全 文 ：第 28卷第 5期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 28, No. 5
2006年 10月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis Oc.t , 2006
文章编号:1000 - 2286(2006)05 - 0693 -05
华木莲叶黄酮类化合物抗氧化作用
施建敏1 ,俞志雄1* ,庞会忠 2 ,徐先栋 2 ,周武松 2 ,揭正平 1
(1. 江西农业大学 园林与艺术学院 ,江西 南昌 330045;2.江西农业大学 生物工程系 ,江西 南昌 330045)
摘要:通过邻苯三酚自氧化法 ,水杨酸比色法分别测定了华木莲叶黄酮类化合物(Sinom ang lietia glaula Leaf F la-
vonoids, SLF)清除超氧阴离子自由基(O 2 )、羟基自由基( OH)的效果 , 及其对 H2O2诱导的大鼠血红细胞溶
血作用的影响来研究 SLF的抗氧化性作用。结果表明:不同浓度的 SLF均能显著地清除超氧阴离子自由基
(O
2
)、羟基自由基( OH), 抑制 H
2
O
2
对红细胞膜的破坏而引起的溶血 , 抗氧化性作用随 SLF浓度的升高而
增强。
关键词:华木莲;黄酮类化合物;抗氧化;超氧阴离子自由基(O 2 );羟基自由基( OH);红细胞溶血
中图分类号:Q949. 95　　文献标识码:A
The Anti- ox idation Effect ofSinomanglietia g laula Leaf F lavonoids
SH I Jian -m in
1 , YU Zhi - xiong1* , PANG Hui - zhong2 ,
XU X ian - dong
2 , ZHOUWu - song2 , JIE Zheng - ping1
　　 (1. Co llege o f A rt and Landscape, JAU , Nanchang 330045, China;2. Departmen t o f B ioengineering,
JAU , Nanchang 330045, China)
　　Abstract:The flavonoid is amacromolecular organic compound, which is w ide ly used in food andmedi-
cine industry. In this paper, the an ti - ox ida tion effect o f flavonoids extrac ted from S inomanglietia glau la lea f
is studied in the fo llow ing w ay:scaveng ing superox ide anion free radical (O 2 ) and hydroxy l free radica l
( OH) by progallo l autox ida tion and sa licylic acid colorime try respective ly, and inhibiting ra ts’ RBC hemo l-
y sis induced byH 2O 2. The results show:S inomanglietia glaula Leaf F lavonoids(SLF) can scavenge superox-
ide an ion free radical (O 2 ) and hydroxy l free radica l( OH) effective ly, and inh ib it RBC hemo lysis re-
markab ly. M o reover, the anti- oxidation effect strengthens w ith the increase of SLF density.
Key words:S inomanglietia g lau la;flavonoid;anti- ox idation;superox ide anion free radical;hyd roxy l
