全 文 ：Vol.25 No.2
Dec.2008
第 25卷 第 2期
2008年 12月
桉树科技
EUCALYPT SCIENCE ＆ TECHNOLOGY
邓恩桉组织培养体系的建立与优化
饶红欣 ,彭信海 ,陈 灵 ,罗先权 ,夏晓敏
(湖南省森林植物园 , 湖南 长沙 410116)
摘要:对邓恩桉组织培养体系的建立以及继代和生根过程中培养基的正交试验优化筛选等方面进行了研究 , 结果
表明:初接种时 ,不同无性系邓恩桉芽的诱导以及愈伤组织的诱导情况均有较大差异 , MS +BA 0.2mg ·L -1 +IBA
1.0 mg ·L-1为最适于接种诱导的培养基;继代培养过程中 BA为芽增殖系数最主要的影响因子 , IBA为苗高生长最
主要的影响因子 , MS+BA 0.5mg ·L -1 +IBA 1.0-1.5 mg ·L-1 +蔗糖 30 g ·L -1为理论最佳继代培养基配方;生
根培养过程中 , 探讨了使用不同的生长激素和营养素配比构成的混合物①、混合物②和混合物③对生根的影响 , 其
中混合物①为生根率及发根根数最主要的影响因子 ,混合物①2mg ·L -1+混合物②125ml· L-1或 250 ml·L -1+混
合物③1.5 mg· L-1为理论最佳生根培养基配方 。以相应的理论最佳培养基配方为基础 , 根据实际生长情况对培养
基配方作进一步的优化调整 ,邓恩桉试管苗继代增殖系数可达 4.5以上 ,生根率可达 80%以上 。
关键词:邓恩桉;组织培养;正交试验
中图分类号:S772.3+7 文献识码:A
Establishmentand Optimization of Eucalyptus dunnii Tissue Culture System
RAO Hong-xin , PENG Xin-hai , CHEN Ling , LUO Xian-quan , XIA Xiao-min
(Hunan Provincial Forest Botanic Garden , Changsha 410116 , Hunan ,China)
Abstract:Researches had been done on establishment and optimization(orthogonal experiment)of E.dunnii
tissue culture system , and the results showed:different clones had different results in bud induction and cal-
lus induction , and MS+BA 0.2mg·L -1 +IBA 1.0 mg·L-1 medium was fit for the stimulation of buds;
BA and IBA acted respectively as the most important influence element for proliferate coefficient and height
growth during subpassge procedure , and MS+BA 0.5 mg·L -1+IBA 1.0 -1.5 mg· L-1+sucrose 30
g·L -1 was theoretically the most suitable medium for seedling subpassge.Mixture ①, mixture ②and mix-
ture ③were mediums composed with growth hormone and nutriment , and mixture ①acted as the most impor-
tant influence element for rooting rate and number of root during rooting procedure , and mixture ①2 mg·
L
-1+mixture ②125 ml·L-1 or 250ml· L-1+mixture ③1.5mg· L-1 was theoretically the most suitable
medium for seedling rooting.The proliferate coefficient of the in vitro seedlings was more than 4.5 and root-
ing rate could reach to more than 80%after adjusting the related theoretically most sui table medium.
