全 文 ：安徽农业大学学报 , 2007, 34(4):567-569
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
组织培养紫叶酢浆草 DNA甲基化的研究①
许早时
(安徽省林业高科技开发中心 ,合肥 230031)
摘　要:紫叶酢浆草是重要的观赏植物 , 是较早建立较为完善组织培养系统之一。本研究提取经组织培养获
得的紫叶酢浆草基因组 DNA, 利用 Southern杂交 , 分析了 5SrDNA位点的 DNA甲基化情况。结果表明 ,紫叶酢浆
草的 5SrDNA位点的 CpG高度甲基化 ,而 CNG的甲基化状况则较低。
关键词:紫叶酢浆草;组织培养;DNA甲基化
　　中图分类号:S688.4 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2007)04-0567-03
AnalysisofDNAmethylationoftissueculturedOxalisviolacea
XUZao-shi
(ForestryHighTechnologyDevelopmentCenterofAnhuiProvince, Hefei230031)
Abstract:Oxalisviolaceaisanimportantornamental.Inthisstudy, weextractedthegenomicDNAfromthe
tissueculturedOxalisviolacea, thenanalyzedtheDNAmethylationat5SrDNAlociwithSouthernblot.Theresults
showedthathypermethylationofCpGandhypomethylationofCNGat5SrDNAloci.
Keywords:Oxalisviolacea;tissueculture;DNAmethylation
　　紫叶酢浆草 (Oxalisviolacea)又名紫蝴蝶 、幸
运宝石 ,原产于美洲 , 为多年生的草本植物[ 1] 。根
肉质 ,半透明 ,植株基部具多个呈莲座状排列的小鳞
茎 ,鳞茎轮廓近圆形或卵形 。三出掌状复叶 ,小叶呈
等腰三角形 , 着生于总叶柄上 , 叶柄长为 15 ～ 30
cm;初生嫩叶为玫瑰红 ,成熟叶为紫红色 ,叶在白天
展开 ,在夜晚或强光下 ,三叶片紧靠 ,似蝴蝶起舞;花
序伞状 ,白色至浅粉红色 , 5 ～ 8朵 ,簇生在花茎顶
端 ,花茎细长 ,婀娜多姿 ,每年的 4 ～ 12月为花期 ,长
达 8个月 ,是重要的观叶与观花植物。具有一年栽
植 ,多年观赏的优点 ,是单年生草本植物的理想替代
品 。同时 ,紫叶酢浆草艳丽的叶及花 ,含有丰富的天
然色素 ,是良好的天然色素资源 [ 2] 。
紫叶酢浆草的繁殖多采用分株或播种的方法 ,
分株采用切分块茎 ,利用块茎突起的芽或茎叶 ,带土
扦插 ,但这样的繁殖速度慢 。紫叶酢浆草的结实率
低 ,种子资源严重制约着紫叶酢浆草的生产 [ 3] 。组
培快繁利用无性繁殖技术 ,解决了紫叶酢浆草生产
难题 [ 4] 。目前 ,国内紫叶酢浆草的无性繁殖规模化
生产报道较少 ,且紫叶酢浆草分子生物学研究还未
见报道 ,紫叶酢浆草植株体内的 DNA甲基化等表观
修饰更是一无所知 ,鉴于此 ,作者提取组织培养规模
化生产紫叶酢浆草植株的基因组 DNA,对 5SrDNA
位点甲基化进行研究。
1　材料与方法
1.1　试验材料及仪器
紫叶酢浆草取自安徽省林业高科技开发中心智
能化大棚 。试剂 CTAB、PVP40、EDTA和 Tris来自
Sigma公司 , DNA分子 Maker来自 TaKaRa公司 ,
Hybrid+尼龙膜来自 Amersham公司 ,其它常用的生
物学及化学试剂均为国产分析纯试剂。电泳仪为
Bio-Rad公司 ,扫描仪 Typhoon8600来自 Amersham
公司 。
① 收稿日期:2007-07-31
作者简介:许早时(1972-), 女 ,工程师。
DOI :10.13610/j.cnki.1672-352x.2007.04.016
1.2　紫叶酢浆草的组织培养
1.2.1　组织培养方法　从无病虫害 、生长健壮的紫
叶酢浆草植株上截取丛生芽及嫩叶片 ,先用一定浓
度的洗洁精浸泡 10min,后流动水冲洗约 1h。带入
无菌操作室在接种台上依次用 70%酒精浸泡 10 s,
2%次氯酸钠溶液消毒 15min,无菌水冲洗 6 ～ 8次 。
接种盘里切割幼芽 、嫩叶片 ,接种到诱导培养基上 ,
暗培养 5 ～ 7 d,再放于日光照 12h、光强为 1 500 lx
的培养箱中光照培养。培养约 10 ～ 15 d即可愈伤
化 , 30 ～ 40 d产生不定芽 ,将不定芽转接到增殖培
养基上 ,待培养一段时间后取丛生苗中的健壮小苗
接至生根培养基上 ,生根培养 25 ～ 35 d后 ,炼苗并
移栽。
1.2.2　培养基　分化培养基:MS+6-BA1.0 mg·
L-1 +IBA0.1 mg·L-1;增殖培养基:MS+BA0.5
