑叶子中抗菌活性成分主
要为极性中等的化合物 ,推测正丁醇和乙酸乙酯萃取部分的黄酮及生物碱成分是主要的抗菌成分 。
关键词:刺山柑 ,总黄酮 ,超声波提取 ,抑菌实验
Studyonextractionandanti-microbialactivitiesof
totalflavonoidfromtheleavesofCapparisspinosaL.
LIGuo-qing, HANZhi-guo, LIJia, LIXue-feng, Sultan· ABABAKRI＊
(ColegeofLifeScienceandTechnology, XinjiangUniversity, Urumqi830046, China)
Abstract:Objective:Flavonoidsfrom leavesofCapparisspinosaL.wasextractedwiththeultrasonic-assisted
extraction(UAE)andantibioticfunctionofdiferentcomponentofleavesofCapparisspinosaL.whichwas
extractedbyethanolwerediscussed.Methods:Orthogonaltestwasusedtoevaluatetheinfluenceofthe4factors.
Antibacterialexperimentswereconductedinagarplatedilutionmethod.Results:Theresultsshowedthatthe
optimumextractionwasasfolows:adding75% ethanolintoleavesofCapparisspinosaL., extracting50min, the
rateofsolidandliquid1∶25, andnumberofextractioncycles5.Bothethylacetatefractionandn-butanolfractionof
theplantspecieshadstrongerantimicrobialactivitythanthatofpetroleum etherfractioninantibacterial
experiments.Noneofthem wereobservedtohaveanti-fungalactivity.Conclusion:theactiveantimicrobial
compoundscouldberelatedtomoderatepolarityinleavesofCapparisspinosaL., sothatitwaspresumedthat
flavonoidandalkaloidsinthen-butanolfractionandethylacetatefraction.
Keywords:CapparisspinosaL.;flavonoids;ultrasonic-assistedextraction;antibacterialexperiments
中图分类号:TS213.2+4　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2009)01-0195-04
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　　刺山柑为白菜花科山柑属 ,又名老鼠瓜 、野西
瓜 ,维吾尔等民族称其缒果藤 ,既可野生生长又能培
植 ,并兼有医药和芳香性特性 [ 1] 。它是一种多刺
的 、俯卧的 、多年生的小灌木 ,广泛分布于东半球 ,从
收稿日期:2008-05-30　＊通讯联系人
作者简介:李国庆(1979-), 男 , 在读硕士研究生 , 研究方向:生化
制药。
欧洲南部到非洲东面北面 ,从马达加斯加岛到中亚
及东南部再到澳大利亚及整个大洋洲 [ 2] 。我国新疆 、
甘肃 、内蒙古 、西藏等省区均有分布。我国沙区仅产
1属 1种 ,新疆各沙区有分布 ,以吐鲁番盆地沙漠最
多 [3 ] 。它的医学性能在远古时代就被发现 [ 4 ] , 其果
实 、根 、叶子用来治疗痛风 ,在传统的伊朗医学中用
来作为利尿剂 、收敛剂和滋补品 ,甚至它的花芽也有
药学价值 ,可用来改善肝脏的功能或作为肾脏的消
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毒剂 [ 1 , 5 ] 。刺山柑和大麻结合使用的重要意义也在于
