全 文 ：药用植物刺山柑愈伤组织诱导及细胞生长代谢特征研究 *
王艳婷 甘 露 刘 薇 余龙江 果茂腾
(华中科技大学生命科学与技术学院 武汉 43 00 74)
摘要 :本文研究 了不 同外植体及激素对刺山柑愈伤组织诱导的影响 , 不 同激素配比对愈伤组织增殖培养以及悬浮细胞的生长与
代谢特征 。 结果表明 : 以刺山柑叶片作为诱导愈伤组织的材料 ,效果较佳 ;愈伤组织诱导和继代的适宜培养条件是分别是 M S+
.0 s m g 飞 2 , 4 一D +l . Om g/ L 6 一 B A 和 M S+l . Om g/ L Z , 4 一) l
.
s m g 飞6一 B A 。 刺山柑悬浮培养细胞的 生长周期为 30 天左右 , 细胞生长曲线
呈 “ s’ 形 , 生物童增长 .2 8 倍左右 ;细胞生长周期内 ,破源消耗规律表现为蔗糖和可溶性总糖的浓度持续降低 , 而还原糖则表现为
先升高后降低 ;过氧化物酶活测 定显示酶活水平与蔗糖浓度的高低呈一定程度的正相关 。
关健词 :刺 山柑 ;愈伤组织 ; 悬浮细胞 ;生长代谢特征
中图分类号 : 2 8 2 . 7 1 文献标识码 : A 文章编号 : 16 73一6 2 73 ( 20 07 ) 12 一 1779 一 05
R e s e ar e h o n ht e C a llu s In du
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C h in e se L ib ar 汀 C las s血以 i o n ( C比 ) : 2 82 . 7 1 D DC 也n e n t c od e : A
A irt e le DI : 167 3巧 27 3 (2X() 7 ) 12 一 1779一5
刺山柑 ( C a p p iar s sP in os a L )为白花菜科山柑属植物 ,主要
分布于西班牙 、地中海海湾地区 , 在我国新疆 、甘肃 、西藏等地
也广有分布 l[] 。刺山柑具有发达的根系和木质部 ,能够高效利用
地下水资源 ,被认为是典型的荒漠植物之一 2I[] 。 分析表明刺山
柑中含有挥发油 、生物碱类 、类黄酮类 、 菇类 以及芥子油贰等物
质 ,在抗菌 、抗炎 、抗氧化 、抗高血压 、 降血糖血醋 、利尿 、治疗痛
风和风湿等方面均有一定的功效阅 。 野外调查发现 , 由刺山柑
为建群种所形成的荒漠植物群落多呈小面积零星分布 ,群落的
层次结构极其简化 ,群落的种类组成也十分贫乏川 。植物细胞悬
浮培养是植物细胞生长的微生物化 ,其分散性好 、细胞形状及
细胞团大小大致相同 , 而且生长迅速 、 重复性好 、易于控制 , 悬
浮细胞培养已成为植物生物技术中最有用的手段之一 [,] 。 因此 ,
诱导刺山柑愈伤组织 、构建刺山柑的悬浮细胞体系并对其生长
与代谢特征分析进行研究分析 , 为通过细胞大规模培养生产相
关药用物质打下基础 。 目前 ,对刺山柑愈伤组织诱导与细胞系
的建立还未见报道 。 本实验对刺山柑不同外植体 、 不同表面消
毒方式 、 不同激素配比三个方面对愈伤组织的诱导及其增殖培
养方面进行了研究 , 并对其细胞生长曲线 、糖代谢及过氧化物
酶活性的变化特征进行了分析 。
材料与方法
1
.
