全 文 ：收稿日期:2005 03 17
作者简介:邢婕(1980 ), 女(汉族),山西太原人 , 硕士研究生;赵春杰(1960 ), 男(汉族), 吉林农安人 ,教授 , 主要从
事药物分析研究 , Tel.024 23986299 , E mail zcjjljj@sina.com。
文章编号:1006 2858(2006)02 0093 04
RP HPLC法测定独活中蛇床子素和
异欧前胡素含量
邢　婕1 , 胡晓静1 , 赵春杰1 , 宋　敏2 , 李　玲3
(1.沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016;　2.大连市食品药品监督管理局 , 辽宁 大连 116002;
3.大连市第六人民医院 , 辽宁 大连 116001)
摘要:目的建立中药材独活中蛇床子素和异欧前胡素的RP HPLC 含量测定方法。方法加 6 倍量
体积的甲醇40 ℃水浴下提取 2 次 ,每次2 h , 采用 Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm , 5 μm),流动相
为甲醇 体积分数为 3%的乙酸水溶液(体积比为70∶30), 流速为1.0 m L·min-1 , 检测波长为 307
nm。结果 理论塔板数以蛇床子素和异欧前胡素计算均不低于24 000 , 两物质的色谱峰之间及与
相邻峰之间分离度均大于 1.5 , 对称因子均在 0.95 ～ 1.05 之间。蛇床子素和异欧前胡素的线性范
围分别为 29.9 ～ 180 mg·L-1和 1.51～ 18.1 mg·L -1 , 平均回收率为 104.3%和 100.0%。蛇床子
素和异欧前胡素的精密度和重复性实验结果分别为 0.16%和 0.85%、1.3%和 2.0%。稳定性试
验表明 , 样品溶液中 2 种成分在 24 h 内稳定性良好。结论 建立的方法灵敏 、准确 、重现性好 , 可用
于中药材独活的质量控制。
关键词:高效液相色谱法;独活;蛇床子素;异欧前胡素
中图分类号:R 917　　　文献标识码:A
　　独活为伞型科植物重齿毛当归(Angel ica
pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干
燥根[ 1] 。是祛风除湿 、通痹止痛的常见中药。以
往的文献在控制独活质量时[ 2～ 5] , 主要利用
HPLC法或气相色谱法测定独活中如蛇床子素
(osthole)、二氢欧山芹素(columbianadin)、二氢欧
山芹醇醋酸酯(columbianctim)等成分的含量 。异
欧前胡素(isomperatorin)也是独活中一种具有抗
炎镇痛作用的香豆素类成分 ,文献中尚无测定独
活中该成分的方法。独活生于阴湿山坡 、林下草
丛中或稀疏灌丛间。药材因产地分布 、性状差异而
形成不同的商品独活。浙独活的商品主产地为浙
江天目山等地;资丘独活主产区分布于湖北宜昌地
区的长阳 、五峰等县;四川达县地区和万县地区所
产的独活称为川独活 ,其中川独活用量较大[ 6] 。作
者用RP HPLC 法同时测定了 15个不同产地独活
药材中蛇床子素和异欧前胡素的含量 。
1　仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪(附在线脱气
机 、四元泵 、自动进样器 、柱温箱及紫外检测器 ,美
国Agilent公司),Thermo C18色谱柱(天津开发区
色谱有限公司)。
蛇床子素和异欧前胡素对照品(中国药品生
物制品检定所),甲醇(色谱纯 ,市售),重蒸馏水
(自制),其他试剂(分析纯 ,市售)。
独活药材 ,购自全国 15个药材公司 ,按自然
数 1 ～ 15编号 ,经沈阳药科大学孙启时教授鉴定 ,
为重齿毛当归(Angel ica pubescens Maxim.f.bis-
errata Shan et Yuan)。
2　方法与结果
2.1　样品溶液的制备
称取独活药材粉末约1.0 g ,精密称定 ,加 6
倍量体积的甲醇40 ℃水浴回流提取 2 次 ,每次
2 h ,合并提取液 ,减压回收甲醇 ,残渣用甲醇超声
溶解转移至 50 mL 量瓶中 ,用甲醇定容至刻度 ,
摇匀 ,经 0.45μm 微孔滤膜过滤 ,即得 。
2.2　色谱条件选择
色谱柱:Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm ,
5 μm);流动相:甲醇 体积分数为 3%的冰乙酸水
溶液(体积比为 70∶30);流速:1.0 mL·min-1;检
测波长:307 nm;柱温:35 ℃;进样量:20 μL。
2.3　系统适应性试验
将对照品溶液和供试品溶液分别进样20μL ,
第 23 卷 第 2 期
2 0 0 6 年 2 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.23 　No.2
Feb.2006 p.93
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2006.02.008
