全 文 ：工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
明日叶原产地在日本著名健康长寿之乡八丈
岛，属于伞科多年生草本耐寒植物[1]。明日叶被誉为
“21世纪的健康食品”，富含特有成分查尔酮和香豆
素及人体需要的多种成分。具有抗溃疡、抗血栓、抗
癌、降血压、降胆固醇的作用，并能够预防肝硬化、动
脉硬化，改善胃肠道功能、改善睡眠、改善视力、提高
人体免疫力[2-6]。黄酮类化合物又叫做生物总黄酮，具
有增强心血管功能、抗肿瘤、增强免疫力、抗菌消炎、
抗辐射、延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等作用[7-10]，
是包括明日叶在内的许多中草药的有效成分。目前，
国内对明日叶的开发尚处于初级阶段，对明日叶中总
黄酮的提取工艺及检测方法的研究尚未见报道[11-13]，
具有极大的开发潜力。与常规提取方法相比，微波提
取具有选择性高、快速高效、溶剂消耗少、活性成分
提取率较高、不产生噪音、适合于热不稳定物质的提
取等优点。本文利用微波法对明日叶中黄酮的提取
进行了研究，并对其测定方法进行了探讨，为开发和
利用明日叶中的黄酮类成分提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
明日叶样品 购于本地药店，已干燥至恒重；芦
邹毓兰1，单 虎2，高桂余1，吕海涛1，*
（1.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109；
2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）
摘 要：对明日叶中总黄酮的提取工艺和检测方法进行了研究。采用微波法，利用单因素和正交实验对明日叶中总黄
酮的提取工艺进行了优化，分别通过AlCl3和Al（NO3）3显色法，建立了明日叶中总黄酮的分光光度检测方法。 结果表
明，AlCl3显色法的最佳提取条件为：乙醇浓度85%、提取3次、料液比1∶25（g/mL）、微波功率600W、提取80s，样品中总黄
酮的得率为1.48%；Al（NO3）3显色法的最佳提取条件为：乙醇浓度40%、提取3次、料液比1∶25（g/mL）、微波功率700W、
提取80s，样品中总黄酮的得率为1.67%。 另外，对两种显色方法的显色稳定性进行了初步探讨。
关键词：明日叶，总黄酮，正交实验，微波辅助提取
Study on microwave-assisted extraction and determination of total
flavonoids from Angelica Keiskei Koidzumi
ZOU Yu-lan1，SHAN Hu2，GAO Gui-yu1，LV Hai-tao1，*
（1.College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；
2.Department of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）
Abstract：The extraction and determination techniques of total flavonoids in Angelica Keiskei Koidzumi were
investigated. The microwave-assisted extraction progress of total flavonoids was studied to get the optimum
conditions by single factor and orthogonal experiments. The content of total flavonoids was determined by
ultraviolet-visible spectrophotometer with AlCl3 and Al（NO3）3 developing methods，respectively. The optimum
conditions of AlCl3 developing method were 85% ethanol concentration，extraction 3 times，600W microwave
power，1 ∶25 of material to liquid ratio，80 seconds extraction time. Under these conditions，the total flavonoids
yield was 1.48%. The optimum conditions of Al（NO3）3 developing method were 40% ethanol concentration，
extraction 3 times，700W microwave power，1 ∶25 of material to liquid ratio，80 seconds extraction time. Under
these conditions，the total flavonoids yield was 1.67%. The preliminary study for the stability of chromogenic
solution was also investigated.