此 ,到目前为止 ,这两种在吐鲁番仍是重要的维吾尔
药 [ 6, 7] 。近年来 ,超声技术应用于提取植物中的生物
碱 、苷类 、生物活性物质 、动物组织浆的毒质等研究
已有报道 [ 8 , 9 ] 。本实验用超声波辅助提取的方法 ,采
用正交设计 ,以刺山柑叶子中黄酮类化合物提取率
为指标 ,对其进行工艺优化 ,为刺山柑叶子中黄酮的
提取提供科学依据。同时对得到的醇提物进行抑菌
研究 ,旨在为寻找新的具有抑菌或杀菌作用的植物
资源做出贡献。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
刺山柑叶子 　采于新疆吐鲁番市南郊 , 海拔
35m,干燥 ,用粉碎机粉碎 ,过 25目筛 ,并鉴定所采集
的标本为白菜花科山柑属刺山柑叶子;大肠杆菌 、金
黄色葡萄球菌 、奇异变形杆菌 、枯草杆菌 、青霉 、黑曲
霉 、根霉 、酵母　均由新疆大学生命科学与技术学院
微生物教研室提供;芦丁 　上海试剂二厂;乙醇 、硝
酸铝 、亚硝酸钠 、氢氧化钠　均为分析纯;细菌培养
基 ,营养琼脂固体培养基 ,酵母培养基 ,麦芽汁培养
基 ,霉菌培养基 ,马铃薯培养基 。
UV-752紫外分光光度计　上海光谱仪器有限
公司;AL104电子天平 　Metler-Toledo仪器公司;
JY92-2D超声细胞粉碎机　宁波新芝生物科技股份
有限公司等 。
1.2　实验方法
1.2.1　供试液的制备及其梯度　刺山柑叶子经粉碎
后取 0.5kg,按最佳工艺得到乙醇提取物 ,浓缩。制备
不同极性溶剂的萃取组分 ,具体步骤如下 [ 10 ]:取乙醇
粗提物(总浸膏)30g, 用蒸馏水加热溶解制成水悬
液 ,依次用石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 ,分别浓缩
得到石油醚萃取组分 2.31g, 乙酸乙酯萃取组分
1.85g,正丁醇萃取组分 1.53g,剩余的水溶液浓缩得
水部分 23.50g。准确称取各组分 1.000g,分别用相应
萃取溶剂溶解浓度为 1.0g/mL。室温放置 30min,再
用同样的方法将其倍比稀释为:1、0.5、0.25、 0.125、
0.0625、 0.03125、 0.015625、 0.0078125、 0.00390625、
0.001953125、0.0009765625、 0.00048828125g/mL。阳
性对照是庆大霉素 ,试剂对照为各种萃取溶剂 。
1.2.2　实验菌的培养及制备　将实验菌种置于增菌
用液体培养基中 , 37℃温箱中恒温培养 24h,继代一
次 ,以激活冷冻干燥的菌 。继而将继代菌接种于增
菌用平板培养基上 ,置于 37℃温箱中恒温培养 48h,
产生大量可供实验所用的实验菌。用少量灭菌 NS
将实验菌的菌苔从平板上洗脱 ,适量将供试菌接种
到液体培养基中 , 37℃摇床培养 24h。真菌培养温度
为 28℃,待用。
1.2.3　测试平板的制备　待灭菌后的培养基温度降
至 40～50℃时 ,取 1mL菌液加入到 100mL培养基中
迅速摇匀 ,浇灌事先灭菌并置于水平台面的培养皿
上 ,每皿 15～ 20mL。待培养基凝固后 ,用打孔器(φ=
3mm)在培养基上打孔 ,每皿 4个孔 ,孔距为 23mm,
每孔加 10μL药液 。实验设空白对照(H2 O),溶剂对
照 、阳性对照为庆大霉素 、加药处理(植物提取物及
萃取物),每个处理均设 3个重复 ,先在 4℃下放置
12h,然后在 37℃暗培养 24h后观察结果。
1.2.4　标准曲线回归方程的建立　准确称取芦丁标
准品 1g,以无水乙醇定容至 100mL。再从中取 5mL,
定容至 100mL,得到浓度为 0.5mg/mL的芦丁标准溶
液。分别准确量取 0、1、2、3、4、5、6mL芦丁标准溶液
于 25mL的容量瓶中 , 用 30%的乙醇溶液稀释到
10mL, 加入 0.7mL5%的 NaNO3 溶液 , 摇匀 , 静置
5min,再加入 0.7mL10%Al(NO3)3溶液 ,摇匀 ,静置
5min,再加入 5mLlmol/L的 NaOH溶液 ,用 30%的乙
醇溶液定容至 25mL,混匀放置 5min后 ,在 510nm处
测定其吸光值 [ 9] 。用最小二乘法作线性回归得芦丁
浓度(Y)与吸光度(X)的关系曲线的回归方程式:Y
=0.0803X+0.0005, R2 =0.9998。
1.2.5　总黄酮含量的测定　经石油醚处理好的刺山
柑叶子材料 ,加乙醇溶液预处理 24h后进行超声波