记录色谱图 ,对照品及样品色谱图见图 1。理论
塔板数以蛇床子素计算不低于24 000 ,以异欧前
胡素计算不低于27 000 ,两物质的色谱峰之间及
其与相邻峰之间分离度均大于 1.5 ,拖尾因子均
在 0.95 ～ 1.05之间 。
A—Standard solution;B—Radix Angelicae Pubescentis sample;1—Osthole;2— Isoimpera torin
Fig.1　Representative chromatogram
2.4　标准曲线的绘制
称取蛇床子素对照品约10 mg ,精密称定 ,置
25 mL量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,
作为蛇床子素对照品贮备液。精密吸取上述贮备
液0.75 、1.0 、1.5 、3.0 、4.5 置 10 mL 量瓶中 ,用
甲醇稀释至刻度 ,各取20 μL测定 。以蛇床子素
峰面积为纵坐标(Y),以蛇床子素质量浓度为横
坐标(ρ),进行线性回归 ,绘制标淮曲线 。结果表
明 ,蛇床子素质量浓度在 29.9 ～ 180.0 mg·L-1内
线性关系良好 ,回归方程为 Y =6.005×102ρ-
2.927×102 , r=0.999 9 。
称取异欧前胡素对照品约 3 mg ,精密称定 ,置
50 mL量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,作
为异欧前胡素对照品贮备液。精密吸取上述贮备
液0.25 、0.5 、1.0 、2.0、3.0 mL置 10 mL 量瓶中 ,用
甲醇稀释至刻度 ,各取 20μL 测定。以异欧前胡素
峰面积为纵坐标(Y),以异欧前胡素质量浓度为横
坐标(ρ),进行线性回归。结果表明 ,异欧前胡素质
量浓度在 1.51 ～ 18.1 mg·L-1内线性关系良好 ,回
归方程为 Y =7.998×102ρ-2.099 , r=1.000。
2.5　精密度与重复性试验
取 1号药材样品1.0 g ,精密称定 ,按“2.1”条
方法制备成供试液 , 按“ 2.2”条方法重复进样 6
次 ,计算得蛇床子素和异欧前胡素峰面积的相对
标准偏差分别为 0.16%和 0.85%。
取 5号药材样品 6 份 ,每份1.0 g ,精密称定 ,
按“2.1”条方法制备成供试液 ,按“2.2”条方法分
别进样 ,测得蛇床子素和异欧前胡素峰面积相对
标准偏差分别为 1.3%和 2.0%。
2.6　样品溶液稳定性试验
取12号药材样品1.0 g ,精密称定 ,按“2.1”
条方法制备成供试液 ,放置 0 、2 、4 、8 、12 、24 h后 ,
按“2.2”条方法进样 。结果表明 ,样品溶液在24 h
内稳定性良好 ,蛇床子素和异欧前胡素峰面积的
相对标准偏差分别为 0.48%和 0.64%。
2.7　加样回收率试验
精密称取 6份已知含量独活药材(11号药材
样品)粉末0.5 g ,分别加入一定量的蛇床子素和
异欧前胡素对照品溶液 ,按“2.1”条方法制备成供
试品溶液 ,按“2.2”条方法进样 。蛇床子素和异欧
前胡素的回收率分别为 104.3%和 100.0%, RSD
分别为 1.4%和 1.8%。测定结果见表 1。
Table 1　Recovery of the HPLC determination of osthole and isoimperatorin
Osthole
m added/
mg
mknown/
mg
m founded/
mg
Recovery/
%
Isoimperatorin
m added/
mg
m known/
mg
m founded/
mg
Recovery/
%
1.50 2.87 4.47 106.7 51.0 94.8 144.9 98.2
1.50 2.87 4.40 102.0 51.0 94.8 144.3 97.0
3.00 2.87 5.99 104.0 102.0 94.8 198.5 101.7
3.00 2.87 5.98 103.7 102.0 94.8 198.2 101.4
4.50 2.87 7.60 105.1 153.0 94.8 248.1 100.2
4.50 2.87 7.58 104.6 153.0 94.8 248.0 100.1
94 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 23卷
2.8　样品测定
称取各编号下独活药材粉末约1.0 g ,精密称
定 ,按“2.1”条方法制备成供试液 ,按“2.2”条方法
进样 。测定结果见表 2。
Table 2　Contents of osthole and isoimperatorin in Radix Angelicae Pubescentis samples
Sample
No.
Origins w(osthole)/% w(isoimperato rin)
/ %
Sample
No.