Key words：Angelica Keiskei Koidzumi；total flavonoids；orthogonal test；microwave-assisted extraction
中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）05-0201-05
收稿日期：2011－06－14 * 通讯联系人
作者简介：邹毓兰（1986-），女，在读硕士研究生，研究方向：天然产物
化学及其应用研究。
基金项目：国家十二五科技支撑课题（2011BAD34B03）；青岛农业大
学重点项目（610608）。
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明日叶中总黄酮的微波辅助提取工艺
和检测方法研究
201
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.05.029
Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第5期
丁标准品 购于Sigma公司；乙醇、硝酸铝、亚硝酸
钠、氢氧化钠、氯化铝等试剂 均为分析纯。
紫外-可见光分光光度计 日本岛津；CASCADA
超纯水系统 Pall Corporation；AR2140电子天平 上
海奥豪斯国际工贸公司；50～200μL P200移液器、
200～1000μL P1000移液器 北京吉尔森科技有限公
司；循环水真空泵SHB-B88 郑州长城科工贸有限
公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；
微波合成萃取仪 北京祥鹄科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 明日叶总黄酮含量的测定
1.2.1.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品5.0mg，
用60%乙醇定容于50mL的容量瓶中，即得0.10mg/mL
芦丁对照品溶液。
1.2.1.2 AlCl3显色法 精密量取对照品溶液1.0mL，
置于10mL容量瓶中，加入4.0mL 80%乙醇，摇匀，再
加入4mL 1% AlCl3溶液，用80%乙醇定容，摇匀，放置
10min，在300~600nm波长范围内进行扫描，得到最大
吸收波长为409nm。
精密量取芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0mL，分别加入80%乙醇补至5mL，按照上述操作，在
409nm下测其吸光度。以芦丁对照品溶液的浓度为横
坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回
归线方程为：y=0.0271x-0.0393，相关系数为0.9981。
1.2.1.3 Al（NO3）3显色法 精密量取对照品溶液4.0mL，
置于25mL容量瓶中，加入80%乙醇6.0mL、5% NaNO2
和10% Al（NO3）3溶液各1mL，静置5min，加入4% NaOH
溶液5mL，摇匀，放置5min，用80%乙醇定容，在400～
700nm波长范围内进行扫描，得到最大吸收波长为
500nm。
精密量取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、
6.0mL，置于25mL容量瓶中，分别加入80%乙醇补至
6.0mL，按照上述操作，在500nm下测其吸光度。以芦
丁对照品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制
标准曲线，得到线性回归方程为：y=0.0085x+0.0085，
相关系数为0.9953。
1.2.1.4 样品液的制备和总黄酮含量的测定 准确
称量明日叶1g，置于250mL三口瓶中，加入一定量、一
定浓度的乙醇溶液，在微波合成萃取仪中提取，控制
微波功率和提取时间，提取结束后将三口瓶取出冷
却至室温，抽滤；多次提取时，将滤渣转移到三口瓶
中重复操作，合并滤液，用旋转蒸发仪旋蒸，用80%
乙醇定容至100mL。分别用AlCl3显色法和Al（NO3）3显
色法，按照上述操作测定其吸光度，由回归方程计算
出总黄酮的含量，进而求出样品中总黄酮的得率。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 提取时间的影响 称取1g明日叶，置于250mL
三口瓶中，加入30mL 80%乙醇，微波功率设为700W，
温度为80℃，提取时间分别为30、60、90、120、150s，分
别利用AlCl3显色法和Al（NO3）3显色法测定出样品中总
黄酮的得率。
1.2.2.2 微波功率对提取效率的影响 称取1g明日
叶，置于250mL三口瓶中，加入30mL 80%乙醇，提取
90s，温度为80℃，微波功率分别设为500、600、700、
800、900、1000W，分别利用AlCl3显色法和Al（NO3）3显
色法测定出样品中总黄酮的得率。
1.2.2.3 料液比对提取效率的影响 称取1g明日叶，
置于250mL三口瓶中，微波功率设为600W，温度为
80℃，乙醇浓度80%，提取90s，加入乙醇的量分别为
10、15、20、25、30mL，分别利用AlCl3显色法和Al（NO3）3
显色法测定出样品中总黄酮的得率。
1.2.2.4 温度对提取效率的影响 称取1g明日叶，置
于250mL三口瓶中，加入25mL 80%乙醇，微波功率设
为600W，提取90s，温度分别为40、50、60、70、80℃，分
别利用AlCl3显色法和Al（NO3）3显色法测定出样品中总
黄酮的得率。
1.2.2.5 乙醇浓度对提取效率的影响 称取1g明日
叶，置于250mL三口瓶中，微波功率设为600W，提取
90s，温度为80℃，溶剂分别为蒸馏水、20%乙醇、40%
