全 文 ： 资源开发
收稿日期:2009-03-20;　修订日期:2009-07-11
作者简介:韩　莹(1987-),女(汉族),辽宁沈阳人 ,现为辽宁师范大学生
命科学学院在读本科生.
＊通讯作者简介:姜长阳(1953-), 男(汉族),辽宁大连人 , 现任辽宁师范
大学生命科学学院教授 ,主要从事现代生物技术研究工作.
白藓组织培养及无性系建立的研究
韩　莹 ,王　悦 ,丁　莲 ,李永德 ,姜长阳＊
(辽宁师范大学生命科学学院 ,辽宁 大连　116029)
摘要:目的 对白藓资源进行种质保存 , 满足人们栽培对种苗的需求。方法 以白藓嫩茎为材料 , 以植物组织培养方法为
手段 , 进行了愈伤组织诱导 , 愈伤组织和不顶芽分化 , 试管苗生根 , 试管苗移栽 、扦插和移植的研究。 结果 1/2MS+BA
0.5mg· L-1 +NAA1.0 ～ 1.5 mg· L-1为嫩茎愈伤组织的诱导培养和继代培养的理想培养基;MS+AgNO3 1.5mg· L-1 +
BA0.8mg· L-1+naa0.2mg· L-1是嫩茎愈伤组织和不定芽分化培养的理想培养基;1/3MS+IAA0.4 ～ 0.6mg· L-1是生
根培养和试管苗生根继代培养的理想培养基;移栽的试管苗保持了野生白藓的所有生物学性状 , 成功地建立起白藓的无
性系。结论 嫩芽诱导的愈伤组织建立的无性系能对其进行种质保存 , 所繁殖的种苗能满足人们栽培的需求。
关键词:白藓;　愈伤组织;　无性系;　快速繁殖
中图分类号:R282.6　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)02-0504-02
　　白藓 Dictamnusdasycarpus, 又称八股牛 , 属于芸香科白藓属
多年生草本植物 , 生长于山坡 、林下 、林缘和草地。在我国的东
北 、华北 、西北和华东等地有分布 , 朝鲜 、蒙古和俄罗斯也有分
布 [ 1～ 3] 。白鲜叶可提取芳香油;根茎作农药用 , 可防治多种病虫
害;根皮(白藓皮)入药 , 具有解毒 、祛热 、利尿 、除湿和杀虫等功
效 , 能治皮肤瘙痒 、湿疹 、黄水疮 、黄疸 、肝炎和阴部瘙痒等疾
病 [ 3～ 5] 。由于白藓既可作无公害的农药 , 又是治疗多种疾病的中
药 , 从而出现了人们大量采收 , 数量越来越少的现象。于是 ,辽宁
南部地区有人试图对其进行栽培 ,但由于人们长期地过量采挖 ,
已经难以收集到种子 , 只能将有限的野生植株挖回来作为种苗 ,
这又使数量非常少的野生白藓资源遭到了破坏。于是 ,我们对白
藓进行了组织培养及无性系建立的研究 ,以期满足人们栽培对种
苗的需求。虽然已多有芸香科植物组织培养研究的报道 [ 6 ～ 9] ,但
迄今未见白藓组织培养及无性系建立的研究的报道。本研究以
白藓的嫩茎为材料 , 成功地诱导形成愈伤组织 , 建立起无性系。
1　材料
1.1 　材料及灭菌 五月上旬至中旬 , 将林缘草地上长势非常旺
盛的白藓嫩茎切下后 , 放到 500ml的磨口广口瓶中 , 用自来水振
荡洗涤 30min左右 ,再用 0.05 %安利洗涤液振荡洗涤 20 min左
右 , 然后移到超净工作台上 , 用 70% ～ 75%的乙醇灭菌约 15 s
后 , 迅速用无菌水振荡洗涤 2次 , 倒入 0.05 % HgCl2溶液振荡灭
菌 3min,接着用 0.025% HgCl2溶液振荡灭菌 8 min,再用无菌水
振荡洗涤 6次漓干后 , 将装有材料的瓶子置于 27℃的温箱中放
置 24h,然后再用 0.025%HgCl2灭菌 6min, 接着用无菌水洗涤 6
次。即可获得白藓无菌嫩茎。
1.2　培养条件 以 MS, 1/2MS, 1/3MS为基本培养基 , 附加不同
种类不同浓度的 BA, IBA, IAA, NAA和 2, 4-D。以 MS为基本培
养基加蔗糖 30 g· L-1 , 以 1/2MS为基本培养基加蔗糖 15 g·