1 实验材料
愈伤组织诱导材料 :刺山柑种子 、 萌发幼苗以及种植在华
中科技大学实验田的刺山柑 ( C a p p iar s sP ion as )L 植株 。 细胞生
长曲线测定以及代谢过程研究材料 : 固体基质上继代两次以
上 、生长旺盛 、结构疏松的愈伤组织无性系转入液体培养基中
得到的生长稳定的细胞系 。
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 愈伤组织的诱导与建立 外植体的选择与消毒处理 :首先
对刺山柑种子 、 幼嫩茎段以及幼叶用洗衣粉溶液浸泡 30 m in ,
并用刷子刷洗外植体表面 , 用流水冲洗材料 5 一 6h ;然后在超净
操作台上先用 70 %酒精浸泡 15一 205 , 无菌蒸馏水冲洗 3 次 ,再
* 基金项目 : 国家自然科学基金中国西部环境和生态科学重大研究计划 ( N 。夕02 02 01 6)
作者简介 : 王艳婷 , ( 19 83 一 ) ,女 ,硕士 , 主要从事植物生物技术方面的研究。
通讯作者 : 栗茂腾 , E · m a i l : lim a o t e n妙2 6@ 16 3 · c o m
(收稿 日期 : 2 0 0 7一 0 8一 10 接受日期 : 2 0 0 7 一0 8一3 1 )
DOI : 10. 13241 /j . cnki . pmb. 2007. 12. 050
用 0 . 1%升汞表面灭菌后用无菌水冲洗 3礴 次。
愈伤组织诱导培养 :接种前叶片被切成 0. s cm x0. sm c的小
块 ,茎切成 1 . oc m 长的小段 ,种子对切 。 将三种外植体接种于附
加有 1 . 5m 目飞 2 , 4一D 、 .3 0 m创L 6 一B A 以及 3%蔗糖的 M S 培养基
上 ( P H = .6 0) ,暗培养一周后 ,转人光照培养 , 比较不同外植体
在诱导培养基上产生刺山柑愈伤组织的情况 。 为了摸索不同激
素水平 、 种类以及不同激素组合对外植体诱导愈伤的影响 , 以
叶片为例进行了研究 ,采用单因子实验 ,结合 4 因素 3 水平正
交实验 ,采用浓度水平随机化设计 ,每处理接种 30 个外植体 ,
培养 30 d 后 ,统计愈伤组织的诱导率 。
愈伤组织增殖培养 : 在诱导实验获得最优组合的基础上 ,
设计不同的 2 , 4一D 和 6一 B A 浓度配比 , 找到适合愈伤组织增殖
的培养基配方。 每处理接种 4 瓶 , 重复继代两次 ,统计增殖倍
数 。
实验结果统计 :材料接种培养后 ,在 30d 对材料的污染率 ,
褐变率 ,启动率等进行统计 ,具体统计指标如下 : 污染率%袱污
染外植体数 /总接种数 ) x 10 0% ; 褐变率% = (褐变外植体数 /
总接种数 ) x 10 % ; 成活率% = (成活外植体数 /总接种数 ) x
10 % ;诱导率% :( 愈伤组织发生数 /总接种数 ) x 10 % ;增殖
系数 = ( 3 0d 后收获的愈伤组织鲜重 /接种前愈伤组织鲜重 ) x
1 (犯%
1
.
2 2 刺山柑母浮细胞生长与代谢特征分析 培养条件 : 采用
M s 液体培养基 ,其中添加 2, 4一 D 1. m0 叭 , 6一B A 1 . 5m醉 , 蔗糖
30 叭 , P H 5 . 8 ,接种量为 10 % ,光照强度 21 0 L u x , 14叭 ,温度
25 ℃土 l℃ ,摇床转速 10 一 12 帅m 。
生物量的测定 : 在液体培养基中按照每瓶 .3 09 的接种量
接人愈伤组织细胞 ,连续培养 3 2d ,每 4d 取悬浮培养的细胞 ,
抽滤至干后 , 于千分之一精度电子天平上称其鲜重 。
悬浮细胞培养过程中培养液中糖含量和过氧化物酶活性
测定 :蔗醋含量 、可溶性还原糖含量 、 可溶性总糖含量测定以及
过氧化物酶活性测定方法参照文献l0t] 。
2 结果与分析
2
.
