全 文 ：大羽藓组培初代培养适宜消毒方法的筛选
郎玉卓 ,阚世超 ,刘伟才 ,周金川 ,熊源新＊　(贵州大学生命科学学院 ,贵州贵阳 550025)
摘要　[目的]为苔藓植物组织培养提供一些有价值的参考和依据。[方法]采用正交设计方法 ,对大羽藓配子体和孢子体组培初代培养
消毒方法进行筛选。[结果] 结果显示 ,配子体初代培养的最佳消毒方法为:0.5%次氯酸钠溶液+0.05%升汞消毒 60 s;孢子体组培初代
培养的最佳消毒方法为:用 2.0%次氯酸钠消毒 6 min。[ 结论]该试验筛选的方法比较适用于大羽藓配子体组培初代培养。
关键词　大羽藓;组织培养;消毒方法;筛选
中图分类号　S 567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)34-14892-02
Screening of Appropriate Disinfection Method of Early Cultured Thuidium cymbifolium Tissue Culture
LANG Yu-zhuo et al　(College of Life Science ,Guizhou University , Guiyang, Guizhou 550025)
Abstract 　[Objective] The research aimed to provide valuable references for the tissue culture of bryophytes.[ Method] Orthogonal design method was
used to chose the appropriate disinfection method of early cultured Thuidium cymbifolium tissue culture.[ Result] The results show that , the best way to
disinfect the gametophyte in the early culturewas:0.5%sodium hypochlorite solution+0.05% sercuric chloride, disinfecting for 60 s , and the best way to
disinfect the sporophyte in the early culture was:use 2.0% sodium hypochlorite solution to disinfect for 6 min.[Conclusion] Themethods screened in this
study was suitable for the tissue culture of early cultured T.cymbifolium.
Key words　 Thuidium cymbifolium;Tissue culture;Disinfection method;Screening
基金项目　2007年贵州大学创新基金资助(校研农 2007008)。
作者简介　郎玉卓(1982-),女 ,河北邯郸人 ,硕士研究生, 研究方向:
环境植物多样性。 ＊通讯作者 , E-mail:xiongyx@vip.sina.
com。
收稿日期　2008-10-10
　　大羽藓(Thuidium cymbifolium (Doz.et Molk.) doz et
Molk.)属羽藓科(Thuidiaceae)羽藓属(Thuidium),为湿润石生
植物 ,主要生于热带和亚热带地区 ,在我国分布于安徽 、福
建 、广东 、贵州 、广西 、海南 、湖北 、湖南 、河北 、河南 、江苏 、江
西 、香港 、黑龙江 、辽宁 、陕西 、山东 、四川 、台湾 、新疆 、西藏 、
云南及浙江[ 1] 。药用全草 ,味淡 、性凉 ,有清热 、拔毒 、生肌等
功能 ,用于治水火烫伤[ 2] ,具有很高的药用价值 。但由于苔
藓植物形体微小 ,构造特殊 ,生长缓慢 ,对环境条件要求特
殊 ,目前对于苔藓植物组织培养方面的研究很少 ,用配子体
直接作为外殖体的培养在国内外都不常见[ 3] 。为了更好地
开发利用苔藓植物 ,笔者对大羽藓的配子体和孢子体组培初
代培养的消毒方法进行了筛选 ,以期为苔藓植物组织培养提
供一些有价值的参考和依据。
1　材料与方法
1.1　材料　大羽藓配子体及孢子体均采自于贵州大学花溪
南校区。
1.2　试剂 、仪器　Knop培养基:Ca(NO3)2·4H2O(浓度 1 000
mg/L)、KNO3(浓度 250 mg/L)、KH2PO4(浓度 250 mg/L)、
ZnSO4·7H2O(浓度 3mg/L)、FeSO4·7H2O(浓度 12.5mg/L)及
微量NaNO3。蔗糖 ,琼脂 ,蒸馏水 、pH试纸 、次氯酸钠溶液 、升
汞 、无水乙醇 、NaOH 、HCl。高压蒸汽灭菌锅 、电子天平 、超净
工作台 、光照培养箱等。
1.3　试验方法
1.3.1　培养基的制备。配子体培养基(K1)制备:Knop 培养
基+3%蔗糖+8‰琼脂 ,pH值调至 7.0。
孢子体培养基(K2)制备:Knop培养基+1%蔗糖+6‰琼
脂 ,pH值调至 7.0 。
1.3.2　消毒方法。配子体的处理:取新鲜的大羽藓绿色配子
体 ,洗掉表面的泥土等 ,在自来水下流水冲洗 4 h左右 ,然后
转入无菌条件下用无菌水冲洗 3次。将清洗干净的配子体
剪成 1.5 cm左右的茎叶体小段 ,浸入消毒剂中灭菌。消毒方
法的筛选试验采用L4(23)2水平 3因素 4个处理的正交设计
(见表 1)。
表 1　大羽藓配子体消毒方法筛选正交试验设计
Table 1　The orthogonal test design for the screening of the disinfection
methods for Thuidium cymbifolium gametophyte
编号
No.
