全 文 ：邓恩按的体细胞胚胎发生
R egi na R
.
T e
r i m g no ni 等
关键词 胚状体 ;森林树种 ;幼态外殖体 ;造纸业
摘要 迄今为止已有 3 个按树种报道过体细胞胚胎发生 。 本文报道第 4个按树种 , 即邓
恩按 (为巴西南部种植的两个主要种之一 ) 的体细胞胚胎诱导首次获得成功 。 诱导采用单一
苯已酸 ( 5 . 5 或 16 . 5拜M ) 或其与 2 , 4 一二氯苯氧乙酸 (4 . 5拜M ) 配合以 3 天大的种苗为材料
进行 。 不论是加人 or %椰乳 ( v/ V) 还是加人 151/ 水解酪蛋白的无生长素培养基均能诱导体
细胞胚胎的发生 。
缩写 : 2 , 4 - 】} 一 2 , 4一一二氯苯氧乙酸 , 5B— G田 1 11洲〕gr 等人发 明的 ( 196 8) 培养基 ;M S— Mu asr ih ge 及 sk go ( 19 62 ) 发明的培养基 ; N AA— 一蔡乙酸 ; B A— 节基腺漂吟 。鉴于全球森林保护区迅速减少 , 对于经选森林树种基因型快速繁殖方法的研制也就变得十
分重要 , 而通过体细胞胚胎发生途径制作人工种子显然是一种选择 。 首次报道体胚发生 的树种
是冬青属的一种 ( H u 等 , 197 1) , 之后许多报道观赏和特种作物以及果树体胚诱导的论文陆续发
表 。 在林业上 , 我们注意到针叶树体胚诱导的研究活跃 , 但双子叶树种在该方面却进展缓慢 。
就按树属植物而言 , 至少有 30 个种已建立了愈伤组织培养物 , 但从愈伤组织中成功诱导
植株再生的仅有 12 个种 。 以上离体繁殖技术大都包括芽增殖这一步骤 (挽 oR ux 等 , 19 91 ) 。
然而 , 就利用离体繁殖来的优良基因型进行重新造林而言 , 开发人工种子较之采用劳动密集
的芽繁殖更为可行 。 作为人工种子生产先决条件的体细胞胚胎发生仅在 3 个按树种 , 即柠檬
按 ( M u过 i曲anr 等
,
19 89 )
, 巨按 (跳 t 等 , 19 9 1 ) 和雷林 r 号校 ( o u yan g 等 , 19 5 1 ) 中有过
报道 。 本文中 , 我们报道 了第 4 个按树种 , 即邓恩按的体胚诱导 。
邓恩按是两个因其能抗巴西南方冬天常有的霜冻而被选作栽培之用的按树种中的一个 。
种植在巴西南部的邓恩按除了其抗霜冻性之外 , 还表现出非常理想的适于纸浆生产的速生及
低木质素和高纤维素含量特性 。
首先取邓恩按种子于加有少量浸润剂的0 . 12 % 次氯酸钠溶液中漂洗 巧 分钟然后用无菌水
冲洗 3 次以达到灭菌 目的 。 种子先在 ( M s C a/ 3) 2/ 培养基 (由氯化钙浓度降至 16/ , 并附加
2% ( V/ V) 蔗糖及 0 . 8 % ( V/ V) 琼脂的 l/ ZM S 培养基组成 ) 上进行发芽 , 然后转人诱导培养
基 。 除了另有说明的地方之外 , 培养条件均为温度 27 士 l℃ , 每天 光照 6 小 时 , 光强 度约
4 0脚 o F时 · s 。
我们的第一个试验是分析苗龄对胚胎发生潜力的影响 。 当种子发芽 1 , 2 , 3 , 5 及 1 天
( lT 一 5T ) 之后 , 将来 自每一 日期组的 or 粒种子分别转移到附加 16 . 5 拼NM从 , l群 l 水解酪蛋
白 , 2% 蔗糖及 0 . 8 %琼脂的 B5 诱导培养基上进行暗培养 。 35 天之后 , 从 lT 到 5T 中分别获
得 O , 1 , 2 , 3 和 1个愈伤组织 。 该阶段的愈伤组织一般为褐色 , 大多数会长 出根 。 在 3 天大
的小苗上诱导出的两个愈伤组织上均出现呈白色 、 致密状并有组织结构的胚胎发生区域 。 20
天之后 , 来自 5 天发芽处理的 3个愈伤组织中的 1 个上也出现呈微白色的胚胎发生 区 。 将这
些愈伤组织转入附加 or % ( v / V) 椰乳或 1酬 l水解酪蛋白的无生长素培养基中经光照下再次
培养之后 , 从其呈微白色的区域中可发育出体细胞胚胎 。 这些胚状体中的一部分会发育出呈
淡绿色的大子叶 , 其它的则保持在球状阶段 , 并在其顶端产生次生胚状体 。 结果表明 , 3 天
大的种子苗是诱导胚胎发生的最佳苗龄 。 就来 自 5 天大的种子苗的愈伤组织而言 , 其表达胚
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DOI : 10. 13987 /j . cnki . askj . 1999. 01. 009
胎发生潜力的培养时间需要更长一些 。
为试验两种常用生长素的联合效应 , 我们设计了第二个试验 。 种子于黑暗中发芽 3 天 ,
之后转移到含 2% 蔗糖 , 0 . 8 %琼脂 , 以及不同 N从 (0 . 5 , 5 . 5 , 16 . 5 , 27 . 5 和 5 拌M ) 和 2 , 4
一 D (0
,
0
.