mg·L-1 +NAA0.1 mg·L-1;生根培养基:1/2MS+
IBA0.2 mg·L-1。
1.3　紫叶酢浆草基因组的提取及 Southern杂交
紫叶酢浆草的基因组 DNA提取采用 2×CTAB
和 SDS法 ,参照 《分子克隆实验指南》[ 5] 。 Southern
杂交方法参照文献 [ 6] , 5SrDNA探针为 pTa794。
2　结果与分析
2.1　紫叶酢浆草植株的获得
接种于分化培养基上的外植体 , 2 ～ 3 d后颜色
逐渐变淡 , 8 ～ 14 d开始从外植体切口处 ,去分化为
乳白色愈伤组织 , 18 ～ 21 d后愈伤组织逐渐变紫 ,
并且开始着生白色放射状气生根 ,此后渐渐分化出
不定芽原基 。将诱导产生的不定芽切下或将含不定
芽的愈伤组织切成包括几个小芽的芽块 ,转接到芽
增殖培养基上 , 28 ～ 30 d长出 20 ～ 25棵小芽的芽
丛 , 35 ～ 40 d多数芽能长到 1.5 ～ 2.5 cm以上 。将
诱导的芽置于生根培养基上生根培养 25 ～ 35 d后 ,
移至温室炼苗并管护 。于 15 ～ 25℃温度 ,于 75% ～
85%湿度较低光照 ,经 15 d的培养即可炼苗成活;
再经 1个月的温室管护后即可得 15 ～ 30 cm壮苗 。
2.2　基因组的提取
为了分析紫叶酢浆草的基因组状况 ,采用了
CTAB和 SDS法提取紫叶酢浆草的基因组 DNA。选
取组织培养后的紫叶酢浆草幼苗的叶 2 g,于研钵中
用液氮研磨至粉末状后 ,分别加入 SDS或预热的
CTAB溶液。为了检测 2种方法提取的基因组质
量 ,将基因组 DNA于 0.8%琼脂糖上电泳 ,发现 2
种方法所提取的基因组 DNA均没有明显的拖尾 ,表
明所提的 DNA可以用于下一步的 Southern分析 。
结果如图 1所示。
1.泳道为 CTAB法所提基因组 DNAGenomicDNAextracted
byCTAB;2.泳道为 SDS法所提基因 GenemicDNAextracted
bySDS
图 1　紫叶酢浆草基因组 DNA的提取
Figure1　ThegenomicDNAofOxalisviolacea
图 2　紫叶酢浆草的 DNA甲基化分析
Figure2　AnalysisofDNAmethylationofOxalisviolacea
2.3　紫叶酢浆草的 DNA甲基化分析
在高等植物体内胞嘧啶 C易受到甲基化修饰 ,
其中 DNA甲基化可分为 CpG甲基化 、CNG甲基化
(N是 A、T、C、G中的任何一种)和非对称甲基
化[ 7] 。 5SrDNA在真核生物中高度保守 ,重复单位
为 200 ～ 900bp, 单倍体基因组的拷贝数为 1 000 ～
50 000,其编码区 120 bp是基因的保守区 。间隔区
的长度和序列随物种间变化很大。在拟南芥中 , 5S
rDNA有 1 000个以上的拷贝 ,位于高度浓缩的中心
粒区的异染色质中 ,处于高度甲基化状态[ 8, 9] 。
为了研究紫叶酢浆草的 DNA甲基化情况 ,采用
HpaⅡ和 MspⅠ内切酶消化基因组 DNA,然后进行
Southern杂交 。HpaⅡ和 MspⅠ都识别 CCGG序列 ,
无论是外部或内部的胞嘧腚 C甲基化 , HpaⅡ都不
能将其切断 ,而 MspⅠ只有在外部的 C甲基化后才
不能将其切断 ,所以通过 HpaⅡ和 MspⅠ可以研究
568 安 徽 农 业 大 学 学 报 2007年
植物体内 CpG和 CNG的变化情况 [ 9] 。将酢浆草的
DNA经 HpaⅡ和 MspⅠ酶切后 ,进行 Southern杂交
发现:经 HpaⅡ酶切后 , 5SrDNA带型不能下移 ,表
明紫叶酢浆草的 5SrDNA为高度的 CpG甲基化 ,与
HpaⅡ酶切相比 ,经 MspⅠ酶切的带呈明显的下移 ,
但不能为一条带 ,表明 CNG仍然有甲基化 ,但甲基
化的水平明显比 CpG要低。结果如图 2所示。
3　小结与讨论
紫叶酢浆草具有重要的观赏价值 ,是一种值得
大力推广的优异彩叶绿化植物 ,具有良好的开发前
景 。本研究采用组织培养的方法生产紫叶酢浆草植
株 ,并对其分子水平进行初步的探讨 。结果表明 ,
CTAB和 SDS法均能提取较高质量的基因组 DNA,
这是由于紫叶酢浆草所含多糖类等次生产物较少 。
紫叶酢浆草的 5SrDNA具有物种间的保守性 , CpG
为高度甲基化 ,而 CNG的甲基化状况则较低 。
植物体内胞嘧啶 C的甲基化具有重要的生物
学意义 ,一方面 ,甲基化的 C可以维持基因的异染
色质状态 ,抑制基因的表达 ,维持基因组的稳定性;
另一方面 ,植物体利用 DNA甲基化 ,来抵御外来病
源物的侵染 。基因组 DNA的质量决定着甲基化分
析的成败 ,如果所提取的基因组质量低 ,在 Southern
杂交信号会出现糜散 ,无法确定信号是酶切的结果 ,
还是基因组拖尾的假象 ,影响对甲基化结果的判断。
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