全 文 ：2011年　第 6卷
第 3期 , 261-264
生 态 毒 理 学 报
AsianJournalofEcotoxicology Vol.6, 2011No.3, 261-264
　　收稿日期:2010-11-02　　录用日期:2011-04-28
　　基金项目:山东省卫生厅青年科学基金(090001)
　　作者简介:郎晓辉(1971-)女 ,硕士研究生,研究方向:应用营养学 , E-mail:zzx suny@163.com;＊通讯作者(Corespondingauthor), E-mail:
zhongjy03@yahoo.com.cn
明日叶查尔酮对小鼠 H22肝癌细胞增殖活性的抑制作用
郎晓辉 1, 2 , 钟进义 1, ＊ , 李蕾1 , 孟扬1 , 孙赫 1
1.青岛大学医学院公共卫生学系 , 青岛 266021
2.山东省烟台护士学校 , 烟台 264000
摘要:为研究明日叶查尔酮(AC)对小鼠H22肝癌细胞增殖的抑制作用 ,采用如下方法进行实验:1)将 50只荷 H22肝癌小鼠随机
分为 5组, 每组 10只。低 、中 、高剂量组每日分别灌胃给予 5、20和 40 mg·kg-1明日叶查尔酮 ,肿瘤对照组给予生理盐水, 环磷酰
胺(CTX)组隔天腹腔注射 20 mg·kg-1的 CTX。饲养 10 d后处死小鼠 ,测定瘤重 、体重和抑瘤率 ,取瘤组织用免疫组化法检测肿瘤
细胞 PCNA和 Caspase-3蛋白的表达。 2)将不同浓度 AC与小鼠 H22肝癌细胞共同培养, 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定肝癌细
胞增殖活性。结果为:1)肿瘤对照组的瘤重 、PCNA和 Caspase-3的阳性表达率分别为(0.55±0.23)g、72.77%和 5%,高剂量组则
分别为(0.31±0.05)g、28.33%和 38.52%。 2)肿瘤对照组和高剂量组的细胞增殖活性分别为 1.135±0.032和 0.716±0.028。
两组间各项差别均有显著性意义(p<0.05)。从以上数据可以得出结论:明日叶查尔酮对小鼠 H22肝癌细胞的增殖有抑制作用。
关键词:明日叶查尔酮;肝癌;Caspase-3;PCNA
文章编号:1673-5897(2011)6-261-04　　中图分类号:X171.5　　文献标识码:A
InhibitiveEfectofChalconeofAngelicaKeiskeionProliferationofMice
Hepatocarcinoma22 Cels
LangXiaohui1, 2 , ZhongJinyi1, ＊ , LiLei1 , MengYang1 , SunHe1
1.MedicalCollegeofQingdaoUniversity, Qingdao266021, China
2.YantaiNurseSchoolofShandongProvince, Yantai264000, China
Received2 November2010　　accepted28 April2011
Abstract:ToinvestigatetheinhibitiveefectofchalconeofAngelicakeiskei(AC)ontheproliferationofmicehep-
atocarcinomacels, thefolowingmethodswereused:1)Fiftymiceinoculatedhepatocarcinoma22 celsweredivid-
edintofivegroupswhichwas10 miceinpergroup.5, 20 and40 mg·kg-1 ACweregivendailytolow, medium
andhighdosegroupsbymouth.Thetumorcontrolgroupwasgivensaline.20 mg·kg-1 cytoxan(CTX)wasgiven
totheCTXgroupbyinjectioneveryotherday.After10 days, almiceweresacrificed.Tumorweight, bodyweight
andrateoftumorinhibitionweredetermined.TheexpressionlevelsofPCNAandCaspase-3 weremeasuredwithim-
munohistochemistrymethod.2)Micehepatocarcinoma22 celswereculturedwithdiferentconcentrationsof
AC.MTTassywasusedtodeterminetheproliferativeactivityofhepatocarcinomacels.Theresultswereas
folows:1)Thetumorweight, exprssionlevelofPCNAandCaspase-3 ofthetumorcontrolgroupwere(0.
55 ±0.23)g, 72.77% and5%, respectively.Thoseofhigh-doseACgroupwere(0.31 ±0.05)g,
28.3 3% and38.52%, respectively.2)Thecelproliferationactivityoftumorcontrolgroupandhigh-dose
groupwere1.135 ±0.032 and0.711 ±0.028 , respectively.Althediferencesbetweentwogroupswere
significant(p<0.05).TheconclusionofthisstudyisthatACcaninhibittheproliferativeactivityofmice
262　 生 态 毒 理 学 报 第 6卷
hepatocarcinoma22 cels.
