全 文 ：药学学报 A et aP hr a m a e e ut i e a S, n s e a l , 9 3 ; 2 8 ( 10 ) : 7 2 8~ 7 3 -
前胡丙素对培养大鼠心肌细胞内游离 aC ’ ` 的影响
吴 欣 石成璋 ’ 吴晓冬 ’ `
(南京中医学院中医药研究所 , 南京 2 1 0 029 ; ` 中国医学科学院药物研究所 , 北京 l 0() O5 。 ;
二南京铁道 医学院药理教研室 ,南京 2 1 0 0 09)
提要 用 F ur a 一 2 / A M 技术直接观察前胡丙素 (P ar 一 C )对培养大鼠心室肌细 胞内游离钙的彩响 。
结果显示 rP a 一 C 浓度为 0 . 1一 1 . 0 尽m ol · L 一 ’可明显抑制 ca 1C 2 , 高 K 十 和 aB y K 86 4 4 引起匡丫 ! 、 增 加 .
并且有剂量 效应关系 , 对 ou a ba in 引起的〔ca Z` 」i 增加无明显作用 。 结果提 示 rP a 一 ( 降低心肌细胞
「c 。 ” 一 ] i 的作用与抑制电压依赖性钙通道有关 。
关祖词 前胡丙素 ;新型钙离子荧光指示剂 Fur a 一 2 ;心肌细胞 ;钙离子 ;钙拮抗剂
前胡丙素 ( p r ae r uP t or in c , rP a 一 c )是从中药白花前胡中提取的有效成分 戈” , 具有扩张血竹 、
抑制心肌收缩力及改善心肌顺应性等作用 ` ’ · “ ’ 。 初步研究表明它的作用可能 与阻钙内流有关 。
本文用 F ur a 一 2/ A M 技术直接观察 rP a 一 c 对培养大鼠心室肌细胞内游离钙浓度的变化 . 并对阻
钙内流的机制作了进一步分析 。
材 料 和 方 法
药物 rP a 一 c 用 10 %聚乙二醇配成 20 m m of · L 一 ,的贮存液 . 避光低温保存 ,临用前稀释 。
uF ar
一
2/ A M 为中国医学科学院药物研究所产品 . aB y K 8 6 4 4 由德国 aB ye : 药厂惠赠 。 胰蛋白
酶 , rT it on x 一 10 0 购 自美国 M er c k 公司 。 o ua ba in 中国药品生物制品检定所提供 。 E G T A 购 自中
国医药公司北京分公司 ,进 口二级 。
仪器 双波长荧光分光光度计 , 岛津 F一 5 0 0 0 。
心肌细胞培养 按文献 “ · 5’处理 w ist ar 新生乳 鼠心室 ,用 0 . 05 %的胰蛋白酶消化 ,分离 ,
以培养基制备成 l 护 个 / m l 细胞悬液 ,接种于 50 ml 培养瓶中 , 放在 37 C 含 5% c o : 的培养箱
中培养 ,每隔 Z d ,换液一次 ,一周后用于测定 。
细胞内游离钙测定 经一周培养的心肌细胞 ,实验前放在倒置显微镜下观察细胞形态 , 用
吹打法分离贴壁心肌细胞 ,细胞悬液离心 ( 5 0 0 r / m i n ) 3 m i n , 沉淀加入 3 m l H a n k ` s 液悬浮 ,再
次离心 , 条件同上 , 4 C静置 1 5 m i n 去上清液 ,加入 5 m l n M E M 培养基 , 3 7 C 预温 5 m in 后 ,加
入 F u r a 一 2 / A M (终浓度 1 o m o x · L 一 , ) , 3 7 C 振荡 ( 3 5 次 / m i n ) 5 0 m i n 后 , 离心 ( l弓o o r / m i n ) 5
m i n
,弃上清液 ,沉淀用 H a n k ` S 液冲洗两次 ,最后加入 比 n k ` s 液 3 m l 悬浮 。
荧光测定条件 E x 3 4 0 / 3 8 0 n m , EM 4 9 5 n m . 扫描速度 2 0 n m / m i n , 扫描范围 3 0 0一 4 0 0
n m
,
E x 光栅 : 5 n m , EM 光栅 : 1 0 n m . 先以 3 0 0 ~ 4 0 0 n m E x 扫描 ,观察负载情况 , 然后进行光
本义 j l 一9 9 3 年 一月 19 1二I收到J
DOI : 10. 16438 /j . 0513 -4870. 1993. 10. 002
药学学报 Aet aP h r am a e eu ti eas i ni ea1 9 9 3 ; 2 8 (1 0) :75 2一 3 1 7
谱扫描 , 观察药物对荧光强度的影响 , 由公式 ( ca Z ` ) 一 K d (琴二续 )黔 ) 。 m 计算细胞内游离三、 m a x — r 、 f U Z
钙浓度 , K d = 2 2 4 。
结 果
. 阵~ . 碑 ,
对 c a e 一: 引起 [C a , 伟」i 增加的影响
静息状态下 ,大 鼠心室肌细胞内游离钙浓度为 1 29 士 10 n m of · L 一 ` , 「aC Z + ] i 随胞外钙浓度
增加而升高 。 加入 10 m o l · L 一 ` C a C I: 时 , 〔C a Z+ ] i 增加到 3 4 8士 4 n m o l · L 一 ` , 为静息时的 2 . 7 倍 。
加入 ] . 0 以m o l · L 一 ` p r a 一 C 5 m i n 后 , 再加 C a C 12 1 0 m o l · L 一 , , 细 胞 内 C a Z 十增 加到 2 38 士 5
n m ol
·
L
一 ’ ,为静息时的 1 . 7 倍 。 结果表明给药前后 [ c a Z门 i 的变化有明显差异 (图 l ) 。
, 对高 K }去极化引起的仁ca Z+ 玉增加的影响
图 2所示 , 加入 K e l 2 5 一 7 5 m m o l · L 一 ` , [ e a Z十 ] i 明显增加 。 预先加入 P r a 一 C 0 . 0 1一 1. 0
林m o l · L , , 呈浓 度 依 赖性 抑 制 高 K 斗 去 极 化 引起 的 〔C a , ` 〕 i 增 加 , p r a 一 C 1 p m o l · L ` 时 ,