乙醇、60%乙醇、80%乙醇和无水乙醇，分别利用AlCl3
显色法和Al（NO3）3显色法测定出样品中总黄酮的得率。
1.2.3 正交实验 在单因素实验的基础上，选取乙
醇浓度（A）、提取时间（B）、提取功率（C）、料液比（D）
和提取次数（E）为考察因素，以样品中总黄酮的得率
为考察指标，设计五因素四水平的正交实验（表1）。
1.2.4 显色稳定性实验 将制得的供试品溶液平均
分成三份，一份在室温下、一份放置在冰箱中低温避
光下保存、一份放置在阳光照射下，每隔一段时间，
分别利用AlCl3显色法和Al（NO3）3显色法测供试品溶液
的吸光度，以此来考察供试品溶液的稳定性。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 提取时间对样品中总黄酮得率的影响 从图1
可以看出，两种方法样品中总黄酮的得率都具有相
同的变化趋势，总黄酮的得率随着提取时间的延长
先增加后减小，当提取时间为90s时，总黄酮的得率
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels of total flavonoids
水平
因素
A 乙醇
浓度（%）
B 提取
时间（s）
C 提取
功率（W）
D 料液比
（g/mL）
E 提取
次数（次）
1 40 70 500 1∶15 1
2 55 80 600 1∶20 2
3 70 90 700 1∶25 3
4 85 100 800 1∶30 4
图1 提取时间对样品总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on total flavonoids yield
提取时间（s）
30 60 90 120 150
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
总
黄
酮
得
率
（
%）
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
202
工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
图4 提取温度对样品中总黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of temperature on total flavonoids yield
提取温度（℃）
40 50 60 70 80
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
总
黄
酮
得
率
（
%）
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
达到最高；当提取时间大于90s时，总黄酮得率下降。
这可能是因为在提取初期，黄酮在微波的作用下能
较快地从基体中分离，能够快速溶出；但随着提取时
间的增加，体系的温度会过热并出现爆沸的现象，一
方面高温可能导致黄酮类物质分解；另一方面，爆沸
也会引起部分药材被冲至容器壁上，影响液固两相
的进一步接触，使得率降低[14-15]。
2.1.2 微波功率对样品中总黄酮得率的影响 从图2
可以看出，两种方法样品中总黄酮的得率都具有相同
的变化趋势，AlCl3显色法在500~700W时，功率对样
品中总黄酮得率影响不大，两种显色方法总黄酮得
率在600W时达到最大，功率大于700W之后，总黄酮
得率趋于下降。
2.1.3 料液比对样品中总黄酮得率的影响 从图3
可以看出，两种方法样品中总黄酮的得率都具有相
同的变化趋势，随着提取溶剂的增多，样品中总黄酮
得率逐渐增大，当料液比为1∶25时总黄酮得率达到
最大。
2.1.4 温度对样品中总黄酮得率的影响 从图4可以
看出，两种方法样品中总黄酮的得率都具有相同的变
化趋势，总黄酮得率均随着温度的升高而逐渐增加。
2.1.5 乙醇浓度对样品中总黄酮得率的影响 从图5
可以看出，两种方法样品中总黄酮的得率都具有相
同的变化趋势，总黄酮得率均随着乙醇浓度增大而
增大，在浓度为80%时的总黄酮得率最大，之后开始
下降。
2.2 正交实验结果
由表2正交实验直观分析可知，AlCl3显色法中各
因素对总黄酮得率的影响顺序为：A>E>D>C>B。由表
3方差分析可知，从统计学的角度而言，五个因素均
为不显著性因素，得出最佳提取条件为A4B2C2D3E3，
即：乙醇浓度85%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取
功率600W，提取80s。
由表2正交实验直观分析可知，Al（NO3）3显色法中
各因素对总黄酮得率的影响顺序为：A>E>B>C>D。
图2 微波提取功率对样品总黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of microwave power on total flavonoids yield
提取功率（W）
500 600 700 800 900 1000
1.6
1.55
1.5
1.45
1.4
总
黄
酮
得
率
（
%） Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
图3 料液比对样品总黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of material and liquid ratio on total flavonoids yield
料液比（g/mL）
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30
1.56
1.51
1.46
1.41
1.36
总
黄
酮
得
率
（
%）
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
图5 乙醇浓度对样品中总黄酮得率的影响