Keywords:Ashitabachalcone;hepatocarcinoma;Caspase-3;PCNA
　　明日叶(Ashitaba)是一种原产于日本八丈诸岛
的芹科植物 [ 1] ,岛民多食用明日叶均很长寿 ,故又名
长寿草。据报道 , 明日叶的主要功效成分查尔酮
(chalcone)具有提高机体免疫力 、润肠通便 、抗肿瘤
和抗氧化等显著功效[ 2-5] 。邓良利等对明日叶的毒
性及其致突变和致畸性进行了研究 ,结果显示明日
叶的急性毒性为实际无毒级 ,致突变试验阴性 ,传统
致畸试验中未见发育毒性 [ 6] 。国外对于明日叶的研
究较多 ,大量学者研究证实明日叶是一种药食两用
的保健食品 ,可杀死白血病细胞 ,治疗糖尿病并具有
消炎杀菌的作用。由此可见 ,明日叶是一种绿色无
毒健康的植物 ,发展前景广阔 ,具有深远的研究价
值 。细胞增殖与凋亡的失衡是肿瘤发生发展的基
础 ,细胞的过度增生而凋亡的减少是肿瘤生长的主
要因素 [ 7] 。目前尚未见有关于明日叶查尔酮对肿瘤
细胞增殖与凋亡影响的研究报道 。本实验通过给荷
H22肝癌瘤小鼠喂饲不同剂量的明日叶查尔酮
(Ashitabachalcone, AC)和将 H22肝癌细胞与 AC
共同培养的方法 ,检测肿瘤重量 、细胞 Caspase-3和
PCNA表达和肿瘤细胞增殖活性等指标 ,探讨了 AC
对 H22肝癌细胞的抑制作用。
1　材料与方法(Materialsandmethods)
1.1　主要材料
1.1.1　实验动物
　　H22肝癌荷瘤种鼠由山东省实验动物中心提
供 。清洁级健康昆明种小鼠 50只(雌雄各半),由山
东鲁抗医药实验中心提供 , 6 -8周龄 ,体重 18 -20
g。小鼠实验前于本实验室适应性喂养 7 d。
1.1.2　实验样品
　　明日叶查尔酮由本实验室制备 ,经紫外分光光
度法测定其纯度 >90%。查尔酮标准品购于美国
Sigma公司 。
1.1.3　试剂与仪器
　　RPM1640培养基 、胎牛血清和四甲基偶氮唑蓝
(MTT)(美国 GIBCO公司);环磷酰胺 (10013021)
(江苏恒瑞医药股份有限公司);PCNA、Caspase-3一
抗 、二抗和即用型 SABC免疫组化试剂盒(武汉博士
德生物工程有限公司);5%CO2培养箱(日本三洋电
器有限公司);TDL-5离心机 (上海安亭科学仪器
厂);酶标仪(瑞典产 RosysAnthos双波长 2010型);
倒置显微镜(日本产 OlympusXDS-1B型)。
1.2　实验方法
1.2.1　动物实验
1.2.1.1　肿瘤接种　无菌抽取 H22肝癌小鼠腹水 ,
镜下调节肿瘤细胞密度至 1 ×107 mL-1 ,制成细胞悬
液于小鼠右前肢腋窝处皮下接种 ,每只 0.2 mL。
1.2.1.2　动物分组与处理　肿瘤细胞接种后次日 ,
将 50只小鼠随机分为肿瘤对照组 、环磷酰胺组和
低 、中 、高 3个明日叶查尔酮剂量组 ,每组 10只 ,雌
雄各半 。 3个 AC剂量组分别经口灌胃给予明日叶
查尔酮 5、20和 40 mg·kg-1 ,连续 10 d。肿瘤对照组
同样方法给予生理盐水 ,环磷酰胺组隔日腹腔注射
CTX(20 mg·kg-1)1次。于第 11天颈椎脱臼处死
全部小鼠 ,取瘤组织待检。
1.2.1.3　瘤重 、体重和瘤体比　采用电子动物天平
测量动物的瘤重和体重 ,计算瘤重 /体重的比值 。
1.2.1.4　瘤细胞 Caspase-3和 PCNA蛋白表达　采
用 SABC免疫组化法 ,按检测试剂盒说明检测 。将
瘤组织经 4%多聚甲醛固定 ,石蜡包埋切片 , 3%H2
O2消除内源性过氧化物酶 ,微波修复抗原 。按 1:50
浓度滴加一抗 , 4℃过夜 , 滴加二抗 , DAB显色 , 脱
水 ,透明和封片 。显微镜下观察 PCNA和 Caspase-3
蛋白的表达水平。每只动物观察 500个细胞 ,记录
其中有阳性表达的细胞数。阳性表达率 =(阳性细
胞数 /计数细胞总数)×100%
1.3　体外瘤细胞增殖活性测定
　　取 H22小鼠肝癌组织剪碎研磨 ,经过滤和离心
后制成瘤细胞悬液 。调节细胞密度为 1 ×106 mL-1 ,
接种于 96孔培养板 ,每孔 100 μL。高 、中和低剂量
组的 AC终浓度依次为 5、25和 50 mg·L-1 ,肿瘤对