1 升汞不同处理时间对不同外植体消毒效果的影响
不同外植体由于生理状态之间存在一定差异 , 因此对其消
毒时间的要求也不完全一致。研究表明 (表 l) :随着 0 . 1% 升汞溶
液消毒时间的延长 ,各种外植体都呈现出污染率降低 、褐变率增
加的趋势 。 其中 ,叶片以 s m in 的消毒时间为佳 ,成活率可达到为
75
.
1% ;而以茎段作为外植体时 ,其在 8一巧~ 内消毒效果均不
佳 , 延长消毒时间 , 污染情况虽能得到控制 ,但褐变程度大大提
高 ; 以种子作为外植体不存在褐变现象 , 只要保证材料消毒彻
底 , 即能实现较高的存活率。 但种子有效防止污染的消毒时间
(升汞消毒 15一 25 ~ )较叶片延长一倍多
,消毒剂的毒害可能相
对较大 , 而且消毒程序繁琐 。 综合考虑 , 以叶片作为刺山柑愈伤
组织诱导的外植体较合适 ,其最适升汞消毒时间为 sm in 。
.2 2 不同外植体对于刺山柑愈伤组织诱导的影响
表 I 升汞不同处理时间对刺山柑茎 、 叶和种子消毒效果的影晌
T ab le I T七e id u e n e e o f HgC 12 。℃ a it n e n t fo r d i月免r e n t t im e on st em s , le va e s an d s e d s o f C a P P iar s SP ion as L
.
S te ir li劝 t io n
t im e (而 n )
助a f S te m S e deT甲月
C o n t a l n in a-
t i o n ar t e
or wm gn
。 , , C O n ta m in a
O U I V I V a l T a l e
B r o场” ing
口 t e
S u r v l v al aI t e S u
r v i v al 口 t e
it O l m te t io n 口 t e
17
.
6
9 5
12 4
3 7 2
4 1
.
1
5 3
.
9
5 6
.
4
5 1
.
5
3 4 2
2 1
.
5
1 0 6
1 1
.
8
6 5
.
8
7 8
,
5
89
.
4
8 8
.
2
门马à`U,ù气,ù…呻,lù6, i`1.4fj、úl
r a t e
1 9
.
8
16
.
3
2 5
.
0
4 6
.
2
4 8
.
6
7 5
.
1
6 5
.
3
4 8
.
4
.64731.8.95
一、J1砂,且,`
表 2 不同外植体对刺山柑愈伤组织诱导率的影响
Tab l
e 2 hT
e i n fl u en ce o f id fe
r e n t e x Pl an t
s o f C a PPan
s sP iOn sa L
o n
cal l us idn uc t i
o n
art
e
外植体类型
Ex P lan t ty ep
叶 工心 a f
茎 S et m
种子 se ed
诱导率
如 d u e t i o n art e (% )
产生愈伤组织的时间
C al lu s fo mr at i
o n t im e ( d )
愈伤组织状态
C a l luS Sat t e
3 7
.
6
2 8
.
8
33
.