Fig.5 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield
乙醇浓度（%）
0 20 40 60 80 100
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
总
黄
酮
得
率
（
%）
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
表2 正交实验结果
Table 2 Orthogonal test results
实验号 A B C D E
总黄酮得率（%）
AlCl3
显色法
Al（NO3）3
显色法
1 1 1 1 1 1 0.935 1.419
2 1 2 2 2 2 1.156 1.684
3 1 3 3 3 3 1.197 1.728
4 1 4 4 4 4 1.145 1.507
5 2 1 2 3 4 1.485 1.640
6 2 2 1 4 3 1.363 1.728
7 2 3 4 1 2 1.138 1.404
8 2 4 3 2 1 1.082 1.404
9 3 1 3 4 2 1.422 1.522
10 3 2 4 3 1 1.344 1.434
11 3 3 1 2 4 1.370 1.300
12 3 4 2 1 3 1.437 1.522
13 4 1 4 2 3 1.510 1.331
14 4 2 3 1 4 1.496 1.564
15 4 3 2 4 1 1.418 1.302
16 4 4 1 3 2 1.477 1.360
AlCl3
显色法
k1 1.108 1.338 1.286 1.251 1.195
k2 1.267 1.340 1.374 1.280 1.298
k3 1.393 1.281 1.299 1.376 1.377
k4 1.475 1.285 1.284 1.337 1.374
R 0.367 0.059 0.090 0.125 0.182
Al（NO3）3
显色法
k1 1.585 1.478 1.452 1.471 1.390
k2 1.544 1.596 1.537 1.430 1.493
k3 1.444 1.433 1.548 1.540 1.577
k4 1.382 1.449 1.419 1.515 1.496
R 0.203 0.163 0.129 0.110 0.187
203
Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第5期
图7 室温下稳定性实验
Fig.7 Results of the stability in room temperature
时间（h）
0 10 20 30 40 50 60 70
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
图8 阳光照射下稳定性实验
Fig.8 Results of the stability under sunlight
时间（h）
0 2 4 6 8 10
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
图6 低温下稳定性实验
Fig.6 Results of the stability in the refrigerator with 4℃
时间（h）
0 10 20 30 40 50 60 70
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
Al（NO3）3显色法
AlCl3显色法
由表3方差分析表可知，从统计学的角度而言，五个因素
均为不显著性因素，得出最佳提取条件是A1B2C3D3E3，
即：乙醇浓度40%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取
功率700W，提取80s。
2.2.1 最佳工艺条件的验证 在最佳提取工艺条件
下提取，用相同方法检测，重复5次，AlCl3显色法检测
的样品中总黄酮的平均得率是1.48%，RSD%=0.67，
Al（NO3）3显色法检测的样品中总黄酮的平均得率是
1.67%，RSD%=2.59，均与正交表的最高得率基本一
致。表明利用两种显色方法测定，提取的总黄酮含量
高，工艺稳定。
相比较而言，Al（NO3）3显色法测得的总黄酮的含
量比AlCl3显色法测得的含量要相对高一些，文献中
关于总黄酮的检测方法大多用Al（NO3）3显色法，因为
在中性或者碱性的条件下，黄酮类化合物会与铝盐
形成螯合物，Al（NO3）3显色法对于某些非黄酮类化合
物在500nm处也有吸收，致使测得的含量比AlCl3显
色法要高，提取工艺更稳定。
2.2.2 加标回收率实验 最佳提取工艺条件下的样
品，加入芦丁标准品，分别用AlCl3和Al（NO3）3显色法
检测出加标后样品中总黄酮含量，计算加标回收率，
结果见表4。结果表明，两种显色方法的加标回收率
均比较高而且比较稳定，从而说明总黄酮的两种显
色法检测结果均准确、可靠。
2.3 显色稳定性实验
如图6~图8所示，在低温（4℃）、室温和阳光照射
下两种显色法供试品溶液吸光度随时间的延长虽有
所变化，但总体变化不大，说明两种显色法是比较稳
定的。
3 结论
本实验探究了明日叶中总黄酮的微波提取工艺，
AlCl3显色法的最佳提取工艺为：乙醇浓度85%，提取
3次，料液比1∶25（g/mL），提取功率600W，提取80s，样
品中总黄酮得率为1.48%；Al（NO3）3显色法的最佳提取
工艺为：乙醇浓度40%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），
提取功率700W，提取时间80s，样品中总黄酮得率为
1.67%，工艺合理、简单、稳定性好。
同时，探究了AlCl3和Al（NO3）3两种显色方式的分
光光度法检测明日叶中的总黄酮，两种显色检测方
法简单、可靠，Al（NO3）3显色法测得的总黄酮得率要