7 5 m o l
·
L
一 `
K e l 增加的〔C a Z+ 〕i 仅为对照组的 5 0% 。 相同条件下 , v e r a , m i l l 以m o l · L一 ’也明显
拮抗 K CI 引起的〔C a Z” ]i增加 , 两者对静息状态下仁aC , + ] i 均无明显影响 。
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对 B a y K 8 6 4 4 引起〔c a , + ] i 增加的影响
一 ` 加入 助 y K 8 6 4 4 3 娜 。 l . L ` , 仁e a , + 〕i 增加到 6 3 1士 2 。 。 m o l · L 一 ` 。 预先加入不同浓度的
P r a
一
e 5 m i n 后 , aB y K 8 6 4 4 增加 [ aC Z + 」i 的作用明显减弱 , p r a 一 C 1 . 0 件m o l · L `和 1 0 林m o l · L 一 `
时 , 〔C a Z+ 〕i仅为对照组的 5 8%和 4 2% ( 图 3 ) 。
对强心试引起〔C扩 + 」i 增加的影响 .
图 4 表示 o u a ba in 1 0 n m o l · L 一 ’引起 [ C a Z+ 〕i 明显增加 。 预先 5 m i n 加入 P r a 一 C 0 . 1一 1 . 0
协m of · L ` ,仅轻度削弱 ou a ba in 增加 〔C a Z一门i 的作用 ,但与给药前相比无统计学意义 , 表明 rP a 一 C
药学学报 A et a p ha rm a e e ut ; e a S in i e a 19 9 3 ;2 8 (10 ): 2 78一 7 3 1
不能阻断 ou ab an i引起的细胞内游离钙浓度增加 。
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讨 论
我们以前的实验表明 rP a 一 c 有负性肌力作用 , 并有频率依赖性 , 对静息后加强无 明显影
响 ,提示可能有阻断心肌钙通道的作用 ,而对细胞内钙释放无 明显影响 ` “ ’ ,但一直没有进一步
的证据 。 本实验采用新一代钙离子荧光指示剂 uF r a 一 2/ A M 直接观察 rP a 一 c 对心肌细胞内游离
钙的影响 ,结果表明 , P r a 一 c 可抑制 B ay K 8 6 4 4 ,高钾除极化和增加外钙引起的细胞内游离钙浓
度升高 ,但对 ou ab ia n 引起的细胞内钙升高无明显影响 。 目前普遍认为 , aB y K 8 6 4 4 和 K cl 均可
激活电压依赖性钙通道 , 促进细胞外钙 内流 `“ , 9 ) , ou ab ia n 主要是通过抑制 N a + 一 K 」 A T aP se 促
进 N a 一 ca 正向转运和抑制 N a 一 c a 逆向转运而升高细胞内钙 “ 。 ,川 , rP a 一 c 抑制 aB y K 8 6 4 和
K CI 促钙 内流的作用 , 而不影响 ou a ba in 引起的细胞内钙升高 ,提示 rP a 一 c 选择性地阻断通过钙
通道的钙内流 ,而对增加 内钙的另一重要途径 N a 一 ca 交换无明显影响 ,进一步证实了它的钙
拮抗作用 。
细胞 内游离钙浓度 的调节 除受细胞外钙内流 的影响 外 , 与胞 内钙库摄取钙 的能 力有
关 “ ” 。 rP a 一C 抑制心肌细胞内游离钙升高的作用机理 尚需进一步研究 。
参 考 文 献
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, 口叫口卜 石书
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d e a r d i a e m y oc y te s f r o m ca r d i o m y o Pa th i e h a m s t e r s
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C o r r e la t io n b e t w e e n t h e i n o t r o Pic a e t i o n o f o u a ba i n a n d i st e f f e e t s o n s u b e
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B i n d i n g o f 臼 2 + a n d N a + t o sa r e o le m m a l m e m b r a n e s : R e l a t io n t o e o n t r o l o f
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. 月m J hP 笋汉 1 9 8 0 ; 2 3 5 : H 3 7 3 .
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P r a C o n 〔Ca Z+ 〕1 i n is of a t e d r a t v e n tr i e u la r m y oc y tes u s i n g th e f l u o r e sce n t aC Z+ 一 in d ica to r
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C i n h i bi t ed t h e e l e v a t io n o f [ aC
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