3
黄绿色 ,质地疏松
淡黄绿色 ,质地疏松
白色 ,质地较软
表 2 显示的是附加有 2 , 4 一D 1 . 5m叭 、 6一 B A .3 0 m吵 以及
3 %蔗糖的 M S 为基本培养基上 3 种不同外植体的愈伤组织诱
导情况 。 可看出 , 以叶 、茎和种子作为外植体均能诱导出愈伤组
织 ,但以 叶片作为外植体诱导出的愈伤组织状态最好 、诱导率
最高 ; 以茎作为外植体诱导出的愈伤组织状态和叶片类似 . 但
由种子诱导出的愈伤组织质地较稀软 , 不适合后续继代培养 。
不同外植体在产生愈伤组织的时间上差异较小 ,在外植体接人
培养基 4一5d 后 ,切 口处开始膨大 ,继续培养 4一5d 后 , 切 口处产
生少量的愈伤组织 ,但不同外植体所产生的愈伤组织色泽和状
态稍有差别。
.2 3 不同激幸组合对刺山柑愈伤组织诱导的影响
为了研究不同激素组合对刺山柑愈伤组织诱导的影响 , 以
叶片为例 ,对 6一 B A 、 2 , 4 一D 和 N A A 三种激素采用 9L ( 34) 正交
设计的方法来处理外植体 ,每处理接种外植体 30 个 , 以研究不
同激素种类和配比对刺山柑愈伤组织诱导的效果 (表 3 ) 。
经过对 2 , 4一D 、 6 一B A 以及 N A A 不同浓度组合的处理发
现 , 不同组合对刺山柑愈伤组织的诱导影响很大 。 由表 3 可以
看到 , 三种激素对刺山柑愈伤组织的诱导影响作用依次为 :
6
一
B A >2
,
4
一
D > N A A
。
方差分析结果表明 , 6一A 对刺山柑愈伤组织的诱导最为
显著 ,其他因素的作用不显著 (表 4 ) 。 由分析结果知 ,刺山柑愈
伤组织诱导的最佳激素组合为 : AZ B ZCI , 即 M S+l . om叭 6 一B A
十众 5m g/ L 2, 4 一 D 最适合刺山柑愈伤组织的诱导 。 进一步实验 在一定的差异 (图 l)
表明 , 由该方案诱导出的愈伤呈现三种不同形态 ,并且颜色存
表 3 正交实验结果
T ab l
e 3 hT
e er sul t
s o f o rt 五o g o n a l ex Pier m en t
处理组 A
6
一
B A (m g/ L )
B
2
,
4
·
D (m目L )
C
N A A (m gL/ )
D
B la Ck
诱导率(% )
nI du
e it o n 橄 e (% )
l ( 3 0 )
l ( 3
.
0 )
l ( 3
.
0 )
2 ( 1
.
0 )
2 ( 1
.
0 )
2 ( 1
.
0 )
3 ( 0
.
5 )
3 ( 0
.
5 )
3 ( 0
.
5 )
M 1 1= 4 2
.
4
M 2 1= 6 2 5
M 3 1= 3 9
.
2
R I = 2 3
.
3
l ( 1
.
0 )
2 ( 0
.
5 )
3 ( 0
.
1 )
l ( 1
.
0 )
2 ( 0
.
5 )
3 ( 0
.
1 )
1( 1
.
0 )
2 ( 0 5 )
3 ( 0
.
1 )
M 12 = 54乃
M 2 2 = 5 5
.
8
M 2 3 = 34
.
3
R Z = 2 1
.
5
1 ( 0 )
2 ( 1
.
0 )
3 ( 3
.
0 )
2 ( 1
.
0 )
3 ( 3
.
0 )
l ( 0 )
3 ( 3 0 )
l ( 0 )
2 ( 1
.
0 )
M 1 3= 5 7
.
5
M 2 3= 4 5 .0
M 3 3= 4 1
.
6
3R = 1.5 9
2
3
3
l
2
2
3
1
M 14 = 4 8
.
7
M 24二5 0
.
4
M 34 = 4 5
.
0
R月= 5 . 4
53
.
4
科 . 5
14 2
6 7 5
69
.
5
6 5
.
6
4 1
.
2
5 3 4
2 3
.
1
23456789MlZ3R
表 4 正交实验结果的方差分析
T ab l
e 4 V iar an
e e
an
a l邓 15 o f o hrt o go na l e x P e ir m e n t m sul t s
方差来源
F 0
.
0 5
V iar an
e e o ir ig
n
显著性
S i gn i if
e
an t
A
B
C
D
误差
9 5 7
.
