全 文 ：收稿日期:2005-10-17
基金项目:广东省科技计划项目(2002A2070402),湛江师范学院科研项目(L0416)。
作者简介:马生健(1977—),男 ,硕士生 ,讲师 , 主要研究方向:植物基因工程。
第 23 卷　第 1期
2006 年 6 月
桉树科技
EUCALYPT SCIENCE &TECHNOLOGY
Vol.23 No.1
Jun.2006
尾叶桉的组织培养及植株再生
马生健 , 潘清梅＊ , 吴志华 , 曾富华
(湛江师范学院生物系 ,广东湛江 , 524048)
摘　要:研究了以尾叶桉(Eucalyptus urophylla)优树(U6 无性系)无菌苗的叶子和茎段作为外植体诱导愈伤组织 、丛
生芽发生以及植株再生的过程。通过多种生长调节剂不同浓度组合的对比试验 , 确定了 U6 快繁体系的最适宜培
养条件:(1)愈伤组织诱导培养基:MS+1-2 mg L 2 , 4-D;(2)芽增殖培养基:MS+0.5 mg L 6-BA;(3)生根培
养基:1 2 MS+2.0 mg LNAA。
关键词:尾叶桉;组织培养;植株再生
Tissue Culture and Plantlet Regeneration
of Eucalyptus urophylla
MA Sheng_jian , PAN Qing_mei ,WU Zhi_hua , ZENG Fu_hua
(1.Department of Biology , Zhanjiang Normal College , Zhanjiang , Guangdong 524048;
2.China Eucalypt Research Centre , Zhanjiang Guangdong 524022)
Abstract:Callus induction , shoot organogenesis and plantlet regeneration from leaf and sprout explants of E .
urophylla s asepsis seedling were studied in the paper.The optimal culture conditions were established by the
comparative experiments of different concentration combinations of many growth regulators as follows:(1)cal-
lus induction media:MS+1-2mg L 2 ,4-D;(2)shoot multiplication culture medium:MS+0.5mg L 6-
BA;(3)rooting culture medium:1 2 MS+2.0mg L NAA.
Keywords:Eucalyptus urophylla;tissue culture;plantlet regeneration
　　桉树是世界上主要产材树种之一 ,其人工造林
已占世界人工造林的五分之一 。桉树组织培养是林
木组织培养研究最早 、最多的一大类 ,目前全世界已
对60种桉树进行了组织培养技术的研究[ 1] 。早在
1965年 , Sussex 即由赤桉实生苗外植体获得过愈伤
组织。此后不少国内外学者先后利用桉树木质块
茎 、节间 、下胚轴 、叶 、成年桉树嫩枝段等不同器官组
织培养诱导完整植株成功[ 2] 。
尾叶桉(Eucalyptus urophylla)原产于印尼 ,我国
自1976年开始引种 。由于具有速生丰产 ,木材易漂
白且得浆率高等特性 ,尾叶桉在我国的栽培面积迅
速扩大 ,目前在两广和海南省的种植面积已达十几
万 hm2 。U6 无性系是在尾叶桉实生林中选育出的一