L-1 , 以 1/3MS为基本培养基加蔗糖 10g· L-1。培养基胨力强度
为 180 g/cm2[ 10] , pH为 5.8 ～ 6.0, 培养温度 20 ～ 25℃, 光照度
3 000 Lx左右 ,光照 10～ 12 h· d-1。
2　方法
2.1　不同培养基对愈伤组织的诱导的影响 将无菌嫩茎用解剖
刀切成长约 0.2 cm的无生长点茎段 , 接种到附加不同浓度 BA、
IBA、NAA的 1/2MS培养基上 , 进行愈伤组织的诱导培养。培养
到 50d时观察统计培养结果。嫩茎愈伤组织的诱导试验重复了
3次 , 每次试验继代培养 5代。
2.2　不同激素愈伤组织分化的影响 将继代培养 45 d生长一致
的愈伤组织颗粒分散成独立的颗粒后 ,接种到以 MS+AgNO3 1.5
mg· L-1为基本培养基 ,附加不同浓度 BA、 2, 4-D或 NAA的培
养基中 , 进行愈伤组织的分化培养。每种培养基接种 100个愈伤
组织颗粒 ,统计观察分化率和分化不定芽的生长状况。
2.3　不同浓度 IAA对不定芽生根的影响 把上述继代培养的丛
生状 、生长旺盛 、高 0.5 cm以上的不定芽从基部剪下 ,接种到以
1/3MS为基本培养基 , 附加浓度分别为 0.2, 0.4, 0.6 , 0.8, 1.0 ,
1.2 mg· L-1和 1.4 mg· L-1的 IAA培养基上 , 进行不定芽的生
根培养 。生根实验重复了 3次 , 每次试验接种 200个不定芽。
2.4　试管苗的移栽 、扦插 把继代培养的生根试管苗培养瓶移到
日光温室中 , 除掉培养瓶瓶塞 , 在 4000 ～ 7000Lx光照下炼苗 4 d,
用镊子将试管苗取出 ,在清水中洗去根部培养基后 ,移栽到上面
分别铺着一层厚为 6 ～ 7 cm的河沙 、珍珠岩 、山皮土 、园土 、炉灰
渣(小颗粒状)5种移栽基质 、下面为肥沃园土的温室苗床上 。移
栽后前 15d保持相对湿度为 95%左右 、温度 20 ～ 28℃、没有直射
光的条件。
把经过上述炼苗 4d的试管苗取出后 , 剪成长 2cm左右 , 至
少具有两个腋芽或一个顶芽和两个腋芽的茎段后 ,将最下面的一
个叶片剪掉后 ,把下部切口在浓度为 90 mg· L-1的 IAA溶液中
浸泡处理 4 ～ 6 min后取出 , 直接扦插到上面覆盖着一层上述五
种事先已经浇透水的移栽基质的苗床上 ,并采用与移栽相同的条
件进行管理。
3　结果
3.1　不同培养基对愈伤组织的诱导的影响 由表 1可见 ,接种到
附加不同浓度 BA、IBA的培养基中不能诱导形成愈伤组织;接种
到附加不同浓度 BA、NAA的培养基上都能诱导形成愈伤组织。
但从愈伤组织的诱导率和长势看两个方面看 ,以 8、9号两种培养
基的诱导效果好。在这两种培养基上培养的材料 ,不仅诱导率达
100%,而且愈伤组织长势好。观察还表明 , 接种在这两种培养基
上的外植体 ,培养到 10 d时 ,大部分培养材料在切口部开始出现
愈伤组织 ,随后愈伤组织开始迅速生长。初期形成的愈伤组织为
无色 、光滑的半透明状 ,后来逐渐生长变化成为直径在 0.1cm左
右的绿色颗粒状。
把上述两种培养基上由嫩茎诱导培养的 、生长状态一致的绿
色颗粒状愈伤组织分散为独立的颗粒后 ,接种到相同的培养基上
进行愈伤组织的继代增殖培养。在相同的培养条件下培养 45 d。
经过 3次重复试验 , 每次重复试验继代培养 5代的研究证明:初
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期培养的愈伤组织为浅绿色颗粒 ,后来伴随着颗粒状愈伤组织的
迅速生长增殖 , 逐渐变成为绿色的颗粒。培养 45 d的增殖系数
为 28.5。上述试验结果说明 , 1/2MS+BA0.5mg· L-1 +NAA1.0
～ 1.5mg· L-1的培养基为白藓嫩茎颗粒状愈伤组织的诱导培养