照组只加等体积缓冲液 , CTX组加入 CTX20 mg·
L-1。置于 5%CO2培养箱中 37℃培养 16 h,用 MTT
法测定各孔吸光度 。各组肿瘤细胞增殖活性用平均
吸光度(A值)表示 ,并按公式:抑制率 =(肿瘤对照
组 A值 -实验组 A值)/肿瘤对照组 A值 ×100%计
算各 AC组对小鼠肝癌细胞增殖活性的抑制率。
1.4　统计分析
　　采用 SPSS17.0统计软件 ,计数资料做 x2检验 ,
计量资料做单因素方差分析 。
第 3期 郎晓辉等:明日叶查尔酮对小鼠 H22肝癌细胞增殖活性的抑制作用 263　
2　结果(Results)
2.1　瘤重 、体重和瘤体比
　　正常对照组未见肿瘤发生。肿瘤对照组及高剂量
组的平均瘤重分别为(0.55 ±0.23)g和(0.31 ±0.05)
g,差异具有统计学意义(p<0.05)。其他各组结果见表
1。
表 1　各组小鼠的肿瘤体重抑制率
Table1　Tumorinhibitionrateofmiceineachgroup
分组 瘤重 /g 体重 /g 瘤重 /体重 /%抑瘤率 /%
正常对照 - 29.91 ±1.551)
肿瘤对照 0.55 ±0.23 26.41±1.50 2.08 -
低剂量组 0.50 ±0.07 26.51±1.16 1.71 9.09
中剂量组 0.46 ±0.041)2)27.75±1.17 1.66 16.36
高剂量组 0.31 ±0.051)29.22 ±1.401) 1.17 43.64
环磷酰胺 0.29 ±0.031)23.45 ±0.921) 1.24 47.27
注:1)表示与肿瘤对照组比较 , p<0.05;2)表示与高、低剂量组比较, p<0.
05。
2.2　Caspase-3和 PCNA蛋白表达
　　Caspase-3阳性表达细胞的胞浆中出现棕黄色
或褐色颗粒 。本实验肿瘤对照组阳性表达的细胞数
少且颜色浅淡 ,呈弱表达(图 1A)。 AC高剂量组
Caspase-3阳性表达细胞数多且颜色较深 ,呈强表达
(图 1B)。两组阳性细胞表达率分别为 5%和
38.52%,差异具有显著性(p<0.05)。PCNA为胞
核表达 ,呈棕黄色或褐色颗粒。本实验肿瘤对照组
PCNA阳性表达的细胞多 ,染色深(图 2A)。 AC高剂
图 1　肿瘤对照组和高剂量组Caspase-3蛋白表达(DAB×400)
Fig.1　ExpressionofCaspase-3 proteinintumor
controlgroupandhigh-dosegroup
图 2　肿瘤对照组与高剂量组 PCNA蛋白表达(DAB×400)
Fig.2　ExpressionofPCNAproteinintumor
controlgroupandhigh-dosegroup
量组较肿瘤对照组的阳性表达细胞数少 ,染色浅
(图 2B)。两组阳性细胞表达率分别为 26.11%和
35.76%, 差异具有显著性 (p<0.05)。 各组
Caspase-3及 PCNA表达结果见表 2。
表 2　各组瘤细胞 Caspase-3和 PCNA的表达
Table2　ExpresionofCaspase-3 andPCNA
proteinofoncocyteineachgroup
组别 观察细胞数
Caspase-3 PCNA
阳性
细胞数
阳性
表达率 /%
阳性
细胞数
阳性
表达率 /%
环磷酰胺组 5 000 2 053 41.061) 1 306 26.111)
高剂量组 5 000 1 926 38.521) 1 417 28.331)
中剂量组 5 000 836 16.721)2) 2 168 43.351)2)
低剂量组 5 000 289 5.78 3 610 72.04
肿瘤对照组 5 000 250 5.00 3 637 72.77
注:1)与肿瘤对照组相比较 , p<0.05;2)与高 、低剂量组比较 p<0.05。
2.3　肿瘤细胞增殖活性
　　高 、中剂量 AC组肿瘤细胞增殖活性分别为 0.716
±0.028和 0.834 ±0.027,均较肿瘤对照组显著性降
低(p<0.05)。各组细胞增殖活性测定结果见表 3。
表 3　各组小鼠癌细胞增殖活性( x±s)
