全 文 ：中国农学通报 2011,27(31):18-22
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
擎 天 树 (Shorea wantianshuea) 为 龙 脑 香 科
(Dipterocarpaceae)柳桉属植物，大型乔木，其树高可达
70 m以上，是20世纪70年代发现的一个新种。目前，
在中国的分布仅限于云南和广西热带季节雨林海拔
1000 m以下的湿润沟谷[1]，是典型的热带季雨林的上
层优势树种[2]，是国家1级珍稀濒危保护植物。擎天树
树干通直圆满，生长快、出材率高，是优良的工业用材
树种，可用作桥梁、建筑、车船、家具、室内装修等材料，
因此具有较高的经济价值[3]。但是，该树种天然更新
较差，结实周期长，使得擎天树大面积推广有一定的局
限性。随着经济开发和人为干扰，擎天树生境逐渐丧
失和破碎化，使其生长、更新受到阻碍，甚至陷入濒危
的境地。因此，深入研究其种子、幼苗繁育技术对保护
这一珍稀濒危树种资源具有重要意义。
国内对擎天树生长规律及其种苗生长方面有少量
报道，闫兴富等[1]研究发现，擎天树种子的顽拗性和低
成活率，以及幼苗生长缓慢都是其致危的重要原因；殷
寿华等 [4]报道，擎天树在森林生境中的萌发率只有
68.9%，且其种子萌发形成幼苗仅有相当于种子数
基金项目：广西林业厅科技项目(桂林科字201019)；国家高等学校特色专业建设项目(TS1Z097l)。
第一作者简介：韦凤娟，女，1989年出生，广西横县人，在读本科，研究方向：林学。E-mail：xwfjuan@163.com。
通讯作者：杨梅，女，1971年出生，吉林长春人，副教授，博士，主要从事人工林培育方面的教学与科研工作。通信地址：530004南宁市大学东路100
号广西大学林学院，E-mail：fjyangmei@126.com。
收稿日期：2011-06-29，修回日期：2011-10-06。
擎天树组培外植体消毒与褐化抑制的研究
韦凤娟 1，廖克波 2，杨 梅 1，戴 勤 1，俞建妹 2，梁 机 1，梁晓春 2
（1广西大学林学院，南宁 530004；2广西南宁市良凤江国家森林公园，南宁 530031）
摘 要：以擎天树种子和茎段为试验材料，探讨外植体脱毒及防褐化的方法，为建立擎天树微繁无菌体系
奠定基础。结果表明：（1）直接利用种胚作为外植体培养脱毒效果较保留种皮好，且消毒过程添加600
万单位青霉素处理，能有效降低种子培养污染率；（2）茎段外植体脱毒较困难，青霉素可在一定程度上减
低污染率，但消毒效果并不理想，且培养中出现严重褐化现象；（3）添加VC、PVP和活性炭可有效控制外
植体褐化现象，在1/2 MS培养基中添加0.2 mg/L VC、2 g/L PVP和0.5 g/L AC的效果最好。
关键词：擎天树；组织培养；消毒；褐化
中图分类号：S792 文献标志码：A 论文编号：2011-1884
Research on the Disinfection and Browning Prevention of Shorea wantianshuea Explants
Wei Fengjuan1, Liao Kebo2, Yang Mei1, Dai Qin1, Yu Jianmei2, Liang Ji1, Liang Xiaochun2
(1Forestry College of Guangxi University, Nanning 530004;
2National Forestry Park of Liangfengjiang, Nanning 530031)
Abstract: The seeds and stem segments of Shorea wantianshuea were used as explants to study the methods of
disinfection and browning prevention, which would be helpful to get sterile explants for tissue culture. The
results showed that it was better to use embryos explants than the seeds and adding in penicillin with 6 millions
units was efficient to lower down the contamination rate during disinfecting. It was difficult for stem segments
to be disinfected. Penicillin could reduce contamination rate to some extend, but the effects were not good and
there was seriously browning during disinfection. The vitamin C (VC), polyvinylpyrrolidone (PVP) and
activated carbon (AC) could reduce the browning effectively with and optimal combination 0.2 mg/L VC, 2 g/L
polyvinylpyrrolidone (PVP) and 0.5 g/L activated carbon (AC) in 1/2 MS medium with and optimal combination.