free radical;RBC hemo ly sis
黄酮类化合物(F lavono ids)是存在于自然界的一大类化合物 ,在食品和医药工业上有着广泛的应
用 。作为一种功效成分 ,具有增强心血管功能 ,抗肿瘤 ,增强免疫力 ,延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等
作用。近年来 ,随着人们生活水平的提高和对保健的重视 ,黄酮类化合物的研究开发十分活跃。目前 ,
国内保健食品生产中开发较多的只有银杏黄酮 、竹叶黄酮 、葛根黄酮 、茶叶黄酮 、山楂黄酮等[ 1 ～ 5] 。
华木莲 (S inomanglietia glaula Z. X. Yu e tQ. Y. Zheng)为木兰科中我国特有单种属植物 ,仅分布于
江西宜春境内明月山山地 , 1999年被列为国家一级重点保护植物 [ 6, 7] 。本研究华木莲叶片的黄酮类化
合物抗氧化作用 ,旨在为珍稀植物华木莲的研究与开发利用积累有价值的资料。
收稿日期:2006 - 05 - 30
基金项目:国家自然科学基金项目(30060073)
作者简介:施建敏 (1978 - ), 男 , 硕士 , 主要从事植物学研究与教学工作;*通讯作者:俞志雄 , 教授 , E -m a il:
zxyu2006@126. com。
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
1　材料与方法
1. 1　实验材料
华木莲新鲜叶片 (取自江西农业大学华木莲保育园 ),烘干后磨成粉末过 40目筛备用;SD大鼠血
液 (由江西省医学实验动物中心提供 ),用肝素抗凝 , 3 000 r /m in离心得红细胞 ,冰冷生理盐水洗 3次 ,
制成 0. 5%血红细胞悬浮液(RBC)备用。
1. 2　实验试剂
邻苯三酚 ,七水硫酸亚铁 ,水杨酸 ,盐酸 ,过氧化氢 ,无水乙醇 , Tris,亚硝酸钠 ,硝酸铝 ,氢氧化钠 ,芦
丁 ,乙醚等 ,以上试剂均为分析纯。
1. 3　主要仪器
721光栅分光光度计 , TU - 1800紫外可见光光度计 ,数显恒温水浴锅 ,电子天平 , HZ - 841树脂 ,离
心机 ,旋转蒸发器 ,电动粉碎机 ,索氏抽提器。
1. 4　实验方法
1. 4. 1　SLF提取 、纯化与样品制备 [ 2, 5, 8] 　准确称取一定质量的华木莲叶末 ,用索氏提取法 (乙醚为抽
提剂 , 45℃水浴 )脱脂及除去脂溶性色素 。当乙醚抽提液为无色时挥尽华木莲叶末中乙醚 ,将华木莲叶
末放在烧瓶中 ,加入 10倍于华木莲叶末质量的 70%乙醇 ,浸提时间为 4 h,温度为 70 ～ 75 ℃。过滤后
得到华木莲叶黄酮粗提液 。采用 HZ - 841型大孔吸附树脂 ,黄酮粗提液上柱至接近饱和 ,用水洗至流
出液为无色 。采用 70%乙醇洗脱黄酮 , 50 ℃水浴中用旋转蒸发器减压浓缩成较纯的华木莲叶黄酮类
化合物 (简称 SLF,下同)浆状液。
取适当的浆状液 ,按梯度用 30%乙醇稀释 ,再分别取该稀释液 1. 0, 2. 0 , 3. 0, 4. 0 , 5. 0 mL放入
10 mL试管中 ,用 30%乙醇稀释至刻度 ,作为不同浓度的 SLF样品液 ,分别标识为样品 1 ～ 5;另用同样
方法配制标记为样品 Ⅰ ～ Ⅴ用于对 H2O2诱导血红细胞溶血的抑制试验 。
1. 4. 2　标准曲线的绘制与样品浓度的测定 [ 5, 8] 　绘制标准曲线:称取 0. 001 5 g芦丁标样 ,溶于 15 mL
的 30%乙醇溶液中 ,分别取 0 , 1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0 , 5. 0 mL此溶液于 10 mL容量瓶中 ,各补加 30%乙醇溶
液使成 5 mL体积。加 5%N aNO 2溶液 0. 3mL,摇匀 ,静置 6 m in ,加 100 mg /L A l(NO 3)3溶液 0. 3 mL,
摇匀 ,静置 6 m in,加 1 mol /LN aOH溶液 4. 0 mL,再加蒸馏水稀释至刻度 ,摇匀 ,静置 15 ～ 20 m in后 ,于
510 nm处测定吸光度 A。
样品浓度测定:分别取 5 mL样品于 10 mL试管中 ,依次加入 50 mg /L N aNO 2 0. 3 mL,静置 6m in,