Table3　Proliferationactivitylevelsofoncocyteineachgroup
组别 吸光度 A值 抑制率 /%
环磷酰胺组 0.679 ±0.0461) 40.18
高剂量组 0.716 ±0.0281) 36.92
中剂量组 0.834 ±0.0271)2) 26.52
低剂量组 1.106 ±0.0382) 2.56
肿瘤对照组 1.135±0.032 -
注:1)表示与肿瘤对照组相比较 , p<0.05;2)表示与高 、低剂量组比
较 p<0.05。
3　讨论(Discussion)
　　明日叶查尔酮属黄酮类化合物 ,是明日叶的主
要功效成分 ,其化学结构为 1, 3-二苯基丙烯酮 ,是植
物体内合成黄酮的前体 ,以它为母体的天然化合物
广泛存在于植物界中 。有研究证明 ,从甘草中提取
的查尔酮具有抗肿瘤和抗氧化等功效 [ 8-10] ,因此本
实验探讨了从明日叶中提取的查尔酮对小鼠 H22
肝癌细胞增殖的抑制作用 ,为明日叶在癌症治疗方
面的应用提供理论依据 。
　　Caspase全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋
白水解酶 ,是一组存在于细胞质中具有类似结构的
蛋白酶 。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基 ,能
够特异性地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键 ,从
而造成细胞凋亡。 Caspase-3是 Caspase家族中重要
的公共凋亡效应因子 ,其活化在细胞凋亡信号转导
过程中起核心作用 ,是细胞凋亡过程中激活的关键
264　 生 态 毒 理 学 报 第 6卷
蛋白激酶和主要效应因子[ 11] 。大多数触发细胞凋
亡的因素 ,均需通过 Caspase-3介导的信号传导途径
导致细胞凋亡 [ 12] 。当 Caspase-3表达增多时 ,细胞
凋亡加速。本实验结果显示 ,高 、中剂量 AC组瘤细
胞 Caspase-3的阳性表达率高于肿瘤对照组 ,这说明
AC具有引发肿瘤细胞 Caspase-3蛋白表达 ,促进瘤
细胞凋亡的作用 。该结果与文献中报道的查尔酮具
有抗肿瘤作用的结论一致 [ 8] 。
　　增殖细胞核抗原 (PCNA)是 DNA多聚酶 delta
的辅助蛋白 ,其合成 、表达与细胞的增殖密切相关 ,
是反映细胞增殖水平的重要指标 [ 13] 。当细胞的增
殖活性升高时 , PCNA表达增强 , PCNA增殖指数升
高 , PCNA表达减弱 , PCNA增殖指数降低 ,表示细胞
增殖活性降低[ 14] 。本实验结果显示 ,高 、中剂量查
尔酮组 PCNA蛋白阳性表达率较肿瘤对照组显著降
低 ,且高剂量组低于中剂量组 ,这表明查尔酮具有抑
制肿瘤细胞增殖的作用。
　　细胞增殖活性是反映细胞生理状态的基础性指
标 [ 15] 。MTT法是检测细胞增殖活性最常用的方法 ,
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原
外源性 MTT为水不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒
(Formazan)并沉积在细胞中 ,结晶生成量与细胞的
代谢活性密切相关[ 16-17] 。当细胞受损或死亡时 ,该
反应降低或消失 ,说明细胞增殖活性下降 。本实验
结果显示 ,中 、高剂量 AC组肿瘤细胞增殖活性明显
低于肿瘤对照组 ,这说明 AC对 H22肝癌细胞增殖
有一定抑制作用。本项结果也与上述 Caspase-3和
PCNA的测定结果吻合。
　　综合本次实验结果可以认为 ,明日叶查耳酮能
降低小鼠 H22肝癌细胞的增殖活性和 PCNA蛋白表
达水平 ,使 Casepase-3蛋白表达增强 ,对小鼠 H22肝
癌细胞增殖活性具有一定抑制作用。
通讯作者简介:钟进义(1951— ), 男 ,青岛大学医学院公共卫
生学系教授 , 博士生导师 , 主要从事营养与食品卫生学和毒
理学研究。 Tel:0532-83812450。
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