Key words: Shorea wantianshuea; tissue culture; disinfection; browning
韦凤娟等：擎天树组培外植体消毒与褐化抑制的研究
0.72%的幼苗能进入幼苗库。而自然条件下，光照、温
度和水分等因子，都很难满足擎天树幼苗林下更新的
要求[5-6]，因此种子顽拗性障碍的克服和人工繁育技术
的研究显得十分重要。本试验初次应用组织快繁技术
对擎天树种子和茎段进行培养，探索擎天树组培外植
体脱毒及抑制褐化的方法，以期为建立擎天树无菌体
系及珍稀濒危树种资源的保护和扩大繁殖提供科学依
据和前期准备。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
2010年 7月 10日—8月 2日在广西大学林学院实
验室进行。
1.2 试验材料
本试验外植体材料采于广西良凤江国家森林公
园，分别采集长势优良的擎天树当年生枝条上的种子
及带芽幼嫩茎段。采摘的种子放入样品袋中密封保
存，带回实验室后用纱布包好放入冰箱4℃保存；茎段
放入装有1%多菌灵溶液的塑料桶中保存，并盖上遮阴
布防止样品失水，带回实验室后立刻进行处理。
1.3 试验方法
1.3.1 外植体准备
（1）种子外植体。取成熟、饱满的擎天树种子进行
保留种皮、去除种皮 2个处理。将保留种皮的种子装
入大烧杯中，洗涤液浸泡 10 min后用毛刷刷净；去除
部分擎天树种子的种皮，将胚小心分离出来，轻轻刷洗
掉胚上黏液。2种不同处理均用自来水冲洗2~3 h后，
在超净工作台上进行消毒处理，并接入培养基。
（2）茎段外植体。修剪擎天树枝条，每个短枝带
2~3个叶芽，叶柄保留 3 mm左右，洗涤液浸泡 10 min
后用软毛刷刷净，用自来水充分冲洗2~3 h后，在超净
工作台上进行消毒处理，并接入培养基。
1.3.2 消毒条件设置 外植体材料均在无菌条件下使用
75%酒精消毒30 s，并用无菌水清洗后进行以下处理。
（1）种子外植体。①种皮对种子外植体消毒的影
响：种子外植体均进行 75%酒精 30 s + 600青霉素
30 min+0.1%升汞处理，保留种皮材料升汞消毒时间设
定为 8、10、15、20 min，剥去种皮材料升汞消毒时间设
定为8 min。消毒结束后接种于相同培养基上，第3天
开始记录污染情况。②消毒时间及抗生素对种子胚外
植体消毒效果的影响：考虑到擎天树种子多胚的幼嫩
性，试验将种胚分为小、中、大 3个等级进行不同程度
的升汞消毒处理。小胚材料分别设置 20庆大素
30 min+0.1%升汞3 min、600青霉素30 min+0.1%升汞
5 min、（400青霉素+500链霉素）30 min+0.1%升汞
7 min 等 3 种处理；中胚材料设置了 500 链霉素
30 min+0.1%升汞6 min、600青霉素30 min+0.1%升汞
8 min、（400青霉素+500链霉素）30 min+0.1%升汞
10 min、20庆大素 30 min+0.1%升汞 12 min等 4种处
理；大胚材料设置了 600青霉素 30 min+0.1%升汞
8 min、1 g/100 mL氨苄西林 30 min+0.1%升汞 12 min
等2种处理。处理后接种于相同培养基上，第5天开始
记录污染情况。
（2）茎段外植体。①消毒剂对茎段外植体消毒效
果的影响：茎段外植体使用 6%次氯酸钠+吐温 80、
0.1%多菌灵+吐温80、0.1%升汞等3种灭菌剂进行表面
消毒，并接种于1/2 MS+IBA 0.3 mL/L+6-BA 0.4 mL/L+
糖 30 g+琼脂 5 g的培养基中，第 5天开始记录污染情
况。②处理时间、消毒时间及抗生素对外植体消毒效
果的影响：茎段外植体设置为当天、2天后、7天后处理
等 3种不同处理时间，当天处理设置 0.1%升汞 4 min、
8 min及 400、600、800青霉素+0.1%升汞 4 min等 5种
消毒方式；2天后处理设置 0.1%升汞 4 min、8 min等 2
种消毒方式；7天后处理设置 600万单位青霉素
30 min+0.1%升汞4 min处理方式[7]，并接种于1/2 MS+
IBA 0.3 mL/L+6-BA 0.4 mL/L+糖30 g+琼脂5 g培养基
上，第5天开始记录污染情况。
1.3.3 抗褐化剂选择 选用VC、PVP及AC作为抗褐化
剂[8]，设置不同浓度，进行擎天树组织培养的抗褐化研
究。
（1）种胚外植体抗褐化培养基选择。以 1/2 MS+
IBA 0.3 mL/L+6-BA 0.4 mL/L为基本培养基，设置AC
0.5 g/L以及PVP 0.5g /L的 2种抗褐化物质，观察种胚