个优良无性系 ,其树干圆满通直 、林相整齐 ,抗逆性
强及速生丰产 ,已成为我国桉树人工林的主要当家
树种。由于桉属树种多 ,种间极易杂交 ,后代分化严
重 ,用有性繁殖方法很难保持优树特性 。扦插繁殖
法虽然能解决这个问题 ,但是由于扦插母苗缺乏 ,使
得生产规模受到限制 。因此 ,生产上迫切需要大量
组培苗作母苗 ,以便取材扦插 ,培养扦插苗 ,供应大
田种植。本试验以 U6 的继代培养芽为材料 ,对 U6
无性系的组织培养进行了研究 ,为其快速繁殖技术
DOI :10.13987/j.cnki.askj.2006.01.004
提供了一定的实验依据。
1　试验材料与试验方法
1.1　试验材料
国家林业局桉树研究开发中心提供的尾叶桉
U6 无性系继代培养的芽。
1.2　试验方法
1.2.1　愈伤组织的诱导
当无菌芽长壮后 ,以叶 、幼茎及带芽茎段作为外
植体 ,接种于用 MS作为基础培养基 ,分别附加了 2 ,
4-D 1.0 、2.0 、4.0 、6.0 mg L 配制成的 4 类培养基
上 ,以探讨 2 ,4-D对愈伤组织形成的影响 。所有培
养基中均附加 3%蔗糖 、0.3%Phytagel和 5 mg L 的
抗坏血酸 ,pH 5.8-6.0 (下同),培养温度为 25±
2℃,置于暗处培养。
1.2.2　芽的诱导
当芽长到 1 cm 左右 ,切取带腋芽茎段诱导分化
丛生芽 。以 MS 为基础培养基 ,接种在分别添加不
同浓度的 6-BA 、ZT 、TDZ 的培养基上 ,以探讨不同
细胞分裂素及浓度对丛生芽诱导的影响 。
1.1.3　生根培养
当丛生苗长到 2-3 cm 高时 ,切断移入生根培
养基内培养。生根培养基采用 1 2MS 为基础培养
基 ,并附加不同组合的 NAA 、IAA 、6-BA等 。接种后
先放在暗处培养 6-8 d 后再转入自然光照下培养 ,
培养 25d后观察 。
1.1.4　幼苗移栽
当幼苗长到 3-5 cm高 ,根系生长良好 ,苗木已
木质化 ,生长健壮时可移栽 ,先炼苗后再移栽。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导
所有外植体在诱导培养基上暗培养 5-7d后 ,
在其切口部位长出淡黄色的松散型的愈伤组织 。随
着培养时间的延长 ,叶 、带腋芽茎段诱导出的愈伤组
织多为结构致密 、质地脆硬 、颗粒状 、色泽浅黄 ,生长
较快;茎段诱导的愈伤组织多为结构较为疏松 、质
地水浸状 、色泽为半透明或浅黄色 ,生长较慢 (见表
1)。
表 1　不同浓度 2 , 4-D对不同外植体愈伤组织诱导的影响
外植体
类型
2 , 4-D
浓度 (mg L)
外植体数
(个)
愈伤组织
诱导率(%)
愈伤组织形成
最早时间 d 愈伤组织生长情况
叶 1.0 13 100 5 快速生长 , 干燥 ,愈伤组织多且好。
2.0 14 100 5 快速生长 , 干燥 ,愈伤组织较多。
4.0 13 92.3 7 缓慢生长 , 愈伤组织少。
6.0 15 80 7 缓慢生长 , 愈伤组织极少。
茎 1.0 14 100 5 快速生长 , 水浸状 ,长势好。
2.0 18 100 5 较快生长 , 长势一般。
4.0 18 72.2 6 缓慢生长 , 水浸状 ,长势差。
6.0 16 25 6 缓慢生长 , 愈伤组织极少
带腋芽 1.0 23 100 5 快速生长 , 长势好。
茎段 2.0 16 100 6 较快生长 , 长势好。
4.0 18 100 7 较快生长 , 愈伤组织少
6.0 16 100 7 缓慢生长 , 愈伤组织少。
　　从表 1 可看出 , 以叶和茎为外植体的 , 随着
2 ,4-D浓度的增高 ,愈伤组织形成的时间变长 ,诱导
率逐渐降低 ,形成愈伤组织的数量 、质量也下降;而
以带腋芽茎段为外植体的 ,在不同浓度下的诱导率