1
8 5 3 6
4 2 0
.
6
4 5
.
7
4 5
.
7
4 7 8 6
4 2 6
.
8
2 10
.
3
22
.
9
2 0
.
9
1 8
.
6
9
.
2
19
.
0
注 : * 表示极显著水平 .0 01 .
N o t e : * *
.
v恻 5 1即i if e an t ly ( p < 0 . 0 1 )
表 5 6一B A 与 2 . 4一 D 不同浓度配比对刺山柑愈伤组织增殖效应的影响
Tab l
e 5 hT
e In fl u e n c e o f v iar
o u s 6
一
B A an d 2
.
4
一
D le ve l
s
on
e al l u s
m
u
ilt P li
e at i o n
图 1 愈伤组织不同状态
a
.白色 、稀泥状愈伤组织 ; .b 黄色 、块状愈伤组织冷黄绿色 、 疏松颗粒状
愈伤组织
F ig
.
1 C al l i o f d lfl 触r e in s at t e s
a
.
W l l i t e an d P
u l P y e a lli : b
.
Y e llow an d
n u
b y
e a lli: e
. 众 lly an d lo o s e n
g 旧n u le e a ll i
2 .4 愈伤组织增殖培养
本实验采用了 6 种不同的激素配比对生长状态一致的愈
伤组织进行了继代增殖实验 。 结果表明 , 2 , 4 一 D 与 6一 B A 的各种
组合对外植体的愈伤组织增殖倍数都在 2 一 3 倍之间 , 但 T 4 和
2T 处理组中愈伤组织增殖速度最快 ;除 T S 外 ,其他几种激素
组合的培养基中愈伤组织的生长情况大致相近 ,结合愈伤组织
的状态 , 我们认为适宜刺山柑愈伤组织继代的培养基为 1 . 5
m叭 6 一B A 和 1 . om叭 2 , 4 一D 配合的 M s 培养基 。 同时还发现 ,
在 1 0一.2 om叭 的浓度范围内 , 随着 2 , 4 一D 浓度增大 ,愈伤组织
的发生率相应提高 。
.2 5 刺山柑悬浮培养细胞的生长曲线
处理组
Ter a仃n e n t
浓度 (m g/ L )
C o n e即 tar t io n
(m叭 )
增殖系数
Mul it P l ie at ion
e
oe if
e ie n t
愈伤组织状态
C ia lus S恤 et
T 1 6
一
B A 1+0 2
,
4
一
D 0 5
T2 6
一
B A 1
.
+0 2
,
4
一
D 1
.
5
2
.
3 3 土 0 、 24
2
.
82 土 0 .3 6
6
一
B A 1
.
5+ 2
,
4
·
D 0
.
7
6
一
B A 1
.
5+2
,
4
一
D 1 0
6一 A 2 . 0+ 2 , 4 一D 0 . 5
6一 A 2 . 0十2 . 4 一D 1 . 0
2
.
32 土 0 .3 2
2
.
89 士 0 , 2 6
1
.
7 8 土 0 . 3 4
2
.
0 5 土 0 . 4 2
黄色、 颗粒状
淡黄色 、 白色 、
稀软
黄绿色 、颗粒状
黄绿色 、颗粒状
黄色 、块状
深黄色 、块状
3T4S6
总体上讲 ,刺山柑悬浮培养细胞的生长曲线呈 “ s’ 型 ( 图
2 )
,其生长过程大致可分为 3 个阶段 :即延迟生长期 、 对数生长
期和缓慢生长期 。 从开始接种到第 4 天是细胞延迟生长期 ,这
个阶段的细胞增殖量较少 ,可能是由于刚接种的细胞还没有完
全适应新的生长环境 ,不能很好的吸收营养物质所致 ;从第 4
天到第 24 天为对数生长期 ,在这个时期 , 细胞增殖速度相对较
快 ,从第 24 天以后 ,细胞增殖速度逐渐减缓 ,培养基开始变混
浊 ,细胞也由原先的黄色转变为棕褐色。 此时 ,如果再不更换培
养基 ,细胞易褐化死亡。 因此 ,培养细胞在第 24 天左右继代较
合适 , 这样可以较好的兼顾高生长量与生长状态佳二者的统
一 。 从培养初期至缓慢生长期过程中 ,刺山柑悬浮培养细胞的
鲜重增长了 .2 8 倍左右。
4
.