Origins w(osthole)/ % w(isoimperatorin)
/%
1 Hangzhou 0.518 0.017 9 Sichuan 0.611 0.011
2 Lanzhou 0.227 0.089 10 Inner Mongolia 0.370 nd
3 He nan 0.667 0.010 11 Hebei 0.561 0.018
4 Xi an 0.434 0.022 12 Shenyang 0.603 0.019
5 Wuchang 0.172 0.059 13 Shandong nd 0.010
6 Guangluo 0.614 0.011 14 Taiyuan 0.752 0.011
7 Shang luo 0.456 0.020 15 Changsha 0.719 0.013
8 Ningxia 0.612 0.042
　　nd—not detected
3　讨论
a.检测波长。蛇床子素和异欧前胡素分别
在 330 nm 和 307 nm 处有最大吸收 ,但独活中蛇
床子素的含量较异欧前胡素高得多 ,所以选择在
307 nm 处测定。
b.提取溶剂。考虑到蛇床子素和异欧前胡
素的溶解性 ,实验中曾以甲醇和乙醇作为提取溶
剂。结果用甲醇和乙醇提取时 ,蛇床子素含量相
差无几 ,而用甲醇提取异欧前胡素比用乙醇提取
含量明显提高 ,因为独活中蛇床子素含量远大于
异欧前胡素 ,所以选择甲醇作为提取溶剂。
c.提取方法 。在选择加热回流作为提取方法
的基础上 ,采用正交实验表 L9(3)4 安排实验 ,对
甲醇回流提取工艺进行优选 ,主要考察提取温度 、
提取时间 、提取次数和溶剂用量 4个因素 。结果
表明 , 6 倍量体积的甲醇 、40 ℃水浴 、回流提取
2次 、每次 2 h 为最佳方法。
d.流动相 pH 值 。经反复实验 ,确定本实验
流动相系统为甲醇 体积分数为 3%的冰乙酸水
溶液(体积比为 70∶30),pH 为 5.0 ,在该系统下峰
形满足分析要求 。
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Determination of osthole and isoimperatorin in A-
negelica pubescens Maxim.f.biserrate Shan et Yuan
by RP-HPLC
XING Jie
1 , HU Xiao-jing1 , ZHAO Chun-jie1 ,SONG Min2 , LI Ling3
(1.School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang 　110016 , China;　2.
Dalian Food and Drug Administration , Dalian　116002 , China;　3.Dalian 6th People s Hospi tal ,
Dalian　116001 , China)
95第 2 期 邢　婕等:RP-HPLC 法测定独活中蛇床子素和异欧前胡素含量　　　
Abstract:Objective To establish a reversed-phase HPLC method fo r determination of osthole and isoimper-
atorin in Angelica pubescens.Methods The sample w as separated on a Thermo C18 column(250 mm ×
4.6 mm , 5 μm)using methanol-3% acetic acid solution(V∶V=70∶30)as the mobile phase at a f low rate
of 1.0 mL·min-1.The detection was set at 307 nm.Results The calibration curve w as linear in the range
of 29.9-180.0 mg·L-1(r =0.999 9)for osthole and 1.51-18.1 mg·L-1 for isoimperatorin(r =1.000).
The inner-day RSD was 0.16% and 0.85%, and the average w as 104.3% and 100.0% for osthole and
isoimperatorin , respectively.It w as stable w ithin 24 hours.Conclusions This method is accurate , simple and
sensitive , and it can be used for the quali ty cont rol of Angel ica pubescens.
Key words:HPLC;Radix Angelicae Pubescentis;osthole;isoimperatorin
(上接第 90页)
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Chemical constituents from leaves of Crataegus pin-
natif ida Bge.
SONG Shao-jiang , CHEN Jia , KOU Xiang , SONG Yong-hua , XU Sui-xu
(School of Tradit ional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceutical Universi ty , Shenyang 　
110016 , China)
Abstract:Objective To study the chemical constituents of the ex tract f rom the leaves of Crataegus pinnat-
i f ida Bge.Methods The ext ract f rom the leaves of Crataegus pinnati f ida Bge.were eluted by water and
different concentrat ion of alcohol on the D101 macroporous resin.The 55% alcohol-water portion w as col-
lected and chemical constituents w ere isolated by silica gel column chromatog raphy and preparat ive HPLC.
Physical-chemical characters and spectroscopic analy sis were employed fo r the structural identification.Re-
sults Compound 1-5 were obtained and their structures w ere elucidated as 2α, 3 β , 19α-t rihydroxyl ursolic
acid(1),ursolic acid(2), vi texin(3), 2′-O-rhamnosyl vi texin(4), kaempferol(5).Conclusions 2α, 3β ,19α-
trihydro xyl ursolic acid(1)is isolated f rom Crataegus pinnati f ida Bge.for the first time.The part data of
13C-NMR of compound 1 in the literature were corrected by the 2D-NMR spect roscopic methods.
Key words:st ructure identification;NMR;Crataegus pinnati f ida Bge.;triterpenet riterpene
96 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 23卷