全 文 ：收稿日期:2010-09-01; 修订日期:2011-01-24
基金项目:福建省科技厅青年人才创新基金(No.2008F3051);
福建省教育厅科研项目(No.JA08133);
福建省中西医结合老年性疾病重点实验室开放课题·陈可冀
中西医结合发展基金(No.2008J1004-43CKJ2008080);
陈可冀中西医结合发展基金(No.CKJ2008036zyx200812)
作者简介:陈 红(1977-),女(汉族),河南许昌人 ,现任福建中医药大学
副教授 ,博士学位 ,主要从事中药炮制与中药化学教学科研工作.
闽产砂仁中黄曲霉毒素 B1 的含量测定及限量制定
陈 红 ,程再兴 ,唐吉鹤
(福建中医药大学 ,福建 福州 350108)
摘要:目的 对闽产 21批次砂仁中黄曲霉毒素 B1的含量进行测定 , 并初步制定其限量标准。方法 间接竞争酶联免疫吸
附法(ELISA法)。结果 被测样品均有不同程度的污染黄曲霉毒素 B1(AFB1), 并且在贮藏过程中有发霉现象者含量较
高。结论 建立中药长泰砂仁的黄曲霉毒素 B1含量限度标准非常必要。
关键词:砂仁; 黄曲霉毒素 B1; ELISA试剂盒DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805, 2011.08.033
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)08-1879-01
闽产砂仁(FructusAmomi)是阳春砂的变异品种 , 为传统的
名贵中药材 , 味辛 , 性温 , 归脾 、胃 、肾经 , 具有行气化湿 、温脾止
泻 、安胎等功效 ,为临床常用中药。福建为亚热带湿润季风气候 ,
中药在运输 、炮制 、贮藏过程中极易发生霉变而产生毒性强烈的
黄曲霉毒素 B1(AFB1), 严重危害用药者的健康 , 甚至生命。因
此 , 为保证中药用药的安全 , 定量检测中药长泰砂仁中的 AFB1
并制定其限量标准具有极为重要的意义。
1 仪器与试药
酶联免疫测定仪(BioRad-680), 隔水式电热恒温培养箱(上
海跃进医疗器械厂 PYX-DHS-40×50-BS-Ⅱ)。 AFB1(ELISA)
检测试剂盒(无锡市艾赛生物技术有限责任公司 批号 20090305),
甲醇 、石油醚均为分析醇。闽产砂仁药材为 2008-11采购于福建
长泰县不同地方药材 ,广东阳春砂 、云南砂仁、海南砂仁均为市售
通货 ,除广东阳春砂及建(土)砂仁采购时为种子团外 , 其他批次均
为带壳砂仁, 测定时分为种子团及壳分别测定。
2 方法与结果
2.1 原理 将固相 AFB1复合抗原预先包被在酶标板上 , 使用时
加入 AFB1抗体和样品提取液 , 使固相抗原和样品提取液中的AFB
1
竞争性地与 AFB
1
抗体结合。样品提取液中的 AFB
1
与定
量特异性抗体反应 , 多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结
合 , 加入酶标记物和底物后显色 , 所显颜色的深浅与样品提取液
中的 AFB
1
含量成反比。最后与 AFB
1
的标准曲线比较测定含
量。
2.2 供试品处理 样品粉碎过 20目筛 , 称取约 5.0 g于 100 ml
具塞三角瓶中 , 加入 25.0 ml甲醇水(1∶1)溶液和 20 ml石油醚
(30 ～ 60℃), 振摇 10 min, 过滤于分液漏斗中 , 静置分层 , 放出下
层甲醇水提取液 , 此液为样品提取液 , 根据样品的国家允许量标
准 , 用 A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释(根据样品的
国家允许量标准)即为供试品。本实验取 0.1 ml的样品液 , 加
0.3 ml样品稀释液得供试品 ,即稀释倍数 D值为 4。
2.3 试剂的配制 每瓶 C试剂(酶标抗原)中准确加入 1.5 mlD
试剂(酶标抗原稀释液), 充分溶解 , 配成实验用酶标抗原溶液 , 2
～ 8 ℃保存。
取 4 mlE试剂(浓缩洗涤液),加 76 ml蒸馏水 , 混匀后制成
试验用洗涤液待用。
2.4 ELISA测定 ①试剂平衡:将试剂盒于室温中放置 15min以
上 , 平衡至室温;②小孔编号:设定 1号孔为仪器调零孔 , 2 ～ 7号
孔为 AFB1标准对照孔 , 其余孔为样品孔;③洗涤:重复洗板两
次;④反应组成见表 1;⑤反应:将反应板放入 37℃恒温培养箱中
孵育 30min;⑥洗涤:取出反应板 , 用力甩掉反应液 , 拍干。重复
洗板 4次;⑦显色:每孔分别加入 F试剂(显色底物 a)和 G试剂
(显色底物液 b)各 50 μl, 摇匀后将反应板放入 37℃恒温培养箱
中显色 15min;⑧终止与仪器测定:每孔分别加入 H试剂(终止
液)各 50 μl, 摇匀后用酶标仪在 450 nm波长处测定各孔吸光度
A值。
表 1 反应组成
操作
次序
加入
量
孔号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 50μl A 0 0.1 0.25 0.5 1 2 … …待测样液… …
2 50μl D C C C C C C C C C C C
3 混匀
2.5 样品定性判断 目测时 , 反应除空白孔为无色 , 其余各孔均