Key words:E.dunnii;tissue culture;orthogonal experiment
收稿日期:2008-11-12
基金项目:国家农业成果转化基金“邓恩桉耐寒优株组培无性系转化与应用”(2006Gb2D200213)项目的部分研究内容
作者简介:饶红欣(1970 — ),女 , 副研究员 , 主要研究方向:植物组织培养和林木育种研究
E-mail:zwyrhx@163.com
邓恩桉(Eucalyptus dunnii)系桃金娘科桉树属树
种 , 原产地澳大利亚 , 邓恩桉不仅具有许多优良经
济性状 , 还具有耐寒的生态特性。通过在我国湖南 、
广西和江西等地的试验结果证明邓恩桉耐寒性强 、
生长速度快 、干形优 [1] , 湖南株洲 10年生邓恩桉承
受了-7.9℃低温的考验 [ 2 ] , 是湖南省最有前途的
表 1 不同培养基初接种诱导效果的比较
抗寒速生桉树种之一 [ 3-4]。然而邓恩桉的分布有限 ,
产种量不多 ,种子价格非常昂贵 ,而目前国内还不能
生产邓恩桉种子 , 为此进行邓恩桉组培繁殖很有必
要。目前邓恩桉组织培养存在增殖系数不高 、难生根
等问题 ,本文建立了邓恩桉的离体培养体系 ,并对增
殖和生根培养基进行了优化筛选 , 为邓恩桉以及其
它耐寒桉树的无性快繁工厂化育苗提供了有力的理
论与实践基础。
1 材料与方法
1.1 材料
剪取湖南省森林植物园苗圃内 1年生邓恩桉优
良无性系扦插苗的半木质化枝条 , 以枝条上顶芽或
腋芽为外植体。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒及诱导
枝条用自来水反复清洗30 min后 ,用0.25%Hg-
Cl2消毒12 min , 之后分别用1%氯化钙和无菌水浸洗
3次 ,每次5 min。经消毒的枝条 ,在超净工作台上剪
切成带1个腋芽或顶芽的茎段 , 接种于诱导培养基 。
1.2.1.1 不同培养基诱导效果的比较试验
接种邓恩桉优良无性系 1号的茎段至不同配方
的培养基 , 先暗培养一周 , 30 d时统计外植体芽和
愈伤组织诱导率 。
1.2.1.2 不同无性系诱导效果的比较试验
接种邓恩桉优良无性系 1号 、2号 、3号 、4号 、5
号的茎段至 MS+BA 0.2 mg· L-1+ IBA 1 mg ·L -1
培养基 ,先暗培养一周 , 30 d时统计外植体芽和愈伤
组织诱导率。
1.2.2 继代培养基的优化
以 MS为基本培养基 , 将 BA 、 蔗糖 、 IBA 、KT
作为 4个试验因素 ,每因素设 3个水平 ,设计 L9(34)
正交试验 , 共 9个处理 , 每处理放入 60个邓恩桉优
良无性系 1号的不定芽。30 d左右统计增殖系数 、平
均苗高等生长情况 , 筛选最适继代培养基及激素配
比。
1.2.3 生根培养基的优化
使用不同的生长激素和营养素配比配制混合物
①、混合物②和混合物③, 并将此 3种混合物作为 3
个试验因素 ,每因素设 4个水平 ,设计了 L16(45)正交
试验 ,共 16个处理 。将长度为 1 cm左右的邓恩桉优
良无性系 1号的芽苗放入以上生根处理中 , 每处理
放入 60个不定芽。20 d左右统计生根率 、发根数量
等生长情况 ,筛选最适生根培养基 。
1.2.4 培养基及培养条件
培养基琼脂含量 0.7% , 蔗糖 3.0% , pH值为
5.8;培养温度 24-28℃, 光照强度 2000-3000
LUX ,每天光照时数 14 h。
2 结果与分析
2.1 外植体的诱导
初接种 15 d左右腋芽或顶芽开始萌发(图 1)。
从表 1可见 , ①-⑤号培养基均成功诱导出了芽
和愈伤组织 , 芽诱导率在 10.0%-55.2%之间 , 愈
培养基编号 培养基配方(mg· L-1) 接种数 芽诱导率(%) 愈伤组织诱导率(%)
① MS+BA 0.2 70 35.7 31.4
② MS+BA 0.2+IBA 1.0 123 55.2 44.7
③ MS+BA 0.2+IBA 1.0+NAA 0.2 40 22.5 80.0
④ MS+BA 0.5+NAA 0.1 40 10.0 27.5
⑤ MS+BA 0.5+NAA 0.2 40 25.0 20.0
2 桉 树 科 技 第 25卷
图 1 邓恩桉初接种芽萌发
伤组织诱导率在 20.0%-80.0%之间 , 其中②号培
养基(MS+BA 0.2 mg·L -1 +IBA 1.0 mg·L -1)的
芽诱导率最高为 55.2% , 生长势最好 , 其愈伤组织
虽诱导率较高 , 但愈伤组织中未分化出丛生芽 , 试
管苗仍能保持无性系的优良特性 , 因此认为②号培