和继代培养的理想培养基。
表 1　不同培养基对愈伤组织诱导的影响
培养基
编号
激素浓度 /mg· L-1
BA IBA NAA
外植体接
种数
愈伤
组织数
愈伤组织
诱导率(%)
愈伤组织
长势
1 0.5 0.5 0 100 0 0 -
2 0.5 1.0 0 100 0 0 -
3 0.5 1.5 0 100 0 0 -
4 1.5 0.5 0 100 0 0 -
5 1.5 1.0 0 100 0 0 -
6 1.5 1.5 0 100 0 0 -
7 0.5 0 0.5 100 58 58 +
8 0.5 0 1.0 100 100 100 ++
9 0.5 0 1.5 100 100 100 ++
10 1.5 0 0.5 100 18 18 +
11 1.5 0 1.0 100 69 69 +
12 1.5 0 1.5 100 79 79 +
　　“ ++”为长势好;“ +”为长势较好;“ -”为不生长
3.2　不同激素对愈伤组织分化的影响 由表 2可以看出 , 在不同
浓度的 BA与不同浓度 NAA配合使用的培养基上 , 颗粒状愈伤
组织的分化情况较好 , 尤其是浓度为 0.8 mg· L-1的 BA与浓度
为 0.2 mg· L-1的 NAA培养基上 , 不仅愈伤组织的分化率达到
了 98%, 而且分化不定芽长势好。试验过程中的观察还发现 ,在
这一培养基上分化培养 10 d左右愈伤组织颗粒即可分化出可见
的浅绿色芽点 , 随后 ,伴随着愈伤组织颗粒的不断分化增加和分
化不定芽的生长 , 先分化的不定芽基部又会分化出数量不等的不
定芽 , 形成了绿色的丛生不定芽。分化培养到 45 d时 , 每个愈伤
组织颗粒就会分化形成为有 3 ～ 9个不定芽组成的丛生不定芽。
把上述分化培养的绿色不定芽从基部剪下 ,接种到相同的培
养基上进行不定芽的分化培养 。经过 3次重复试验 , 每次重复试
验继代 5代的研究证明:不定芽经过 40 d培养 , 平均每个培养的
不定芽可再分化生长出高 0.5 cm以上不定芽 5.4个。观察还表
明 , 经过 40 d的培养 ,所培养的不定芽都分化生长为丛生状 , 并
且分化的不定芽叶片伸展 、茎较粗壮 、生长旺盛。
上述说明 , MS+AgNO3 1.5 mg· L-1 +BA0.8 mg· L-1 +
NAA0.2 mg· L-1这一培养基是白藓嫩茎颗粒状愈伤组织和不定
芽分化培养的理想培养基。
表 2　不同激素愈伤组织分化的影响
BA/
mg· L-1
2, 4-D/
mg· L-1
NAA/
mg· L-1
愈伤组织颗粒
分化数
愈伤组织
诱导率(%) 长势
0 0 0 0 0 -
0.2 0.2 0 0 0 -
0.4 0.2 0 0 0 -
0.8 0.2 0 0 0 -
1.0 0.2 0 0 0 -
0.2 0 0.2 38 38 +
0.4 0 0.2 66 66 +
0.8 0 0.2 98 98 ++
1.0 0 0.2 75 75 ++
0.2 0.4 0 0 0 -
0.4 0.4 0 0 0 -
0.8 0.4 0 0 0 -
1.0 0.4 0 0 0 -
0.2 0 0.4 29 29 +
0.4 0 0.4 39 39 +
0.8 0 0.4 58 58 +
1.0 0 0.4 40 40 +
　　“ ++”为长势较好;“ +”为长势一般;“ -”为不生长
3.3　不同浓度 IAA对不定芽生根的影响 试验观察表明 , 不定
芽接种培养 8 d时 ,有的培养基上开始出现根原基。培养到 25 d
时观察统计的 3次重复试验的平均结果证明:在附加浓度为 0.4
mg· L-1 , 0.6 mg· L-1的 IAA培养基上 ,不仅平均生根率达到了
96.5%和 97%,平均每株生根数为 6.1条 , 而且生根试管苗长势
旺盛。观察还表明 , 不定芽接种到上述两种培养基上 10 d时 , 培
养材料几乎都形成了根原基 , 随后伴随着根的伸长生长 , 试管苗