加 100mg /L A l(NO 3)3 0. 3 mL,静置 6m in,加 1 mo l /L NaOH 4. 0 mL,静置 15 ～ 20m in,同时以 30%乙
醇代替样品液配制空白试剂 ,在 510 nm处测定吸光度 A。
1. 4. 3　SLF对超氧阴离子自由基(O 2 )抑制率的测定　采用邻苯三酚自氧化法[ 9]进行测定 ,取 4. 5 mL
50 mmol /L Tris -HC l缓冲溶液(pH8. 2), 4. 2 mL蒸馏水混匀后在 25 ℃水浴中保温 20 m in ,取出后立
即加入在 25 ℃预热过的 3 mmo l /L邻苯三酚 0. 3mL,迅速摇匀后倒入比色杯 , 325 nm下每隔 30 s测定
吸光度 ,计算线性范围内每分钟内吸光度的增加 ,以 10mmol /L HC l溶液配制空白管作为对照。
按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入 0. 1 mL不同浓度的样品液 ,以 10 mmo l /LHC l溶液配
制空白管作为对照 ,同样方法测定吸光度 。
前后两次的样品吸光度差 (△A)与测定时间差 (△t)的比值即为该时段的邻苯三酚自氧化速率。
所以:
抑制率 (%)=(△A1 /△t -△A2 /△t) /△A1 /△t×100% (1)
式中:△A1 /△t—邻苯三酚自氧化时反应速率;△A2 /△t—加入样品液后邻苯三酚自氧化反应速率 。
1. 4. 4　SLF对 OH的抑制率　采用水杨酸比色法[ 10]进行测定 ,在 4mL反应液 (含 0. 15 mo l /L FeSO 4
1 mL, 6 mmo l /L H2O 2 1mL, 2 mmo l /L水杨酸钠 1mL)中加入不同浓度的 SLF 1 mL,再加入 H 2O 2启动
反应。 37 ℃反应 1 h,测定 510 nm处的吸光值。吸光值越大 ,则清除 OH效果越好 。按下式计算抑
制率:
抑制率 (%)=[A0 - (Ai -A0 i)] /A0 ×100% (2)
694
第 5期 施建敏等:华木莲叶黄酮类化合物抗氧化作用
　　图 1　芦丁标准曲线
　　F ig. 1　The standard cure o f ru tin
表 1　SLF对超氧阴离子自由基(O 2 )的抑制作用
Tab. 1　The inh ib ition of SLF to(O 2 )
样品号 1 2 3 4 5
质量浓度 /μg mL - 1 18. 7 39. 2 58. 6 73. 5 83. 1
自氧化速率 9. 3×10- 4 8. 7×10 -4 6. 6×10 - 4 5. 9×10- 4 5. 5×10- 4
抑制率 /% 0. 21 9. 49 29. 90 37. 04 41. 54
表 2　SLF对 OH抑制作用
Tab. 2　The inh ib ition of SLF to OH
样品号 1 2 3 4 5
质量浓度 /μg mL - 1 18. 7 39. 2 58. 6 73. 5 83. 1
Ai 0. 433 0. 516 0. 604 0. 662 0. 713
A0i 0. 006 0. 106 0. 217 0. 343 0. 447
A i -A0i 0. 427 0. 410 0. 397 0. 319 0. 266
抑制率 /% 62. 08 63. 59 64. 74 71. 67 76. 38
　　式中:A0—用蒸馏水代替样品的对照值;Ai—加样品后的吸光度;A0 i—样品本身的本底值。
1. 4. 5　SLF对 H 2O 2诱导血红细胞溶血的抑制作用 [ 11] 　取红细胞悬液 1mL,加入不同浓度的 SLF样
品液 200 μL,最后加 100mmol /L H2O2 200 μL混匀启动反应 。 37 ℃作用 1 h,用生理盐水稀释 6倍 ,
3 000 r /m in离心 5 m in。取上层清液于 415 nm处测吸光度 ,计算抑制率和溶血度:
抑制率 (%)=(Ah -Ai) /(Ah -A0)×100% (3)
溶血度 =A i /Ah (4)
式中:A0—对照组的吸光度;Ai—加样品组的吸光度;Ah—加 H2O2诱导组的吸光度。
2　结果与分析