呈现不同程度的蓝色 ,与阳性对照孔(AFB1标准溶液 0.1ng/ml)
对照 , 颜色比阳性对照孔深者为阴性;颜色比对照孔浅者为阳性;
颜色与对照孔接近者与阳性对照孔比较吸光度 A值(0.426)来
判定其是否呈阳性 , 若其 A> A阳性对照 , 则为阴性;若其 A
绘制成标准曲线。以标准溶液浓度的常用对数值(lgC)为横坐
标 , 以标准液孔 A值与 0 ng/ml标准液孔的 A值的比值(A标准
液 /A(0 ng/ml))为纵坐标 ,得回归方程为:Y=-48.117X+40.883, r=0.999 8(有关数据见表 2,标准曲线见图 1)根据标准曲线可计
算得到相应待测样液的 AFB1的浓度(C)的常用对数值 LgC, 对
其求反对数 ,可求得待测样液 AFB
1
的浓度(C)。再按公式①计
算出样品中 AFB1的含量。结果见表 3。AFB1的含量(ng/g)=V/m×C×D………①式中:V样品提
取液体积(ml);m样品质量(g);C待测样液中 AFB1的含量(ng/ml);D样品稀释倍数。
表 2 AFB1标准曲线数值
编号 C/ng· ml-1 A A/ A0(%) LgC
1 0 0.60 - -
2 0.10 0.54 88.60 -1.00
3 0.25 0.43 70.50 -0.60
4 0.50 0.34 55.50 0.30
5 1.00 0.24 40.30 0
6 2.00 0.16 26.50 0.30
A0即为 1号标准品的 A值
3 讨论
含量定性结果显示 ,砂仁中含有一定量的 AFB1 , 但通过测定
吸光度 , 证明样品吸光度值超过阳性吸光度值 , 说明砂仁中 AFB1
含量均小于 5 μg· kg-1 , 此限度标准是国家食品标准 , 因此砂仁
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8 时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期
AFB1限度标准可与食品标准通用 , 即 AFB1的含量限度标准初
步确定为≤5 μg· kg-1 ,与食品 AFB1限度相同 [ 1] 。
图 1 AFB1标准曲线
表 3 各批次中药砂仁的 AFB1含量 ng· g-1
编号 药物来源 阳性 A1 A2 A3 A均值 含量
1 长泰县吴田山 - 0.598 0.556 0.577 0.577 -
1 长泰县聚善堂药店 - 0.499 0.452 0.463 0.471 -
3 长泰县文昌门诊 - 0.687 0.648 0.666 0.667 -
4 长泰县泰兴门诊 - 2.815 2.760 2.728 2.768 -
5 长泰砂仁基地 + 0.140 0.162 0.114 0.139 139.93
6 云南砂仁 - 3.253 3.262 3.244 3.253 -
7 海南砂仁 - 3.237 3.087 3.069 3.131 -
8 广东砂仁 + 0.190 0.150 0.165 0.168 139.61
9 建(土)砂仁 - 3.256 3.282 3.230 3.256 -
10 长泰县药监局 - 1.034 0.991 1.004 1.010 -
11 长泰县吴田山(壳) + 0.220 0.244 0.195 0.220 139.03
12 长泰县聚善堂药店(壳) + 0.397 0.355 0.374 0.375 137.34
13 长泰县文昌门诊(壳) - 0.621 0.583 0.598 0.601 -
14 长泰县泰兴门诊(壳) + 0.283 0.236 0.248 0.256 138.64
15 长泰砂仁基地(壳) + 0.182 0.181 0.182 0.182 139.45
16 云南砂仁(壳) + 0.176 0.151 0.159 0.162 139.67
17 海南砂仁(壳) + 0.162 0.137 0.149 0.149 139.82
18 长泰县药监局(壳) + 0.395 0.358 0.375 0.376 137.33
黄曲霉毒素毒性极强 ,被国际癌症研究机构确定为 I类致癌
物 [ 2] , 是目前发现的真菌类毒素中毒性最大 、污染范围最广的毒
素之一 , 其毒性比氰化钾大 10倍 , 是砒霜的 68倍 , 诱发肝癌的能
力比二甲基亚硝胺大 75倍 [ 3, 4] , 它对食物和饲料的污染已引起
人们的广泛重视。本次实验结果表明 ,与砂仁对应来源的砂仁壳
中 AFB1检测到的比例较大 ,说明砂仁壳较种子团易被黄曲霉毒
素 B1污染 , 在砂仁的采集 、干燥 、运输及市场的其他流通中应注
意尽量避免 AFB1的污染 ,以确保砂仁临床使用的安全 、稳定 、有
效。
对于中药饮片制定黄曲霉毒素 B1的限度标准 , 尚未有明确
规定 , 本文采用间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)为生物化学
法 , 用于中药饮片中 AFB1的定性 、半定量测定 , 其特异性强 , 操
作简单 ,分析速度快 , 污染小 , 简化了提取和纯化步骤 , 结果易判
断。
参考文献:
[ 1 ] 张振凌 ,陈 红 ,石延帮.不同牛膝饮片黄曲霉毒素 B1含量比较和
限度的确定 [ J] .中成药, 2005, 27(5):612.