也迅速生长。培养到 25d时 ,就可以生长成为高 4 ～ 5 cm左右 、
叶片伸展 、茎粗壮 、根系发达的旺盛试管苗。把生根试管苗剪成
长 1cm左右 、至少具有两个腋芽或顶芽的茎段 , 接种到相同的培
养基上进行生根继代培养。 经过 25 d的培养 , 又可以培养成 1
代旺盛的试管苗。经过 3次重复试验 ,每次重复实验 6代的继代
培养研究证明 , 用这种生根继代培养的方法进行繁殖 , 不仅培养
材料的生根率近 100%、25 d的繁殖系数为 3.1, 而且几乎没有无
效苗 , 繁殖试管苗生长非常旺盛。上述结果说明 , 1/3MS+IAA
0.4 ～ 0.6 mg· L-1这一培养基是白鲜不定芽生根培养和试管苗
生根继代培养的理想培养基。
3.4　试管苗的移栽 、扦插和移植 移栽后 10d可见成活生长 , 25
d时观察统计证明 , 以河沙和炉灰渣为移栽基质平均成活率分别
为 95%, 97.4%,移栽成活后 15 d左右开始正常生长。
扦插后 15d可见成活生长 , 30 d时观察统计证明 , 以炉灰渣
为扦插基质 , 成活率为 91%。扦插苗前 50 d植株较小 ,后期长势
与移栽苗一致。上述说明 ,炉灰渣是白鲜试管苗移栽和扦插的理
想基质 。
把在日光温室中移栽 、扦插成活的试管苗于五月中旬和下旬
先后两次移植到山坡上 ,移植的白藓试管苗保持了野生白藓的所
有生物学性状, 但与当年的白藓实生苗相比, 试管苗移植后的前
70d生长较慢 、植株较小, 后期叶色浓绿 、生长非常旺盛而整齐 , 根
系发达(相当于实生苗的 1.5 ～ 2倍), 移植苗当年可正常开花结
实。
4　讨论
本研究以无生长点嫩茎为材料建立起白藓的无性系。这说
明白藓的非分生细胞和组织也具有全能性。
用愈伤组织的继代培养的方法进行繁殖 , 45 d的增殖系数为
28.5。按照这个速度计算 , 每年的繁殖数量为 28.58个;用不定
芽分化继代的方法进行繁殖 , 平均 40 d能培养 5.4个不定芽。
按照这个速度计算 ,每年的繁殖数量为 5.49个;用生根继代的方
法进行繁殖 , 25 d的繁殖系数为 3.1。按照这个速度计算 , 每年
的繁殖数量为 3.114.6个。上述计算结果证明:无论采用上述哪种
方法进行繁殖 , 每年都能繁殖出大量的试管苗 , 满足人们生产对
大量种苗的需要 ,但由于采用生根继代的方法繁殖的试管苗生长
旺盛 、没有无效苗。所以 , 生产上应采用生根继代的方法繁殖白
藓试管苗。
现在许多研究指出 ,通过继代培养的愈伤组织分化的试管苗
容易发生变异 [ 11 ～ 12] , 但在本研究中由白藓无生长点嫩茎愈伤组
织诱导培养的的试管苗不仅保持了白藓的所有生物性状 ,并且试
管苗长势旺盛而整齐。这可能是由以下原因引起的:一是本研究
的环境较为稳定 ,不易使培养材料发生变异;二是白藓本身具有
稳定的遗传性 ,不易受到培养环境的影响发生变异。这说明通过
白藓嫩茎诱导的愈伤组织建立的无性系能够对其进行种质保存。
参考文献:
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.2 时珍国医国药 2010年第 21卷第 2期
国药鉴别
利心丸中生地黄的薄层色谱鉴别
张绍轩1 ,张红岩 2 ,司云珊2 ,陈　桐 3 ,张　本 2
(1.吉林大学再生医学科学研究所 ,吉林 长春　130021;　2.吉林省中医药科学院 ,吉林 长春　130021;
3.长春中医药大学药学院 ,吉林 长春 130117)
摘要:目的 研究利心丸中生地黄的鉴别方法。方法 采用薄层色谱鉴别方法。结果 鉴别方法专属性强 ,灵敏度高 , 重复
性好。结论 鉴别方法简单可靠。
关键词:利心丸;　生地黄;　薄层色谱
中图分类号:R282.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)02-0506-01