2. 1　SLF样品浓度
由芦丁标准曲线 (图 1)拟合得到回归方程:C
=61. 35A -0. 881 2,方程相关系数 R 2 =0. 994 1,
式中 C为样品质量浓度 (μg /mL), A为样品吸光
度 。
根据上述标准曲线回归方程计算样品液浓
度 ,结果为样品 1 ～ 5的质量浓度(μg /mL)值分别
为 18. 7, 39. 2, 58. 6, 73. 5, 83. 1;样品 Ⅰ ～ Ⅴ的质
量浓度 (μg /mL)值分别为 100. 5, 211. 6 , 345. 6,
403. 1, 576. 3。
2. 2　SLF对超氧阴离子自由基(O 2 )的抑制作用
抗氧化作用是通过供氢来完成清除 O 2 反应的 ,由于黄酮类化合物有活泼的 3’ , 4’位酚羟基 ,能提
供活泼的氢 ,从而阻断自由基反应 ,起到抑制作用 [ 8] 。
试验测得在未加
入 SLF时 ,邻苯三酚
自氧化速率较快 ,其
值为 9. 4 ×10- 4;当
加入 SLF后 ,邻苯三
酚自氧化速率能得到
有效的抑制 (表 1)。
而且 ,这种抑制作用
随加入样品质量浓度
的升高而明显增强 ,
当样品质量浓度为
18. 7 μg /mL时 , 抑制
率 很 微 弱 , 仅 为
0. 21%;质量浓度为
39. 2 μg /mL时 ,抑制
率有较大幅度的升高 ,达 9. 49%;质量浓度超过 50 μg /mL时 ,抑制率上升的趋势有所缓解 ,但最高值还
是样品质量浓度最高的 5号样品 ,抑制率高达 41. 54%。
2. 3　SLF对 OH的抑制作用
从表 2看出 , SLF对羟基自由基也有很好的抑制作用 ,且同样是抑制率随黄酮类化合物质量浓度的
升高而增强。当质量浓度为18. 7 μg /mL时 ,抑制率为 62. 08%,而当质量浓度为 83. 1 μg /mL时 ,抑制
率则增至最高 ,为 76. 38%。
对比表 2和表 1可知 , SLF对 OH抑制作用 (抑制率高于 60%)强于对超氧阴离子自由基(O 2 )的
695
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
表 3　 SLF对 H
2
O
2
诱导血红细胞溶血的抑制率及溶血度
Tab. 3　The inh ib ition of SLF to RBC hem olysis induced byH 2O2
实验组 样品质量浓度
/μg m L - 1 A /415 nm
溶血度
/%
抑制率
/%
H
2
O
2
+样品Ⅰ 100. 5 1. 222 93. 14 50. 28
H2O2 +样品Ⅱ 211. 6 1. 190 90. 70 68. 15
H2O2 +样品Ⅲ 345. 6 1. 180 89. 93 73. 74
H2O2 +样品Ⅳ 403. 1 1. 153 87. 88 88. 82
H2O2 +样品Ⅴ 576. 3 1. 142 86. 35 94. 97
对照组 0 (A o)1. 133 80. 35
诱导组 0 (Ah)1. 312 100
抑制作用(抑制率低于 42%),而且样品质量浓度的高低对 OH抑制作用的影响不如其对超氧阴离子
自由基 (O 2 )抑制作用的影响那么明显 。样品质量浓度为 18. 7 μg /mL时 ,对 OH抑制率为 62. 08%,
而对超氧阴离子自由基(O 2 )抑制率仅为 0. 21%;最高质量浓度与最低质量浓度的抑制率差值两者相
差较大 ,前者为14. 3%,而后者高达 41. 33%。
2. 4　SLF对 H2O2诱导血红细胞溶血的抑制作用
H2O2是活性氧的一种 ,在生理条件下 ,细胞线粒体 、微粒体 、浆膜及胞浆中均可产生。大量的实验
结果表明 ,无论在体内还是体外 ,过多的氧自由基都会导致红细胞膜破裂 ,将其内血红蛋白释放出来 ,从
而损伤红细胞 ,引起疾病或衰老 [ 11] 。
由表 3可知 , SLF对红细胞溶血具有抑制作用 ,溶血度随着 SLF浓度的上升而下降 ,而抑制率则随
黄酮类化合物浓度的
升高而增强 。样品质
量 浓 度 为
100. 5 μg /mL时 , 溶
血度为 93. 14%,当质
量浓 度 升至 576. 3
μg /mL 时 则 减 至
86. 35%,下降了近 7
个百分点;而当样品
质 量 浓 度 为 100.