s
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培养时间
伪加 , t皿 d( )
圈 2 刺山柑 . 浮培养细胞的生长曲线
Fig
.
Z T七e gor w ht c切 vr e o f ce ll s us pe n s i o n cu ltU er o f C a PPiar s sp in o as L
.2 6 刺山柑 . 浮细胞的箱代谢情况
碳源是培养基中最重要的营养物质之一 。 在植物细胞培养
中 ,最常用的碳源是蔗糖 1 1] 。 由图 3 可知 ,最初蔗糖有少量降
解 ,初始浓度为 28 . 71 g/ L ;从细胞延迟生长期开始 ,培养基中的
蔗糖在蔗糖转化酶的作用下水解为葡萄糖与果糖 , 培养 28 天
左右 , 培养液中仅有极少量蔗糖剩余。 整个培养过程 , 蔗糖平均
每天的消耗速度为 .0 89 叭。 延迟期蔗糖消耗较快 ,平均每天的
消耗速率为 .2 73 创 L 。约 60 %的蔗糖在对数生长期消耗 , 到缓慢
生长期 ,仅有极少量的蔗糖剩余 。 由三个时期的蔗糖消耗情况
来看 , 延迟期的消耗速率最高 ,同时 ,这一阶段的还原糖生成速
率也最高 ,平均每天增长的还原糖浓度为 1 . 57醉 。 从第 16 天
开始 ,还原糖的量开始下降 ,到第犯 天后 ,仅有少量剩余。 整个
细胞周期 ,培养基中总糖的量一直呈下降趋势。 培养初期 , 总糖
的消耗量小 ,前 4 天糖浓度只下降了 .5 50 叭。 在对数生长期 ,
总糖的消耗速度加快 , 在 24 天内总糖消耗了 56 % 。 在 32 天的
培养过程中 ,消耗总糖浓度的总量 24 .0 3创L 。 由总糖的消耗曲
线与细胞生长曲线 (图 3) 对比可见 ,二者动态变化密切相关 。
延迟生长期 ,总糖消耗少 ,相应的 ,细胞的生长量也比较缓慢 。
在对数生长期 , 总糖被大量消耗 , 细胞生长量也最大。 由此可
见 ,碳源确实是细胞生物量积累的主要能源 。
培养天数
0 止世 e t如e (d )
圈 4 刺山柑. 浮培养过程中过级化物醉活性的变化
F i g
.