稍高于AlCl3显色法。显色溶液在室温下、阳光照射
下、低温避光下具有良好的稳定性。
参考文献
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表4 加标回收率测定结果
Table 4 Rusult of standard addition recovery
显色方法 编号
样品量
（μg）
加入量
（μg）
测得量
（μg）
回收率
（%）
平均回收率
（%）
AlCl3
显色法
1 145.498 468 628.413 103.19
99.232 290.996 312 602.583 99.87
3 436.494 156 584.133 94.64
Al（NO3）3
显色法
1 166.912 468 650.735 103.38
102.732 333.824 312 658.088 103.93
3 500.736 156 658.088 100.87
表3 AlCl3显色法总黄酮得率方差分析表
Table 3 Intiutive analysis result of total flavonoids yield
因素
偏差平方和
自由度
F比
F临界值AlCl3
显色法
Al（NO3）3
显色法
AlCl3
显色法
Al（NO3）3
显色法
A 0.307 0.102 3 3.280 1.619 3.290
B 0.013 0.065 3 0.139 1.032 3.290
C 0.022 0.048 3 0.235 0.762 3.290
D 0.038 0.029 3 0.406 0.460 3.290
E 0.088 0.071 3 0.940 1.127 3.290
误差 0.47 0.31 15
（下转第207页）
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工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
1∶1。图2表明底物浓度为7.5%时，水解度与多肽得率
均达到最大值。在低底物浓度时，酶与底物不能充分
结合，随着底物浓度的增加，越来越多的酶分子与底
物相结合，使酶解反应充分进行。一旦底物浓度过
大，达到10%以上时，多余的酶分子会形成细小颗粒
漂浮于酶解液中。
2.3.3 酶添加量对酶解反应的影响 分别讨论了
2000~8000U/g（料）之间不同酶活添加量对双酶组合
水解反应的影响，其他反应条件设为：底物浓度7.5%，
pH7.5，温度50℃，酶活比为1∶1。图3显示，随加酶量的
增加，水解度与多肽得率均逐渐增加，但考虑到酶的
价格较高，最终选择酶活添加量为6000U/g（料）。
2.4 双酶水解正交实验
通过单因素实验初步确定双酶组合的水解时间为
4h，温度为45~50℃、pH7.2~8.0、酶活添加量为6000U/g
（料）、酶活比为1∶1、底物浓度为7.5%。以此为依据设计
正交实验，确定最佳酶解工艺条件。温度和pH的确定是
根据两种酶自身最适范围取的值且范围小，并不需要
做单因素实验，酶活比是根据前期预实验得到的理论
值。且pH、温度、酶活比、酶添加量这几个因素对实验
的影响比其他因素要明显，所以作为正交实验的因素。
由表4的极差分析表明，对水解度的影响顺序为：
A>D>C>B，最优水平组合为：A1B3C3D3。对多肽得率的
影响顺序为：A>C>B>D，最优水平组合为：A1B3C2D2，
该组合不在9组实验中。依此条件重新进行实验，结
果DH为32.5%，多肽得率为72.8%，与A1B3C3D3结果相
近，但从经济角度考虑，A1B3C3D3组合中酶用量大，成
本较高。因此，最终选定A1B3C2D2为最优酶解工艺。
3 结论
通过实验，确定了胰蛋白酶与复合蛋白酶为水
解鹿茸蛋白制备鹿茸多肽的最佳酶系组合，其最适
酶解工艺条件为：温度48℃、pH7.2、底物浓度7.5%、
酶与底物浓度比6000U/g，两种酶比例为1∶1，水解时
间4h。在此条件下对鹿茸蛋白水解，水解度为32.5%，
多肽得率为72.8%。
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图3 酶添加量对水解度和多肽得率的影响
Fig.3 Effect of enzyme amount on degree of hydrolysis and the
yield of polypeptide
酶添加量（U/g（蛋白））
30
25
20
15
10
5
0
DH
（
%）
2000 4000 6000 8000
72
70
68
66
64
62
60
多
肽
得
率
（
%）
DH
多肽得率
表4 正交实验设计结果
Table 4 The results of orthogonal experiment
实验号 A B C D DH（%） Y（%）
1 1 1 1 1 25.1 71.8
2 1 2 2 2 26.2 73.5
3 1 3 3 3 33.4 71.6
4 2 1 2 3 21.3 64.2
5 2 2 3 1 20.5 56.4
6 2 3 1 2 20.6 63.1
7 3 1 3 2 18.5 65.5
8 3 2 1 3 18.2 61.3
9 3 3 2 1 17.8 67.9
DH
K1 84.7 64.9 63.9 63.4
K2 62.4 64.9 65.3 65.3
K3 54.5 71.8 72.4 72.9
R 10.1 2.3 8.5 9.5
Y
K1 216.9 201.5 196.2 196.1
K2 183.7 191.2 205.6 202.1
K3 194.7 202.6 193.5 197.1
R 11.1 3.8 4.0 1.7
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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