5 μg /mL时 , 抑制率
为 50. 28%, 随着质
量浓度的上升抑制率也逐步升高 ,当质量浓度为576. 3μg /mL时抑制率则增至 94. 97%,相比 100. 5 μg /
mL时 ,抑制率将近提高 1倍。由此可看出 , SLF可抑制氧化损伤保护红细胞膜 ,且呈良好的剂量效应关
系 。
3　讨　论
SLF具有较好的抗氧化性 ,可成为抗衰老保健品辅料或功能因子。但因其成分多样 ,结构复杂 ,进
一步的纯化和构效关系研究需进行。同时 ,植物不同季节和不同器官的黄酮类化合物含量和抗氧性能
都是有差异的[ 12 ～ 15] ,本试验仅对华木莲叶片的黄酮类化合物进行了提取并测定了其抗氧化作用 ,而提
取华木莲的黄酮类化合物的最适器官和最佳季节有待进一步研究 。
木兰科植物黄酮类化合物含量的测定已有不少研究 [ 16 ～ 19] ,大多都集中在药用的辛夷上 ,但是抗氧
化性能方面的研究鲜有报道 。本研究测定的 SLF抗氧化作用与竹叶黄酮 、银杏叶黄酮和柿叶黄酮
等 [ 11, 13, 20]相比还是较小的 。研究表明不同类群植物黄酮类化合物的成分和抗氧化性能会存在较大差
异 [ 13, 21 ～ 23] ,但是 SLF的抗氧化性能与其他植物的差异是否即为不同类群的差异引起 ,仍需更为系统的
研究。
参考文献:
[ 1]欧阳平 , 张高勇 ,高保安. 类黄酮的新兴提取技术原理 、应用及前景 [ J] . 天然产物研究与开发 , 2003, 15(6):563 -
566.
[ 2]杨胜远 , 梁智群.银杏叶总黄酮提取纯化工艺的研究 [ J] . 食品科学 , 1998, 19(2):24 - 25.
[ 3]陆柏益 , 张英 ,吴晓琴. 竹叶黄酮的抗氧化性及其 , bN血管药理活性研究进展 [ J] . 林产化学与工业 , 2005, 25(3):120
- 124.
[ 4]朱福 , 王美华.植物黄酮类药物在心血管中的应用 [ J] .心血管病学进展 , 2001, 22(5):295 - 296.
[ 5]裴凌鹏 , 张帅 ,李文卅 , 等.葛根黄酮的提取和抗氧化性研究 [ J] . 北京联合大学学报:自然科学版 , 2003, 17(3):78 -
81.
[ 6]裘利洪 , 俞志雄 ,施建敏 , 等.华木莲群落种间连接性研究 [ J] .江西农业大学学报 , 2004, 26(1):25 - 30.
696
第 5期 施建敏等:华木莲叶黄酮类化合物抗氧化作用
[ 7]林新春 , 俞志雄.江西木兰科植物修订 [ J] .植物研究 , 2004, 24(3):272 - 273.
[ 8]常文贵 , 陈乃富.黄花败酱黄酮类化合物的提取与分析 [ J] . 生物学杂志 , 2005, 22(4):35 - 37.
[ 9]赵二劳 , 张海容 ,盖青青 , 等.沙棘黄酮的测定及其抗氧化作用 [ J] . 化学研究与应用 , 2003, 15(2):284 - 285.
[ 10]汪海波 ,刘大川 , 佘珠化 ,等. 大豆异黄酮类物质的提取 、抗氧化性及稳定性研究 [ J] .食品科学 , 2004, 25(1):111 -
114.
[ 11]杨建雄 ,原江锋 , 李发荣.柿叶黄酮的体外抗氧化作用研究 [ J] .营养学报 , 2003, 25(2):215 - 217.
[ 12]张英 ,昊晓琴 , 俞卓裕.竹叶黄酮和内酯的季节性变化规律研究 [ J] .林产化学与工业 , 2002, 22(2):65 - 68.
[ 13]张英 ,昊晓琴 , 俞卓裕.竹叶和银杏叶总黄酮含量及其抗自由基活性的比较研究 [ J] . 中国中药杂志 , 2002, 27(4):
254 -257.