均为 100%,但愈伤组织的生长速度随着 2 , 4-D浓
度的升高而变缓慢 ,长势逐渐变差。试验结果表明:
12 桉 树 科 技　 　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷
选用带腋芽茎段作为外植体 ,诱导率比较高 (见图
版 I-1)。不同的外植体诱导愈伤组织的 2 ,4-D浓
度均以1-2 mg L 为宜 ,高浓度则产生抑制作用 。
2.2　芽的诱导
不同细胞分裂素对尾叶桉芽的影响结果见表
2 ,从表 2可以看出 ,6-BA 、ZT 、TDZ 三种细胞分裂素
均有促进外植体腋芽萌发的作用 。总而言之 ,添加
ZT的培养基中腋芽萌发时间短 ,新芽生长快 ,生长
旺盛;添加6-BA的培养基中分化的芽数量多 ,增
殖系数大 , 芽的长势良好 , 但不及添加 ZT 的好。
TDZ虽然也能使芽分化 ,但效果很差 ,随着时间的推
移 ,大部分的芽停止生长 ,基部膨大形成愈伤组织
(见图版 I-2)。总体来看 , 6-BA 的基本效应是显
著促进腋芽的分化和形成 ,这与其他桉树该方面的
研究结果是一致的[ 3] ;玉米素的基本效应是促进腋
芽分化 、显著促进茎的伸长(见图版 I-3);TDZ 的
基本效应则是促进愈伤组织的生成及芽的增殖[ 4] 。
不同浓度的 6-BA对萌芽率及芽的增殖系数影
响较大 。随着6-BA浓度升高 ,腋芽的萌发率降低 ,
新芽生长减慢 ,芽的增殖系数降低。当 6-BA 浓度
达到 2.0 mg L 时 ,外植体出现枯死现象 ,浓度升至
3.0 mg L 时 ,外植体枯死率达 45%,且抽生的芽短
小 。因此 ,在培养初期 ,较高的6-BA浓度不利于从
芽的诱导 ,芽容易枯死 ,同时 ,较高浓度的 6-BA 会
导致一些不正常的生长现象出现:丛生芽虽然能分
化伸长 ,但小苗表现为叶片变小 ,匍匐状;少数叶片
长出颗粒状愈伤组织。在本实验中 , 6-BA 为0.5
mg L时 ,芽的萌发率 、增殖系数及生长状况均达到
较高水平。初步认为 ,较低浓度的 6-BA (见图版 I
-4)有利于 U6的芽诱导。
不同浓度的 ZT 对芽的萌发影响不是很大 , 当
ZT 为 0.5 mg L 时 ,萌发率较高 ,新芽的生长快而且
粗壮 ,叶大而伸展 ,是最适合诱导芽的 ZT 浓度 。考
虑到6-BA的价格比ZT低得多 ,在工厂化育苗中为
降低成本具有优势 ,因此选用 6-BA诱导芽更好 。
表 2　不同细胞分裂素对芽诱导的影响
激素
类型
浓度
(mg L)
外植
体数
萌芽率
(%) 　　　芽的生长情况
6-BA 0.5 19 95 芽壮实 ,抽生快 , 90%的单芽分化成 2-3 芽。
1.0 14 85.7 芽壮实 ,抽生较快 , 约 75%的单芽分化成 2-3 芽。
2.0 13 76.9 芽壮实 ,抽生较快 , 25%的单芽分化成 2-3 芽 ,少量枯萎。
3.0 14 64.3 芽短 ,抽生较慢 , 单芽分化少 ,枯死现象加重。
4.0 13 23.1 芽短 ,抽生较慢 , 少数叶片长出愈伤组织 ,枯死严重。
ZT 0.2 17 88.2 芽壮实 ,腋芽分化一般 , 长势好。
0.5 17 94.1 芽壮实且长 ,分支多 , 生长旺盛 ,苗修长。
1.0 15 80 芽矮而壮 ,分化一般。
TDZ 0.5 24 80.9 芽分化差 ,基部逐渐长成愈伤组织 , 小部分芽仍正常生长。
2.3　生根培养
在无菌苗中切取 2-3 cm 左右的嫩梢接种于附
加各种激素浓度水平的 1 2 MS生根培养基中培养 ,
先在室内弱光照条件下培养 6-8 d 左右 ,然后逐渐
加强光照 。30 d后观察。
2.3.1　不同激素及其组合对生根培养的影响
不同激素及其组合对生根培养的影响结果见表
3 ,从表 3可知 ,从再生植株的途径看 ,不同激素水平
组合对愈伤组织诱导 、根的生成起着重要的作用。