养基是最适的接种诱导培养基。
从表 2可见 , 参试的 5个无性系中 , 芽的诱导
率在 9.1%-55.2%, 愈伤组织诱导率在 0-100%
之间 , 不同无性系间的芽诱导以及愈伤组织诱导情
况差异较大。在初接种的一个月里 , 大多数无性系
愈伤组织生长较慢 , 但在 3号无性系中 , 由于愈伤
组织生长较快而将已萌发的腋芽包埋 , 从而导致芽
死亡的现象。
2.2 继代培养基的优化
为了直观判断所研究的 4种因素对继代增殖
影响程度的相对大小 , 分别计算出各列的极差 , 得
到各因素的主次顺序 (R值), 从直观上判断各因素
对试验结果的影响程度。如表 3 ,对邓恩桉芽增殖系
数影响的主次顺序由大到小依次为:A(BA)> D
(KT)>C(IBA)>B(蔗糖), A1B2C2D1为芽增殖的理
论最佳培养基配方 , 即MS+BA 0.5 mg·L -1 +IBA
1.0 mg·L -1 +蔗糖 30 g·L -1。对邓恩桉苗高生长
影响的主次顺序由大到小依次为:C(IBA)> D
(KT)> A(BA)> B(蔗糖), A1B2C3D1为苗高生长的
理论最佳培养基配方 , 即 MS+BA 0.5 mg· L -1+
IBA 1.5 mg· L -1+蔗糖 30 g·L -1。 因此 MS+BA
0.5 mg· L -1+ IBA 1.0-1.5 mg· L -1 +蔗糖 30
g·L -1为理论最佳继代培养基配方。
2.3 生根培养基的优化
试管苗接种 7 d后 ,基部膨大 ,出现愈伤组织 , 15
表 2 不同无性系诱导效果的比较
图 2 邓恩桉继代培养
无性系编号 接种数芽 诱导率(%) 愈伤组织诱导率(%) 愈伤组织大小
1号 123 55.2 44.7 中
2号 55 54.5 36.3 小
3号 24 12.5 100 大
4号 22 9.1 0 -
5号 49 40.8 6.1 小
第 2期(总第 73期) 饶红欣等:邓恩桉组织培养体系的建立与优化 3
表 3 BA 、蔗糖 、 IBA和 KT对无性系 1号继代的影响
表 4 混合物①、混合物②和混合物③对生根的影响
因素 A 因素 B 因素 C 因素 D
BA(mg ·L -1) 蔗糖(g· L-1) IBA(mg· L-1) KT(mg ·L -1)
平均苗高
(cm)
增殖系数 4.03 3.40 3.43 3.97平均苗高(cm) 2.94 2.89 2.43 3.01
增殖系数 3.40 3.80 3.83 3.37平均苗高(cm) 2.85 2.90 2.82 2.67
增殖系数 3.20 3.43 3.37 3.30平均苗高(cm) 2.87 2.88 3.41 2.98
增殖系数 0.83 0.40 0.47 0.67平均苗高(cm) 0.10 0.02 0.98 0.34
K1
K2
K3
R
处理号/指标 增殖系数
因素 A 因素 B 因素 C
混合物①(mg ·L-1) 混合物②(ml ·L-1) 混合物③(mg ·L -1)处理号/指标 生根率(%) 发根数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0.5 1000 0.5 0 0
0.5 500 1.0 0 0
0.5 250 1.5 16.67 3.11
0.5 125 2.0 13.33 1.00
1.0 1000 1.0 30.00 1.53
1.0 500 0.5 13.33 1.33
1.0 250 2.0 15.00 0.83
1.0 125 1.5 23.33 1.00
1.5 1000 1.5 33.33 1.11
1.5 500 2.0 25.00 0.92
1.5 250 0.5 30.25 2.07
1.5 125 1.0 32.04 1.50
2.0 1000 2.0 33.33 4.80
2.0 500 1.5 48.33 2.49
2.0 250 1.0 51.67 2.90
2.0 125 0.5 45.00 2.38
7.500 24.165 22.145
1.028 1.860 1.445
20.415 21.665 28.428
1.173 1.185 1.483
30.155 28.398 30.415
1.400 2.228 1.928
44.583 28.425 21.665
3.143 1.470 1.888
37.083 6.760 8.750
2.115 1.043 0.483
生根率(%)
发根数
生根率(%)
发根数
生根率(%)
发根数
生根率(%)
发根数
生根率(%)
发根数
K1
K2
K3
K4
R