处理 ,过滤 ,溶液置于容量瓶中定容。取 5mL样品液
置于 25mL的容量瓶 。之后按照工作曲线建立步骤
加入各种试剂 。用分光光度法在 λ=510nm处测定
吸光度 ,根据回归方程计算样品中总黄酮含量。
2　结果与分析
2.1　正交实验设计及结果
通过单因素实验结果 ,选用 L9(34 )正交表 ,因素
水平见表 1。正交实验和数据处理考虑 A、B、C、D四
因素在三个水平上的变化 ,得出最佳提取工艺 ,影响
刺山柑叶中黄酮类化合物提取率主次顺序为 A>D
>C>B,从平均提取得率看 ,提取条件为 A2B2C3D3
时最好 (表略), 即乙醇浓度为 75%, 超声时间为
50min,料液比为 1∶25 ,超声次数为 5次。按实验得
到的最佳工艺条件提取三批刺山柑叶中黄酮类化合
物进行验证实验 , 提取物总黄酮类化合物得率
为 2.64%。
表 1　提取工艺参数设计
水平
因素
A乙醇浓度
(%)
B提取时间
(min)
C液固比
(mL/g)
D提取次数
(次)
1 65 40 15 3
2 75 50 20 4
3 85 60 25 5
2.2　不同提取方法的比较
表 2显示 ,三种总黄酮提取方法中索氏提取法
提取黄酮得率最高 ,超声波辅助提取法测定的总黄
酮得率居中 ,乙醇浸提法的较低 。采用 SPSS12.0统
计软件对这 3种处理的差异显著性进行 t检验分析 ,
发现前两者无显著差异(P>0.05),这两种方法与乙
醇浸提方法差异显著(P>0.05)。说明索氏提取方
法与超声波辅助提取法的提取量相当。索氏提取为
连续回流提取 ,充分地利用了溶剂 。超声提取能产
生机构效应和空化效应 ,加速提取溶质和有效成分
的溶解速度 ,加速吸收溶解药物成分的提取溶质向
细胞外的扩散速度 ,实现中药和天然产物的浸提。
由表 2还可看出 ,超声波提取法所需提取时间明显
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表 2　不同提取方法的比较
提取法 提取时间 总黄酮的得率(%)
1号样 2号样 3号样 4号样 5号样 平均值
超声波提取法 20min 2.60 2.65 2.63 2.63 2.64 2.64
索氏提取法 120min 2.68 2.70 2.71 2.65 2.71 2.69
乙醇浸提法 48h 1.01 1.03 1.04 1.01 1.00 1.02
表 3　刺山柑叶子提取物及其不同极性溶剂萃取组分对细菌的抑制作用
菌种 石油醚萃取组分 乙酸乙酯组分 正丁醇组分 水提物 醇提物 庆大霉素 无菌水 试剂对照
产气杆菌 ++ ++ +++ - + ++++ - -
金黄色葡萄球菌 - ++ +++ - - ++++ - -
奇异变形杆菌 - ++ +++ - - ++++ - -
枯草杆菌 - ++ ++ - - ++++ - -
大肠杆菌 - + + - - ++++ - -
青霉 - - + - - ++ - -
黑曲霉 - + + - - +++ - -
根霉 - - - - + ++ - -
酵母 - + ++ - - +++ - -
表 4　刺山柑叶醇提物萃取组分对 5种菌株的 MIC
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 奇异变形杆菌 枯草杆菌 产气杆菌
乙酸乙酯组分(mg/mL) 62.5 62.5 62.5 62.5 31.2
正丁醇组分(mg/mL) 62.5 8 8 62.5 1.6
庆大霉素(U/mL) 2.5 1.25 0.625 2.5 0.078
表 5　萃取组分系统预试结果
组分 氨基酸 、多肽 黄酮类 生物碱 糖类 甾体 、萜类化合物 酚类 脂类
石油醚萃取组分 - - - - - - ++
乙酸乙酯组分 - + + - ++ + -
正丁醇组分 - ++ ++ + + - -
水提物 ++ - - ++ - + -
醇提物 ++ + + ++ + + +
注:` - 、` + 、` ++分别表示可能不存在 、可能存在 、明显存在。
短于索氏提取法与乙醇提取方法 ,因此具有明显的
优势。
2.3　抗菌初筛实验
采用打孔药剂扩散法比较不同极性溶剂萃取组
分对微生物的抑制作用 ,结果见表 3。用符号 “ -、
+、 ++、 +++”表示抑制活性的相对强弱 。从抑
菌实验结果可知 ,刺山柑叶子各萃取物抑菌强度为:
正丁醇萃取物 >乙酸乙酯萃取物 >石油醚萃取物
>75%乙醇萃取物 >水萃取物 ,提示抗菌活性成分
主要存在于正丁醇组分及乙酸乙酯组分中。同时 ,