次氯酸钠∥%
Sodium hypochlorite
升汞∥%
Mercuric chloride
消毒时间∥s
Disinfection time
1 0.5 0.025 30
2 0.5 0.050 60
3 1.0 0.025 60
4 1.0 0.050 30
　　按表 1进行表面灭菌后 ,接种到K1培养基上。4个处理
每个处理 10个培养皿。重复 3次。每次试验后 7 d统计污
染情况。
孢子体的处理:挑取好的 、成熟的带蒴柄的大羽藓孢蒴 ,
用 70%酒精消毒 2min ,然后用无菌水漂洗[ 4] ,再用浓度2.0%
的次氯酸钠溶液进行消毒 ,次氯酸钠溶液处理设 5个时间梯
度 ,分别为 2、4 、6、8、10 min 。消毒后用无菌水漂洗 3 ～ 6次 ,
将灭菌后的孢蒴放入盛有少量无菌水的小培养皿中 ,切开孢
蒴 ,挤出孢子 ,制成孢子悬浮液 ,用吸管吸取少量孢子悬浮
液 ,均匀洒在盛有K2培养基的培养皿中。5个处理 ,每个处
理 6个培养皿。重复 3次 ,每次试验后 10 d统计污染情况。
1.4　数据处理　用 DPS v7.05软件对试验数据进行分析。
2　结果与分析
2.1　大羽藓配子体适宜消毒方法的筛选　采用 L4(23)2水
平 3因素 4个处理的正交设计筛选大羽藓的消毒方法 ,结果
如表 2所示。
　　用DPS v7.05软件对污染率与消毒剂次氯酸钠溶液浓
度 、升汞浓度和消毒时间 3个因素进行方差分析 ,结果显示 ,
处理 1与 3、处理 2与 4间在 0.01水平无差异 ,处理 1、3与处
理 2 、4之间在 0.01水平有差异。由此可见 ,用浓度 0.5%次
氯酸钠溶液和浓度 0.05%升汞消毒 60 s与浓度 1.0%次氯酸
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(34):14892-14893　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张彩丽　责任校对　张士敏
钠溶液和浓度 0.05%升汞消毒 30 s的消毒方法效果比较好 。
2.2　大羽藓孢子体适宜消毒方法的筛选　用浓度 2.0%次
氯酸钠溶液对大羽藓孢子体进行消毒培养 ,通过 DPS v7.05
软件污染率与消毒时间进行统计分析 ,结果见表 3。由表 3
可见 ,消毒 2 min 与 4 min在 0.05 水平无差异 ,消毒 6、8、10
min间达 0.01显著水平。消毒时间为 6 min效果最好 ,污染
率为 0;消毒 8 min次之。
表2　大羽藓配子体适宜消毒方法的筛选结果
Table 2　The screening results of the suitable disinfection methods for T.
cymbifolium gametophyte
编号
No. 接种茎叶体段数∥个Segment number of inoculated corm 污染率Pollution rate
1 50 0.793 3±0.011 5A
2 50 0.146 7±0.150 1 B
3 50 0.620 0±0.230 7A
4 50 0.133 3±0.041 6 B
　注:不同大写字母表示在 0.01水平有差异。下同。
　Note:Different capital letters mean difference at 0.01 level.The same as be-
low.
表3　大羽藓孢子体适宜消毒方法的筛选结果
Table 3　The screening result of the suitable disinfection methods for T.
cymbifolium sporophyte
消毒时间∥min
Disinfection time
总接种培养皿个数
Total dish number with inoculation
污染率
Pollution rate
2 18 　 1.000 0±0.000 0A
4 18 0.9433±0.098 1 A
6 18 0.000 0±0.000 0 D
8 18 0.330 0±0.000 0C
10 18 0.723 3±0.092 4 B
3　结论与讨论
苔藓植物组织培养是否能够成功 ,苔藓植物组织材料的
消毒是基础而关键的一步 。曹同等设置了 12个次氯酸钙的
浓度对孢子体和配子体进行消毒 ,发现当浓度为 12.0%时孢
子的存活率最好 ,而配子体则在次氯酸钙浓度为 9.0%时最
好[ 5] 。李晓毓等通过对不同表面消毒剂及其用量和消毒时
间的比较 ,最后综合考虑选择浓度 0.05%氯化汞溶液消毒 60
s对尖叶匐灯藓外殖体进行消毒培养[ 6] 。
由于苔藓植物非常矮小 ,大多植物体是由单层细胞组
成 ,不同种类 、不同材料的消毒方法也不同 ,所以消毒剂的选
择和消毒时间的控制都很难把握。70%的酒精穿透能力很
强 ,用其处理后苔藓植物配子体迅速失绿 ,再用升汞消毒则
对其伤害非常大 ,所以常规的植物组织培养消毒方法对苔藓
植物并不适用[ 3] 。次氯酸钠对植物体的伤害相对较小 ,笔者
采用正交试验设计筛选出 0.5%次氯酸钠溶液+0.05%升汞
消毒 60 s的方法比较适用于大羽藓配子体组培初代培养 。
大羽藓孢蒴由多层细胞组成 ,消毒剂的浓度应该相对加大 ,
消毒时间加长 ,这样才能达到理想的消毒效果 ,经过多次试
验筛选 ,用 2.0%次氯酸钠消毒 6 min ,其污染率为 0 ,孢子的
萌发率达 90%以上。
参考文献
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(上接第 14888页)
表5　不同处理对可溶性蛋白质含量影响差异显著性分析
Table 5　 The difference significance analysis on the effects of different treatments on the content of soluble protein
脱乙酰度
Deacetylation
degree∥%
可溶性蛋白质含量
Content of soluble
protein ∥mg/ g
显著水平 0.05
0.05 significant
level
极显著水平 0.01
0.01 extremely
significant level
昆虫多糖浓度
Concentration of insect
polysaccharide∥mg/ kg
可溶性蛋白质含量
Content of soluble
protein ∥mg/g
显著水平 0.05
0.05 significant
level
极显著水平 0.01
0.01 extremely
significant level
75 　　35.953 40 ab AB 2 45.627 38 bc ABC
80 36.154 93 ab AB 10 47.744 27 ab AB
85 36.259 63 ab AB 50 48.061 33 ab AB
90 39.065 86 a A 250 49.273 67 a A
95 39.448 22 a A 1 250 44.526 18 cd BC
CK 32.067 61 b B CK 41.700 31 d C
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