0.5 15 0.5 0 4.2 2.61
0.5 30 1.0 1.0 4.4 2.67
0.5 45 1.5 1.5 3.5 3.55
1.0 15 1.0 1.5 3.3 2.88
1.0 30 1.5 0 3.9 3.5
1.0 45 0.5 1.0 3.0 2.16
1.5 15 1.5 1.0 2.7 3.17
1.5 30 0.5 1.5 3.1 2.52
1.5 45 1.0 0 3.8 2.92
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4 桉 树 科 技 第 25卷
(Ⅰ) (Ⅱ)
图 3 邓恩桉生根培养
d后不定根从愈伤组织长出 。在试验设计的 16个处
理中 , 各处理的生根率 、 平均发根数均有较大的差
别 ,各处理对邓恩桉试管苗生根影响见表 4。
为了研究 3种因素对生根的影响程度 , 分别计
算极差 , 结果对邓恩桉生根率影响的主次顺序由大
到小依次为:A(混合物①)>C(混合物③)>B(混合
物②), A 4B4C3为提高生根率的理论最佳培养基配
方 , 即混合物①2 mg ·L -1 +混合物②125 ml· L-1
+混合物③1.5 mg ·L-1 。 对邓恩桉发根数影响的
主次顺序由大到小依次为:A(混合物①)> B(混合
物②)> C(混合物③), A 4 B3C3为提高发根根数的
理论最佳培养基配方 ,即混合物①2 mg ·L-1 +混合
物②250 ml·L-1+混合物③1.5 mg·L -1。因此 , 混
合物①2 mg ·L -1+混合物②125 ml·L -1或 250 ml ·
L -1+混合物③1.5 mg· L-1为理论最佳生根培养基
配方。对生根影响因子进行方差分析得出表5 , 由
表5可知:混合物①对生根率的影响达到极显著水
平 ,说明混合物①对邓恩桉试管苗的生根有重要作
用。
混合物①
混合物②
混合物③
误差
F0 .05(3 , 6)=4.76
F0 .01(3 , 6)=9.78
表 5 生根正交方差分析表
试验因素 指标 平方和 自由度 均方 F 值 F 临界值
生根率 2942.246 3 980.749 21.470 **
发根数 11.602 3 3.867 2.880
生根率 133.337 3 44.446 0.973
发根数 2.485 3 0.828 0.617
生根率 234.337 3 78.112 1.710
发根数 0.794 3 0.265 0.197
生根率 274.079 6 45.680
发根数 8.057 6 1.343
第 2期(总第 73期) 饶红欣等:邓恩桉组织培养体系的建立与优化 5
6 桉 树 科 技 第 25卷
3 结论与讨论
(1)初接种时 ,不同无性系邓恩桉芽的诱导以及
愈伤组织的诱导情况均有较大差异 , MS+BA 0.2
mg ·L-1 +IBA 1.0 mg·L -1为最适于接种诱导的培
养基;继代培养过程中 BA为芽增殖系数最主要的影
响因子 , IBA为苗高生长最主要的影响因子 , MS+
BA 0.5 mg ·L -1+IBA 1.0-1.5 mg ·L -1 +蔗糖 30
g ·L-1为理论最佳继代培养基配方;生根培养过程
中 , 其中混合物①为生根率及发根根数最主要的影
响因子 , 混合物①2 mg ·L -1 +混合物② 125 ml·
L
-1或 250 ml· L-1+混合物③1.5 mg· L -1为理论
最佳生根培养基配方 。
(2)继代培养过程中 , BA浓度超过 1.0 mg·L -1
时 ,邓恩桉试管苗分化出的芽小且密 ,有效芽明显减
少 ,叶片变小 ,出现较严重的玻璃化现象 ,因此 BA的
浓度控制在 1.0 mg· L-1以下比较适合邓恩桉继代
丛生苗的生长。同时 ,随着继代次数的增多 ,玻璃化
现象会增多 ,这可能是因为 BA随着继代次数的增多
在试管苗中逐渐积累的结果 ,此时可适当降低 BA的
浓度。
(3)邓恩桉试管苗生根培养过程仍存在一些问
题需要解决 。例如 ,部分根系是从试管苗的基部或叶
背的愈伤组织中长出 , 而不是直接从试管苗的基部
长出 , 而这些愈伤组织会阻滞上下之间的畅通 , 导
致发出的根和茎之间无维管组织的直接联系 , 养分
水分上下之间运输困难[ 5-6] , 造成移栽成活率低。
(4)以相应的理论最佳培养基配方为基础 ,根据
实际生长情况对培养基配方作进一步的优化调整 ,
邓恩桉试管苗继代增殖系数可达 4.5以上(图 2),生
根率可达 80%以上(图 3)。
参考文献
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