　　继利心丸中牡丹皮及防己的薄层色谱鉴别 [ 1]研究之后 ,我
们又对制剂中的生地黄进行了薄层色谱鉴别实验 ,其结果如下。
1　仪器与材料
台式自动离心机 ,型号 800, 功率 30W, 金坛市环保仪器厂生
产;超声清洗仪 , KQ-250型 , 功率 250W, 昆山市超声仪器有限
公司生产。
利心丸由吉林特研药业有限公司生产 (批号 20060202,
20060703, 20070101)。对照药材由中国药品生物制品所提供。
所用化学试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备 取利心丸 20.0g,剪碎 ,置烧瓶中 , 加温
水 100 ml,搅拌至样品均匀散开 , 煮沸 10 min, 除去液面油状悬浮
物 , 放冷 ,离心(4 000 r/min)10 min, 药渣再用上述方法处理两
次 , 离心 ,上清液弃去 , 药渣蒸干 , 研细 , 置干燥锥形瓶中 , 加环己
烷 10ml, 时时振摇 1h,放置 12 h, 滤过 , 滤液弃去 , 滤渣挥干 ,加
醋酸乙酯 15ml, 超声处理 30min,滤过 , 滤液蒸干 ,残渣加三氯甲
烷 0.5 ml使溶解 ,作为供试品溶液。
2.2　对照药材溶液的制备 取生地黄对照药材 3.0 g,同供试品
溶液的制备方法制成对照药材溶液。
2.3　阴性对照液的制备 按处方比例 , 称取除生地黄以外的其余
药材 7.0 g,并按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.4　薄层层析 照薄层色谱法实验 [ 2] , 吸取供试品溶液及阴性
对照液各 15μl, 对照药材溶液 10μl,分别点于同一以 0.5%羧甲
基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G薄层板上 ,以环己烷 -醋酸乙酯
-冰醋酸(10:4:0.8)为展开剂 , 展开 , 取出 , 晾干。供试品色谱
中 , 在与生地黄对照药材色谱相应的位置(Rf值约 0.53)上 ,显一
相同的棕色主斑点 , 而阴性对照液在相应的位置上不显该斑点。
收稿日期:2009-04-15;　修订日期:2009-07-24
作者简介:张绍轩(1966-),男(汉族),吉林长春人 ,现任吉林大学再生医
学科学研究所副教授 ,博士学位 ,主要从事中药新药研究与开发工作.
见图 1。
1～ 3.利心丸供试品　4.地黄对照药材　 5.阴性对照品
图 1　生地黄的 TLC图谱
3　讨论
生地黄的薄层色谱鉴别方法专属性强 ,灵敏度高 , 重复性好 ,
可用于利心丸中生地黄的鉴别。
样品处理过程中的关键步骤说明:
将利心丸剪碎 ,加水煮沸并除去液面的油状悬浮物的目的有
二:①除去制丸时蜂蜜中的转化糖 , 以免层析时产生干扰;②除去
貂心中的油脂及蜜丸成型过程中所用的润滑剂(由蜂蜡与麻油
制成)[ 3] ,以免其溶入醋酸乙酯 , 给薄层色谱带入更多的杂质斑
点。
对水煮后放冷的水溶液曾采用布氏漏斗减压抽滤方法分离
沉淀 , 但用时过长 , 且容易造成药渣损失。改用离心方法解决了
上述问题。
参考文献:
[ 1 ] 　张绍轩 ,杨　军 ,王学农 , 等.利心丸中牡丹皮及防己的薄层色谱
鉴别 [ J] .时珍国医国药, 2009, 20(2):432.
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[ 8] 　汤行春 ,刘幼琪.金缘连翘的组织培养 I-愈伤组织诱导和培养条
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[ 12]　王国平 ,洪　霓.果树的脱毒与组 织培养 [ M] .北京:化学工业出
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