4 C h an ge s o f OP D ac it vi it es
o f C aP Pan
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本实验研究表明 , 随着培养时间的延长 , 悬浮细胞中的
PO D 活性呈现起伏变化 (图 4) ,在 3%的蔗糖环境下 ,培养细胞
中的 OP D 活性分别在第 12 天 、 第 20 天和第 28 天出现峰值 ;
而在 5%的蔗糖条件下 ,在第 12 天和第 28 天出现峰值。 由图 4
还可看出 , 不同蔗糖浓度下所测得的酶活分别在第 20 天和第
2 8 天出现重合 。 从整体水平分析 , 5%的蔗糖环境下 OP D 的酶
活水平稍高于 3%的蔗糖环境 , 这可能是由于高浓度的蔗糖环
境对于刺山柑细胞形同逆境 , 而 PO D 常作为植物在逆境条件
下酶促防御系统的关键酶【l2] ,故细胞内过氧化物酶活水平的提
高可以视为其对高浓度蔗糖环境的适应表现 。
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培养时间
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圈 3 刺山柑. 浮细胞的偏代谢动态曲线
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.2 7 . 浮培养过程中过权化物醉活性的变化
3 讨论
不同来源的组织 ,愈伤组织形成的迟早和形成可继代愈伤
组织的比率差异也较大 ,故选择适当的外植体对于愈伤组织细
胞的建立非常重要 。 本实验以叶 、茎和种子为外植体 ,分别考察
了消毒方式对外植体消毒效率的影响。 本研究表明 : 采用 7 0%
酒精配合适宜的升汞处理时间可有效的提高外植体的消毒效
率 ,但不同外植体对消毒时间的要求不完全一致 ,且以叶片作
为刺山柑愈伤组织诱导的外植体较合适 ,其最适升汞消毒时间
为 8~
。 我们还以刺山柑的叶片 、 茎段和种子为外植体 ,考察
了不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响 ,发现幼嫩叶片是诱
导愈伤组织适宜的培养材料 。 在多数植物组织培养中 ,离体细
胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力 , 为此需要
在培养介质中添加不同的外源激素 . 以诱导细胞的分裂 、分化
以及形态发生 。 不同激素种类和浓度对胚性愈伤组织增殖的影
响不同 。 在很多植物中 , 组织培养诱导脱分化都需要 2 , 今D , 双
子叶药用植物构祀只需要 .0 2m g几 的 2 , 4 一 D , 而人参细胞培养
中 2 , 4 一D 的使用浓度最高时可达 12 m叭 l3] 。 本实验对激素诱
导刺山柑愈伤组织的效果进行了具体研究 ,实验表明刺山柑在
产生愈伤组织过程中 ,激素的作用明显 。 通过对激素浓度配比
的研究 , 找到了愈伤组织诱导的适宜培养条件是 M S均 . 5
m目1 2 , 4 一 } 1
.
Om目t 6 一 B A , 蔗糖浓度 30 叭 , p H 为 .6 0 。而其适
宜继代的培养基为 1. s m创6L 一 B A 和 1 .0m叭 2 , 4 一 D 配合的 M S
培养基 ,蔗糖浓度 30 g/ L , p H 为 .6 0
细胞悬浮培养研究是进行药用植物细胞工业化生产的必
要基础 ,与固体培养相比 ,细胞悬浮培养具有细胞繁殖速度快 ,
培养规模大 ,细胞培养物性质状态均一等优势 ,是一种使愈伤
组织培养物高效倍增 ,并利于对代谢产物生成进行有效调控的
液体培养技术 。 研究表明 ,刺山柑悬浮培养细胞的生长过程也
呈现 “ S ”形生长曲线 ,周期为 30 天左右 ,与一般液体悬浮细胞
相比.l4 均 , 生长周期稍长 ,原因可能有以下两个方面 :一是由于
细胞生长周期的长短受到植物种类 、起始细胞密度以及营养成
分种类 、 配比等因素的影响 ,二是 目前液体悬浮继代次数尚有
限 , 细胞对于液体环境可能还处在适应调整阶段 ,通过延长继
代次数 , 可以逐渐缩短悬浮细胞的生长周期。 在植物细胞培养
中 ,糖作为细胞代谢过程中碳水化合物的最好来源 ,对细胞的
生长有较大的影响。 本研究表明 ,在细胞对数生长后期 ,蔗糖完
全转化为还原性糖 (葡萄糖 、果糖 )而被细胞利用 。 过氧化物酶
普遍存在于高等植物中 , 它不仅参与植物的呼吸 , 还参与植物
木质素与乙烯的合成 ,是一类与生长 、分化密切相关的酶lq[ 。 不
同蔗糖浓度处理实验表明 , 一定浓度的蔗糖可以使 OP D 的活
性增加 。 本研究为刺山柑的细胞大规模培养提供了一定的理论
基础 。
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