添加了 IAA的有的基部长出愈伤组织 ,有的不见长
根或长出不到 1cm 后便停止生长;而添加了 6-BA
有少量或没有愈伤组织 ,但也不能诱导生根 ,即使与
NAA 、IAA配合使用也无根系发生 ,但是其植株生长
很好 ,腋芽分化也多。可见 ,6-BA可以显著促进芽
分化 ,但是可能抑制长根。部分试管苗基部形成愈
伤组织 ,而愈伤组织会阻滞上下疏导之间的畅通 ,导
致发出的根和茎之间无维管组织的直接联系[ 5 , 6] ,养
分水分上下之间运输困难 ,因此移栽后可能不能成
活 。试验中用 NAA作生根剂效果较佳 (见图版 I-
5),苗的基部没有或形成极少愈伤组织 ,生根率高 ,
13第 1期(总第 68期)　 　　　　　　马生健等:尾叶桉的组织培养及植株再生
根健壮 ,有利于移栽 。
2.3.2　不同浓度NAA对生根培养的影响
以1 2MS 为基础培养基 ,附加不同浓度的 NAA
进行生根培养 ,寻找最适合 U6 生根的 NAA 浓度 。
培养 20d后观察 ,结果如表 4。
表 3　不同激素及其组合对生根培养的影响
试验处理(mg L) 　　　生根状况
NAA 0.5 生根时间短 ,切口有少量愈伤组织形成 ,根健壮。
IAA 0.5 根少且无根须 ,小部分植株的切口处形成愈伤组织 ,生长缓慢。
6-BA 0.5 无根系发生 ,切口处不膨大 ,腋芽分化一般。
NAA 0.5+6-BA 1.0 无根系发生 ,基部不膨大 ,腋芽分化多 , 90%的单个腋芽分化出 1-2 个小芽。
NAA 0.5+IAA 0.2 少量根长出 ,切口处形成大量愈伤组织 ,苗顶端枯萎严重。
NAA 0.2+IAA 1.0+6-BA 0.5 无根系发生 ,切口处膨大 ,少量愈伤组织 , 腋芽分化最多。
表 4　不同浓度 NAA对生根培养的影响
浓度(mg L) 接种株数 生根株数 生根率(%) 　　　生根状况
0.2 17 5 29.4 切口无愈伤组织形成 , 根系少。
0.5 15 5 33.3 切口处有少量愈伤组织。
1.5 15 10 66.7 切口无愈伤组织形成 , 根由茎直接发出 ,根多 , 苗生长好。
2.0
　
14
　
11
　
78.6
　
部分切口形成少量愈伤组织 , 小部分根由茎发出 , 大部分根由叶缘
处长出 , 根系多且粗壮 ,但是苗生长一般。
2.5 15 8 53.3 切口有少量愈伤组织形成 , 根系较少 ,少数植株枯死。
　　从表 4可看出:低浓度的 NAA只会有少量或没
有愈伤组织 ,但不利于生根;高浓度的 NAA可导致
愈伤组织的形成和芽的早衰[ 7] 。随着 NAA 浓度的
增加 , 生根率也不断升高 , 当 NAA 浓度达到 2.0
mg L时 ,生根率达到最高水平 ,达 80%。从试验结果
看 ,小部分的根是由茎直接发出 ,发根数较少 ,平均
根数 2-5条;大部分的根是从接触到培养基的叶
片边缘处长出 ,其生根状况极佳 ,平均根数达 5-10
条 ,根系质量好 ,叶缘长根的内部机理还需进一步的
研究。通过比较分析 ,选择 2.0 mg L NAA 对生根诱
导最佳(见图版 I-6)。
2.4　幼苗移栽
组培苗的移栽是瓶苗从无菌 、光照温度恒定 、湿
度饱和的培养条件下 ,直接转移到一个有菌 、光 、温 、
湿不恒定的环境下 ,一是霉菌容易感染 ,二是缺乏抵
抗力而导致死亡[ 8] 。为了提高移栽成活率 ,必须缩
小自然环境和瓶内环境的差异 ,尽可能地制造适宜
于瓶苗生存的环境。生根培养 30 d后 ,小苗茎部木
质化 ,叶片舒展 ,颜色浓绿 ,根系伸长 ,此时将培养瓶
打开 ,炼苗 5-7 d后 ,再将幼苗根部培养基冲洗掉 ,
移栽到花盆里。移栽后 ,浇足定根水 ,最初 10-15 d
设置透明塑料罩保湿 (90%以上),同时在塑料罩上
打洞以利于气体交换[ 7] 。1周后逐渐揭膜锻炼 ,30 d