外植体褐化情况。
（2）茎段外植体抗褐化培养基选择。茎段外植体
消毒设置为600青霉素40 min+0.1%升汞4 min及600
青霉素60 min+0.1%升汞4 min 2种，青霉素40 min的
处理接种于1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+VC
0.2 mg/L+AC 0.5 g/L、SH+AC 0.5 g/L+6-BA 0.4 mg/L+
IBA 0.3 mg/L + VC 0.2 mg/L、1/2 MS + VC 0.2 mg/L +
PVP 0.1 g/L + AC 0.5 g/L的 3种培养基上，青霉素
60 min的处理接种于 1/2 MS + 6-BA 0.4 mg/L + IBA
0.3 mg/L + VC 0.2 mg/L + AC 0.5 g/L、1/2 MS + 6-BA
0.4 mg/L + IBA 0.3 mg/L + VC 0.2 mg/L、1/2 MS + VC
0.2 mg/L+PVP 2 g/L+AC 0.5 g/L的3种培养基上，观察
茎段外植体褐化情况。
1.3.4 仪器与试剂 超净工作台、高压灭菌锅、电子天平
（精度为0.001 g）、刀具；配制培养基母液所用药品、无
水乙醇均为分析纯，产于成都市科龙化工试剂厂。
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1.3.5 统计分析 统计不同外植体（种子、茎段）在不同
消毒时间、抗生素、消毒剂处理下的污染率，分析不同
处理下的最佳消毒效果。统计不同褐化剂处理下的褐
化率，通过褐化率大小的对比得出最适宜的褐化剂。
污染率为污染数与接种数的比率，褐化率为褐化数与
接种数的比率。
2 结果与分析
2.1 种子外植体消毒
2.1.1 保留种皮对种子外植体消毒的影响 采用2种种
皮处理方法及对种子不同消毒时间的处理进行试验对
比（见表 1）。结果表明，种皮的去留对种子外植体消
毒影响十分显著。直接采用胚作为外植体消毒效果最
好，最终污染率只有35.0%，保留种皮的外植体材料脱
毒相对较难。在观察过程中发现，擎天树污染迅速，种
胚为外植体的污染均为细菌性污染，而保留种皮的外
植体大部分是从外皮开始有真菌污染，说明消毒剂较
难浸入擎天树种皮的星状毛里，保留种皮不利于种子
外植体脱毒。
此外，不同时间的升汞消毒也对保留种皮材料的
脱毒效果产生一定的影响。随着升汞消毒时间的增
加，保留种皮的种子外植体污染率降低，消毒 20 min
处理污染率可减低到69.2%。
种皮处理
剥去
保留
保留
保留
保留
消毒处理
600青霉素30 min+0.1%升汞8 min
600青霉素30 min+0.1%升汞8 min
600青霉素30 min+0.1%升汞10 min
600青霉素30 min+0.1%升汞15 min
600青霉素30 min+0.1%升汞20 min
接种数/个
20
51
61
42
52
8 d
污染数/个
5
30
33
22
27
污染率/%
25.00
58.82
54.10
52.38
51.92
11 d
污染数/个
8
43
52
35
36
污染率/%
35.0
84.3
85.3
83.3
69.2
表1 保留种皮对种子外植体消毒影响的效果比较
2.1.2 消毒时间及抗生素对种子外植体消毒效果的影
响 以擎天树种胚为试验材料进行抗生素和消毒时间
影响对比。从表 2可知，在小粒胚中经过 600青霉素
30 min+0.1%升汞5 min以及（400青霉素+500链霉素）
30 min、0.1%升汞 7 min处理后脱毒率均达到 100%，
中、大粒种子在 600青霉素 30 min+0.1%升汞 8 min处
理后能达到或接近 100%。其他处理下污染的种胚大
部分有细菌污染，其中 500链霉素 30 min+0.1%升汞
6 min处理的污染率最高，达到 56.5%，青霉素+链霉
素、庆大素、氨苄西林等处理的污染率也超过10%。可
见，青霉素对控制擎天树细菌污染效果较好，尤其600
万单位浓度青霉素可达到种子外植体脱毒效果。
2.2 茎段外植体消毒
2.2.1 消毒剂对茎段外植体消毒效果的影响 擎天树形
态上具有星状毛和明显的托叶，附着其上的微生物很
难完全去除，而增加了灭菌难度。试验尝试使用不同
胚
Ⅰ小
Ⅱ小
Ⅲ小
Ⅳ中
Ⅴ中
Ⅵ中
Ⅶ中
Ⅷ大
Ⅸ大
抗生素及升汞消毒时间
20庆大素30 min+0.1%升汞3 min
600青霉素30 min+0.1%升汞5 min
（400青霉素+500链霉素）30 min+
0.1%升汞7 min