[ 2 ] ElisabeteYS, MarioA, FabiaY, eta1.Evluationoffumonisin-afla-
toxincooccurenceinBraziliancornhybridsbyELISA[ J] .FoodAddit
Contam, 2001, 18(8):719.
[ 3 ] PatriciaA, JinBW, ZhuYR, eta1.Chlorophylininterventionreduces
aflatoxinDNAadductsinindividualsathighriskforlivercancer[ J] .
ProcNatlAcadSciUSA, 2001, 98(25):14601.
[ 4 ] 何学超 , 冯永建 ,郭道林 , 等.黄曲霉毒素 B
1
液相色谱法检测技术
比较分析 [ J] .粮食储藏, 2008, 5:36.
收稿日期:2010-09-07; 修订日期:2011-02-10
基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项
(No.06-07ZQ09);
广西壮族自治区科技成果转化与应用(No.099801-20)
作者简介:施力军(1979-),男(壮族),广西邕宁人 ,现任广西药用植物园
技术员 ,硕士学位 ,主要从事药用植物栽培及生理研究工作.
＊通讯作者简介:马小军(1958-), 男(回族),北京人 ,现任广西药用植物
园研究员 ,博士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事生药学研究工作.
多效唑(PP333)对蔓性千斤拔光合作用相关因子的影响
施力军 1 ,周凤珏3 ,马小军 1, 2＊ ,冯世鑫1 ,柯 芳 1 ,骆少波4 ,罗荣胜 4
(1.广西壮族自治区药用植物园 ,广西 南宁 530023;
2.中国医学科学院 -中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京 100094 ;
3.广西大学农学院 ,广西 南宁 530005;4.广西钟山县科技局 542600)
摘要:目的 研究 PP333喷施处理对蔓性千斤拔光合因子的影响。方法 用不同浓度 PP333处理 ,研究其对蔓性千斤拔光
合相关因子的影响。结果 经多效唑处理可提高叶片叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素及总叶绿素含量 , 同时可提高叶片净
光合速率 , 降低叶片蒸藤速率 、胞间 CO2浓度及气孔导度。结论 PP333处理可有效改善蔓性千斤拔光合特性。
关键词:多效唑(PP333); 蔓性千斤拔; 光合作用
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805, 2011.08.034
中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)08-1880-03
蔓性千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔 Moghaniaphilippinensis
(Merr.etRolfe)Li.[ 1] 。药用部位为根 , 其味甘 、微涩 、性平 , 具有
壮腰健肾 、除风利湿 、活血通络 、消瘀解毒等功效 , 主治风湿骨痛 、
腰肌劳损 、慢性肾炎 、跌打损伤 、痈肿 、偏瘫 、阳痿 、妇女白带多等
症。目前被广泛用于妇科 、风湿痹痛等类型的中药生产 , 如妇科
千金片 、金鸡冲剂 、金鸡胶囊 、补血调经片壮腰健肾丸 、活络止痛
丸 、复方海蛇酊 、复方挫伤灵 、脑萎缩丸等 [ 2] 。
多效唑是 20世纪 70年代末推出的一种高效低毒的植物生
长物质 ,代号为 PP333, 属于三唑类植物生长调节剂。国内外对
PP333的应用报道不少 ,在大豆 [ 3] 、花生 [ 4 , 5]等作物上已有不少研
究。 PP333应用于珐菲亚 [ 6] 、人参 [ 7]等药用植物 , 可提高叶片叶
绿素含量和光合速率 , 提高产量 , 改善品质。但尚未见到 PP333
应用于蔓性千斤拔的报道。本文试验用不同浓度 PP333溶液喷
施处理蔓性千斤拔植株以探讨其对叶片光合相关因子的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料 供试药品:江苏建湖农药厂生产的 15%多效唑
可湿性粉剂。 供试材料:蔓性千斤拔 Moghaniaphilippinensis
(Mer.etRolfe)Li。
1.2 试验设计 试验于 2008年在广西壮族自治区药用植物园试
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8