各萃取物对真菌作用不明显。
2.4　抗菌谱系测定
由于在初筛实验中石油醚组分与醇提物及水提
物对各类微生物作用不明显 ,及各组分对真菌作用
不显著 。因此只对乙酸乙酯与正丁醇组分对各类细
菌抑菌效果做了定量实验 。按 1.2.2制作 ,培养 24h
取出各培养皿 ,观察细菌生长情况 ,找出最低抑菌浓
度(MIC),结果见表 4。将同一浓度梯度的提取液点
样于同一平板 ,各制作 3个重复 ,并设有试剂对照
(中间孔)。各试剂对照组均未产生明显的抑菌环
(图略)。
将实验结果比照庆大霉素敏感等级 (高敏为
<0.2U/mL,中敏为 0.2～ 1.0U/mL,低敏为 1～ 5U/mL,
抗药为 >5U/mL),可见刺山柑叶子提取物对 5株实
验菌具有较强的抑菌作用 ,属中敏范围 。
2.5　各萃取组分化学成分系统预试
结合圆形滤纸法和试管法对各组分的化学成分
检测结果来看(表 5),黄酮 、甾体 、萜类化合物及生物
碱在正丁醇与乙酸乙酯萃取组分中明显存在 ,而在
其他组分中不明显。结合抑菌实验结果及文献资
料 ,推测正丁醇和乙酸乙酯萃取组分的黄酮及生物
碱成分是主要的抗菌成分。
3　讨论
3.1　实验结果表明 ,该方法工艺简单 ,超声波可以强
化乙醇浸提法 ,达到省时 、高效 、节能的目的 ,此方法
采用全物理过程 ,无任何污染 ,是一条理想的提取黄
酮类物质的途径 ,具有广阔的应用前景 。超声波强
化萃取的最主要原因是由于超声波产生的空化效
应。我们在超声提取实验中发现 ,提取不同的植物
有效成分 ,选择不同的参数会出现不同的结果 ,即使
是提取同一植物有效成分 ,也会因参数的不同而得
到不同的实验结果 。因此在超声提取植物有效成分
时 ,找到适宜的参数是提高提取率的关键 ,只有选择
合理的参数 ,使液体达到最大的空化状态 ,才能获得
良好的提取效果。
3.2　刺山柑叶乙醇提取物对各种细菌有一定抑制作
用;正丁醇萃取组分对 5种供试细菌均表现出较强
抑制作用 ,其次是乙酸乙酯组分 ,水部分的抗菌活性
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最弱 ,提示抗细菌活性成分主要存在于正丁醇组分 。
从化学成分预试实验中可以看出 ,正丁醇及乙酸乙
酯萃取部分与其他组分相比含有明显的黄酮及生物
碱 ,揭示这两种成分可能是主要的抑菌成分。但抑
菌效果是否与其他成分如萜类 、酚类化合物有关 ,还
是多种化合物协同作用的结果 ,以及结构与活性的
关系等等问题 , 尚需进一步分离和生物活性跟踪
测定。
以上研究为今后分离纯化刺山柑叶的抗菌活性
成分提供了线索 ,为有效地开发和利用这种植物资
源提供了依据。
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(上接第 191页)
3　结论
对 20株能产生淀粉酶的霉菌进行了生淀粉分
解酶的筛选 ,筛选到两株生淀粉分解酶和熟淀粉酶
活性都高的霉菌 Rhizopussp.2和 Asp.oryzae3811,它
们的生淀粉分解酶活性分别为 122.42、130.89U/g湿
曲 ,熟淀粉酶活性分别为 5180.06、5818.31U/g湿曲 。
虽然两个菌株的生淀粉分解酶和熟淀粉酶活性基本
相同 ,但它们在与酒精酵母 CandidatropicalisXY-3
和安琪酒精酵母共同进行生木薯粉酒精发酵时 ,无
论是酒精产率 、发酵率还是淀粉糖化率均有明显不
同 , Rhizopussp.2与 CandidatropicalisXY-3共同发酵
25%的生木薯粉时的酒精产率为 8.10%(v/v)、发酵
率为 65.51%,与安琪酒精酵母共同发酵的酒精产率
为 9.20%(v/v)、发酵率为 74.40%;而 Asp.oryzae3811
与 CandidatropicalisXY-3共同发酵的酒精产率为
5.80%(v/v)、发酵率为 46.91%,与安琪酒精酵母共
同发酵的酒精产率为 7.30% (v/v)、发酵率为
59.04%。两个菌株的发酵性能差异是由于二者的淀
粉酶组成和比例不同造成的 , Rhizopussp.2的淀粉酶
系有 5个组分 , Asp.oryzae3811的淀粉酶系有 8个组
分 , Rhizopussp.2 的主要淀粉酶组分分子量大
(99kDa),而 Asp.oryzae3811主要淀粉酶组分分子量
(50kDa)比 Rhizopussp.2的小。
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