500链霉素30 min+0.1%升汞6 min
600青霉素30 min+0.1%升汞8 min
（400青霉素+500链霉素）30 min+
0.1%升汞10 min
20庆大素30 min+0.1%升汞12 min
600青霉素30 min+0.1%升汞8 min
1 g/100 mL氨苄西林30 min+0.1%升汞12 min
接种数/个
18
37
21
23
35
37
24
19
23
5 d
污染数/个
0
0
0
6
0
0
1
0
0
污染率
/%
0
0
0
26.09
0
0
4.17
0
0
8 d
污染数
/个
0
0
0
12
0
0
0
1
3
污染率
/%
0
0
0
52.17
0
0
0
5.26
13.04
11 d
污染数
/个
1
0
0
13
0
4
4
1
3
污染率
/%
5.6%
0
0
56.5
0
10.8
16.7
5.3
13.0
表2 消毒时间及抗生素对种子外植体消毒效果的比较
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韦凤娟等：擎天树组培外植体消毒与褐化抑制的研究
消毒剂对茎段外植体进行消毒对比，结果见表 3。升
汞、次氯酸钠、多菌灵等 3种消毒剂消毒效果皆不理
想，第 5天时茎段外植体的污染率分别达到 65.22%、
87.88%、100%，并还有继续污染的趋势。升汞的消毒
效果相对较好，污染相对较少，多数为细菌性污染，说
明升汞对真菌的灭菌效果显著，并且对茎段影响不是
很大，适合用作擎天树外植体的消毒。
试验中还发现 6%次氯酸钠会加速擎天树茎段的
褐化，使茎段迅速衰老，不利于组织的再培养。多菌
灵、升汞处理后茎段虽也有褐化现象，但较次氯酸钠处
理褐化速度较慢、程度较轻。
2.2.2 贮存时间及青霉素对茎段外植体消毒效果的影
响 外植体经多菌灵处理后，真菌、细菌污染的情况仍
较严重，升汞处理后真菌性污染基本可以控制，但是细
菌性污染仍然很严重。由此，从贮存时间、青霉素浓度
等方面对擎天树茎段进行处理，如表4所示，当天处理
消毒效果比较好，冷藏 2天后处理的茎段污染率皆达
到 80%以上，冷藏 7天后处理的茎段污染率达到
100%。经抗生素处理后，外植体消毒效果得到一定的
改善，其中以600万单位青霉素消毒的效果最好，污染
率为 46.67%，为所有处理中最低，而青霉素浓度加至
800万单位后外植体污染率反而升高。
消毒方式
6%次氯酸钠10 min
0.1%多菌灵10 min
0.1%升汞10 min
消毒时间/min
10
10
10
接种数/个
33
38
23
5 d污染数/个
29
38
15
污染率/%
87.88
100.00
65.22
污染情况
真菌+细菌
真菌+细菌
细菌
表3 消毒剂对擎天树消毒效果的比较
贮存时间
采集当天处理
放置4℃冰箱2 d再处理
放置4℃冰箱7 d再处理
消毒时间
升汞0.1% 4 min+吐温
升汞0.1% 8 min
青霉素400万单位30 min+0.1%升汞4 min
青霉素600万单位30 min+0.1%升汞4 min
青霉素800万单位30 min+0.1%升汞4 min
升汞0.1% 4 min
升汞0.1% 8 min
青霉素600万单位30 min+0.1%升汞4 min
接种数/个
35
37
17
30
26
29
23
48
5 d
污染数/个
5
3
7
4
4
17
12
28
污染率/%
14.29
8.11
41.18
13.33
15.38
58.62
52.17
58.33
12 d
污染数/个
23
29
10
14
19
25
20
48
污染率/%
65.71
78.38
58.82
46.67
73.08
86.21
86.96
100.00
表4 处理、消毒时间及抗生素对茎段外植体消毒效果的比较
2.3 擎天树茎段体的褐化抑制
2.3.1 种胚外植体的褐化抑制 擎天树种胚的褐化现
象并不是很严重（见表 5），添加活性炭和PVP的培养
基上种胚褐化率均较低，尤其含 0.5 g/L PVP的培养
基上种胚没有褐化。沈雁等 [9]利用 PVP在油棕愈伤
诱导中得出，幼胚在组织培养中也很少出现褐化现
象。
2.3.2 茎段外植体的褐化抑制 擎天树茎段体培养中褐
化现象非常严重，且褐化速度较快，限制了外植体的进
一步离体培养，因此使用不同抗褐化物质及不同浓度用
量的培养基进行对比试验。如表6所示，青霉素40 min
处理后的外植体接入1/2 MS培养基较SH培养基外植体
褐化率低，且添加抗褐化剂VC 0.2 mg/L+PVP 0.1 g/L+
AC 0.5 g/L效果较好，褐化率降低到 30.0%。青霉素