后可长成健壮的出圃苗 ,成活率达 90%。
3　讨论
3.1　在U6 愈伤组织诱导的试验中 ,不同部位的外
植体都能够诱导出愈伤组织 ,诱导率比较高 ,表明桉
树愈伤组织的诱导具有普遍性。三种外植体以带芽
茎段培养效果最好 ,它不但出愈率高 ,而且愈伤组织
状况比较好。不同的外植体诱导愈伤组织的 2 ,4-
D浓度均以 1-2 mg L 为宜 ,超过 4 mg L ,则产生抑
制作用 ,这与王米力等[ 9] 的研究结果是一致的 。
3.2　在U6 茎芽培养中 ,较高的 6-BA浓度不利于
从芽的诱导 ,芽容易枯死 ,这与徐强兴[ 10] 的研究结
果是一致的 。同时 ,在培养过程中 ,出现了不正常的
14 桉 树 科 技　 　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷
生长现象:比如叶子变小或叶表面上出现颗粒状愈
伤组织 ,类似情况在其它桉树如山桉 、大桉 、红花桉 、
巨桉 、刚尼桉中也有报道[ 7] ,这种情况的产生 ,可能
与树种本身的生物学特征有关 ,也可能与外植体的
起源 、生理 、生殖潜力及对离体培养中各种条件的反
应有关 ,其成因很复杂 ,尚无定论 。石大兴等[ 11] 在
研究巨桉离体培养中指出 ,叶表面产生颗粒状愈伤
组织 ,认为可能是外源激素引起的异常反应 ,采用无
激素培养多代 ,多数情况表现正常 。
3.3　Skoog 和 Miller (1957)提出 ,植物的器官分化
是受两类激素(生长素和细胞分裂素)的相互作用
控制的 ,即当细胞分裂素对生长素的比率较高时 ,可
促进茎芽的形成 ,当生长素对细胞分裂素的比率较
高时 ,有利于根的分化[ 12] 。而李浚明[ 12] 指出 ,外植
体对外源激素的要求取决于该植物体系内源激素的
水平 ,而内源激素的水平随组织 、植物类型和植物的
生长时期而变化 ,在若干情况下 ,单一的细胞分裂素
或生长素就足以促进器官的分化。本研究通过单因
子试验 ,筛选出了 U6 较适宜的芽增殖培养基为 MS
+0.5 mg L 6-BA;生根培养基为 1 2 MS+2.0mg L
NAA ,20 d生根率就达到 80%。
3.4　在以 NAA 调节生根培养的试验中 ,大部分接
触培养基的叶子的叶缘能够发出较多而且质量优良
的根系 ,能否通过叶片诱导成完整植株还需进一步
的研究。
3.5　本研究中 , U6 试管苗的叶子或茎段等在含细
胞分裂素或生长素的培养基上能够高频率的诱导愈
伤组织 、芽和形成根系 ,这为 U6 无性系的快速繁殖
技术奠定了一定的基础。
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15第 1期(总第 68期)　 　　　　　　马生健等:尾叶桉的组织培养及植株再生
图版 I　尾叶桉的组织培养及植株再生
图版说明
图版 I　尾叶桉的组织培养及植株再生
1.带芽茎段在含1.0 mg L 2 ,4-D的培养基上
暗培养20 d后诱导出浅黄色颗粒状愈伤组织;
2.带芽茎段在含 0.5 mg L TDZ 的培养基上暗
培养 6-8 d后转入自然光下培养 , 25 d后诱导出浅
黄颗粒状愈伤组织;
3.带芽茎段在含 0.5 mg L ZT 的培养基上暗培
养6-8 d后转入自然光下培养 ,25 d后诱导出的丛
生芽;
4.带芽茎段在含 0.5 mg L 6-BA 的培养基上
暗培养 6-8 d后转入自然光下培养 ,20 d后分化出
大量的芽;
5.幼苗在含 0.5 mg L NAA 的培养基上自然光
下培养 ,20 d后诱导出的根;
6.幼苗在含 2.0 mg L NAA 的培养基上自然光
下培养 ,20 d后诱导出大量的根 。
16 桉 树 科 技　 　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