[ 14]曹群华 ,瞿伟菁 , 黄晓青 ,等. 沙棘籽渣和果渣中黄酮抗脂质过氧化清除自由基作用 [ J] . 中成药 , 2003, 25(8):670 -
672.
[ 15]钟耕 ,陈宗道 , 闵燕萍. 葡萄籽和皮中黄酮成分和抗氧化能力研究 [ J] . 西南农业大学学报:自然科学版 , 2005, 27
(1):64 -68.
[ 16]王琪 ,李洪玲. 中药辛夷质量标准研究 -比色法测定辛夷中总黄酮的含量 [ J] .中草药 , 2003, 34(5):424 - 425.
[ 17]王琪 ,李洪玲. 木兰属植物花蕾总黄酮含量测定及提取工艺研究 [ J] .现代中药研究与实践 , 2003, 17(2):32 -33.
[ 18]于宗渊 ,孙中矾 , 苏本正 ,等. H PLC法测定望春花蕾中望春花黄酮醇苷 I的含量 [ J] .中草药 , 2004, 35(5):574 - 575.
[ 19]毕和平 ,韩长日 , 张连华 ,等. 海南木莲总黄酮含量的测定 [ J] . 海南师范学院学报:自然科学版 , 2005, 18(4):348 -
350.
[ 20]许纲 ,张虹 , 董建红.竹叶提取物清除 O 2 和 OH自由基的研究 [ J] . 营养学报 , 2001, 23(1):79 - 81.
[ 21]徐良雄 ,曾佑炜 , 龙刚 ,等. 不同花卉抗氧化能力及其多酚 、黄酮含量比较 [ J] . 中国野生植物资源 , 2005, 24(1):51 -
54.
[ 22]谭萍 ,李煜. 3种车前草叶片总黄酮的含量测定 [ J] .江西中医学院学报 , 2005, 17(1):54.
[ 23]郭宝林 ,肖培根. 淫羊藿属植物中的黄酮类成分及其分类学意义 [ J] .植物分类学报 , 1999, 37(3):228 - 243.
(上接第 692页)
度大的优良单株 6株 、速生耐寒且红心比率高的优良单株 3株 。这些材料可作为今后无性扩繁利用的
母本材料。
参考文献:
[ 1]王豁然. 巨桉种源试验及其在我国适生范围的研究 [ J] .林业科学研究 , 1989, 2(5):411 -419.
[ 2]王琦 , 王豁然.巨桉遗传改良研究进展 [ J] .世界林业研究 , 1996(3):18 -23.
[ 3]陶德生. 巨桉引种与种源试验及其在浙江省适生范围研究 [ J] .浙江林业科技 , 1990, 10(1):13 -22.
[ 4]王琦 , 王豁然.巨桉子代测定林与引种改良策略的研究 [ J] . 林业科学 , 1996, 32(6):499 - 507.
[ 5]陈远乐. 巨桉种源一家系引种试验研究 [ J] . 福建林学院学报 , 2000, 20(4):365 -369.
[ 6]丘进清 , 兰贺胜.巨桉种源家系引种试验 [ J] .江西农业大学学报 , 2002, 24(4):517 - 521.
[ 7]林木引种 [ S] .中华人民共和国国家标准(GB /T, 14175 - 93), 1993.
[ 8]郎奎健. IBM - PC系列程序集 [M ] .北京:中国林业出版社 , 1989.
[ 9]全国杉木种源试验协作组.杉木造林种源选择 [ J] .林业科学研究 , 1988(1):1 - 13.
[ 10] W illiam s E R,M atheson A C. Expe rim en tal De sign and Ana ly sis forU se in T ree Im provem ent[M ] . 2nd edition. Austra lia:
CS IRO Publish ing, 2002.
[ 11]王豁然.不同种源巨桉生长与材性变异 [ J] .林业科学研究 , 1994, 7(2):199 -202.
[ 12]吴义强 ,罗建举. 巨桉无性系间生长性状 、材性变异规律及优良无性系选择 [ J] .中南林学院学报 , 2000, 20(3):42 -
48.
697