45 及 4 . 5 “ M ) 组合的 (MS C盯 3 ) 2/ 培养基上进行培养 。 试验包括 5 x 3 共 巧个处
理 , 每处理 5 粒种子 。 于黑暗中培养 30 天之后 , 有 1 个处理产生 l 到 4 个愈伤组织 。 NA A /
2
,
4 一 D 比率为 1l/ O , l l/ 及 3 1/ 的处理其愈伤组织上出现呈白色的胚胎发生区 。 将产生该结
果的愈伤组织转移到激素水平降低或无激素的培养基上 , 经光照下培养 1 天之后 , 从无激素
培养基愈伤组织的白色区域上发育出胚状体 。 这些胚状体中有些仍呈 白色且其发育超过鱼雷
胚阶段 , 不过它们中的大多数含有花青贰并保持在球形胚及心形胚早期阶段 。
我们用邓恩按作试验材料所得到的结果与该领域较早时期发表的文章 , 如 Ou yan g 等人
( 198 1) 有关按树体细胞胚胎发生的第一篇论文相似 , 尽管当时他们只用 了栽培品种雷林 l 号
按一种材料 。 M u汕hd ~ 等人 自 1987 年初次报道胚胎发生现象之后 , 接着 ( 19 89) 又报道了柠檬按长期培养物中的高频体细胞胚胎发生 。 就在最近 , wa t 等人 ( 19 91 ) 还发表了巨按体
胚诱导的详细资料 。
在以上所有工作中 , 利用 的均是正在萌发的成熟种子或来自刚发芽小苗的组织 。 在 4 组
不同研究人员中 , Mu alr idh ~ 等 ( 19 8 7) 及我们是直接利用正在萌发 的种子
, 其相应的生理
年龄最幼 , 程序也最简单 。 我们发现 , 3 天大的种子苗最适于邓恩按的胚胎发生诱导 , 而 M u -
汕dh ~ 等人 ( 19 89 ) 发现 2 天大的小苗对于柠檬按来说更为理想 。 虽然其它两组研究人员是任意选择外殖体 , 如雷林 1号按采用的是已发芽的小苗 ( o uy an g 等 , 19 8 1 ) , 巨按采用 的是
已发芽小苗的离体切段 , 但我们认为 , 生理年龄更幼的小苗 (利用起来也更简单 ) 也可 以用
作外殖体 。 在木本植物中 , 较幼龄的外殖体似乎具有更高的再生能力 。
4 组研究人员均利用生长素 ( 5 . 5 一 27 . 5娜 NAA 或 4 . 5 一 9 拼M Z , 4 一 D ) 进行体胚诱导 ,
或者利用它使继代培养期间能保持这种潜力 。 为了改进培养物的质量 , 还利用了少量的细胞
分裂素 (如 2 . 3 一 4 . 6 拜M 激动素 ) 以及一些有机附加物 (如谷氨酞胺 、 水解酪蛋白及椰乳 ) 。
在所有 4 类按树中 , 无生长素培养基及生长素水平降低的培养基均能促进胚胎生长 。
所有 4 个按树种的诱导阶段均在暗中进行 , 不过 , O uy an g 等 ( 19 81 ) 在该阶段采用 的是
光培养 。 与 W a t 等人 ( 19 91 ) 一样 , 我们也是在光照下进行继代培养 。 然而 。 M u alr ihd a lan 等
人 〔19 89 ) 在将它们的培养物转移到 “ 再生培养基 ” (几 )R 中进行光培养以前 , 对其进行过
未披露过的暗培养达 5 次 (称为 “ 保持 ” 期 , 在几 M 培养基中 ) 。 不过 , 这有可能是一个报道
上的错误 , 因为他们把诱导培养及 B S M 阶段的胚胎和愈伤组织均描述为 “ 深红色 ” , 而大家
都知道红色素 , 花青贰只有在光下才能产生 。 胚状体中含有 主要呈深红色的花青贰是按树体
胚发生有别于许多其它植物种类的一个特征 , 我们在胚胎发生的早期阶段就曾观察到具红色
素的胚状体 。 M u alr ihd ~ 等 ( 19 8 7 ) 及 o u y an g 等 ( 198 1) 在其有关按树的工作也均强调了不同阶段大量的深红色胚状体 。
在异花授粉的按树中 , 利用组织培养来源的植株进行重新造林无疑可以增加其生物产量 。
据 hK us pe 等 ( 19 87 ) 报道 , 种植 34 个月之后 , 在 10 甘 细叶按及毛叶按的试验区中 , 组培来
源的植株其生物量比对照种子来源的分别高36 . 9 % 和 49 . 5 % , 就造纸工业而言 , 通过体细胞
胚胎发生进行按树人工种子的开发无疑有益于新造林工作 。 下一步的工作将是具有高度胚胎
发生能力的液体悬浮系统的建立及体胚包裹方法的探索 。
田郎 译自 《lP an r C山 , 肠 s s u e an d o 笔an e 沮ru er 》 4 5 : 129 一 13 2 , 19 9 6。 英文 。