60 min处理后的抗褐化效果较 40 min处理好，且添加
抗褐化剂的处理褐化率均低于 10%。其中，添加VC
0.2 mg/L+PVP 2 g/L+AC 0.5 g/L抗褐化效果最好，褐
化率为0%。
培养基
1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+AC 0.5 g/L
1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+PVP 0.5 g/L
接种数/个
50
52
3 d后褐化数/个
5
0
褐化率/%
10.0
0.0
表5 不同抗褐化剂对擎天树种子外植体的褐化抑制效果
·· 21
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3 结论与讨论
（1）在自然条件下，植物外植体带有较多细菌和真
菌，故建立外植体无菌培养体系需首先解决消毒问题[10]。
擎天树的种子、茎段都密被星状绒毛，给外植体消毒造
成了一定的困难。当保留望天树种子种皮时，随着升
汞消毒时间的增加外植体污染率降低，但污染率仍然
较高。相比之下，种子外植体去除种皮培养的脱毒效
果较好，可以有效地降低污染率。王莹[11]、万俊丽等[12]
对青钱柳组织培养的研究中也发现，直接以种胚作为
外植体更有利于实现脱毒。
由于失去种皮保护，种胚培育对消毒强度的控制
和要求更为严格，程度过强的消毒将会破坏种胚细胞，
从而影响其生长甚至失活死亡[13]。根据不同种类、浓
度的抗生素和升汞消毒时间对幼嫩程度不同的擎天树
种胚消毒效果进行对比，发现600万单位青霉素对3种
胚的总体消毒效果较好，并在中、小种胚中基本实现
脱毒。
（2）擎天树茎段外植体的脱毒培养较种子外植体
困难，使用升汞、次氯酸钠和多菌灵进行消毒污染率皆
较高，且培养中出现较严重的褐化现象。在消毒中添
加青霉素后，消毒效果得到改善，其中600万单位的青
霉素消毒外植体污染率减低到 46.7%，且贮存时间越
久，消毒效果越差。需对采集季节、抗生素配比、化学
药剂处理等方面对擎天树茎段的消毒处理开展进一步
的探索。
（3）褐化是外植体培养中，自身组织分泌酚类化合
物在溢出过程中与多酚类氧化酶接触，迅速氧化成褐
色的醌类物质，其将与络氨酸酶等作用与外植体组织
发生蛋白质聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导
致外植体代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡[14]。擎天
树外植体消毒后有较严重的褐化现象，尤其经过次氯
酸钠处理后，外植体的褐化速度加快，升汞处理的褐化
率较低，同时添加抗褐化剂组合 VC 0.2 mg/L、PVP
2 g/L和 AC 0.5 g/L的 1/2 MS培养基的防褐化效果
最好。
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消毒处理
600青霉素40 min+0.1%升汞4 min
600青霉素60 min+0.1%升汞4 min
培养基
1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+VC 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L
SH+AC 0.5 g/L+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+VC 0.2 mg/L
1/2 MS+VC 0.2 mg/L+PVP 0.1 g/L+AC 0.5 g/L
1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+VC 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L
1/2 MS+6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+VC 0.2 mg/L
1/2 MS+VC 0.2 mg/L+PVP 2 g/L+AC 0.5 g/L
接种数/个
13
52
50
81
29
34
褐化数/个
5
28
15
6
2
0
褐化率/%
38.5
53.9
30.0
7.4
6.8
0.0
表6 不同抗褐化剂对擎天树茎段外植体的褐化抑制效果
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