全 文 ：收稿日期:2007-04-24;　修订日期:2007-12-05
基金项目:广西回国基金项目(No.桂科回 0731001);
广西教育厅资助项目(No.200710MS050)
作者简介:刘力恒(1973-),男(汉族),湖南常德人 ,现任广西大学化学化
工学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事天然产物的提取和分离工作.
＊通讯作者简介:王立升(1965-), 男(汉族),黑龙江汤原人 ,现任广西大
学教授 ,博士学位 ,主要从事药物化学研究工作.
小叶榕叶总黄酮
含量测定 、鉴别及其对羟自由基清除作用的研究
刘力恒1, 2 , 王立升 1＊ , 王天文1 , 刘雄民 1 , 杨晓青1
(1.广西大学化学化工学院 ,广西 南宁　530004;2.玉林师范学院化学与生物系 ,广西 玉林　537000)
摘要:目的 探讨小叶榕叶提取物中总黄酮的测定方法及其对羟自由基的清除能力。方法 采用改进的铝盐显色分光光
度法 , 在 500nm波长下 , NaNO2 -AlCl3 -NaOH为显色剂 ,常温显色。结果 20 min内测定了小叶榕叶提取物中总黄酮的
含量 , 回归方程为 A=0.013 6C-0.003 1, RSD=1.44%, 相关系数为 0.999 7, 加标回收率达到 98.86%。结论 该测定方
法准确 、可靠 ,结果令人满意;提取液总黄酮含量的增加 , 对羟自由基的清除能力也增强。
关键词:小叶榕;　鉴别;　羟自由基;　紫外分光光度法
中图分类号:R284.1;R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)05-1078-03
ExtractionandDistinctionofTotalFlavanonefromFicusmicrocarpaL.f.anditsEffect
onScavengingofHydroxylRadicals
LIULi-heng1, 2 ,WANGLi-sheng1＊ , WANGTian-wen1 , LIUXiong-min1 , YANGXiao-qing1
(1.ColegeofChemistryandChemicalEngineering, GuangxiUniversity, Nanning530004 , China;2.Depart-
mentofChemistryandBiology, YulinNormalColege, Yulin537000 , China)
Abstract:ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationoftotalflavononefromFicusmvercarpalfandstudyitsscaven-
gingactivityonhydroxylradicals.MethodsTheflavonoidsinFicusmicroearpaL.f.weredeterminedbyultravioletspectropho-
tometryat500nm.ResultsThecorrelationcoefficientofthestandcurvewas0.9997 andtherelativestandarddeviationwas
1.44%.Beerslawwasobeyedintherangeof40 ～ 360μg· ml-1.Theaveragerecoveryratewas98.86%.ConclusionThe
methodissimple, accurateandreliable;thetotalflavonoidshavescavengingcapacityonhydroxylradicalsinadependentman-
ner.
Keywords:FicusmicrocarpaL.f.;　Distinction;　Hydroxylradicals;　UVSpectrophtometry
　　小叶榕叶为桑科植物榕树 FicusmicrocarpaL.f.的叶 ,异名
落地金钱(《本草求原》)。全世界榕树有八百多种 , 主要分布在
热带亚热带地区。我国榕属植物约 100种 , 属热带雨林的关键种
类 , 主要分布在福建 、广东 、广西 、海南 、浙江和中国台湾等地区 ,
为当地的主要植物品种之一。入药主用其叶 FoliumFiciMicro-
carpae。有研究表明 [ 1 ～ 8]小叶榕叶中主要含黄酮 、三萜类 、齐墩
果酸 、脂肪族化合物和甾体化合物等。其中黄酮类和内酯类等有
效成分对治疗冠心病 、老年性痴呆 、脑血栓 、神经系统疾病和消除
自由基 、抗炎 、抑菌 、抗癌等方面有显著效果 , 无毒副作用 ,并以此
开发出多种药品和保健食品 [ 9, 10] 。
黄酮类(flavontes)化合物是植物光合作用产生的一大类化
合物 , 已知的此类化合物约有二千多种 , 有以黄酮(22苯基色
酮)为母核的一类黄色色素和黄酮的同分异构体及其还原产物 ,
还包括黄酮醇类 、异黄酮类 、儿茶素类 、双黄酮类及其衍生物。目
前对银杏类黄酮的研究较多 ,但对于榕树黄酮类化合物的研究还
相对比较缺乏。广西是我国小叶榕产量最大的省份之一 ,而对于
它的利用存在着深加工产品少 、生产技术落后和资源不能合理利
用等缺点。目前我国对小叶榕的利用只是处于起步阶段 ,还未真
正找到合理有效的利用途径。 虽然用小叶榕浸膏作为主成分的
哮喘和慢性支气管炎治疗药咳特灵胶囊已收载在部颁标准中 , 但
小叶榕浸膏质量标准中没有详细的质量控制方法 ,仅仅是检查其
水不溶物和测定其浸出物 ,这样的质量标准不能准确地反应其量
效关系 , 究其主要的原因 , 是没有对其成分及其药理活性进行深
入地研究。
目前天然药用植物中黄酮类化合物测定方法主要有紫外可
见分光光度法 [ 11] 、高效液相色谱法 [ 12] 、薄层色谱法等 [ 13 ～15] 。为
此 , 本文采用改进的铝盐显色分光光度法测定了小叶榕叶醇提取
物中总黄酮的含量并对其进行了鉴别 , 并就该提取液对 Fenton
体系产生的羟自由基的清除作用进行了研究。
1　器材
自然干燥的小叶榕树叶 、无水乙醇(AR), 2550紫外可见分
光光度计(日本岛津),芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)
。 RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), SHB-Ⅲ循
环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
2　方法与结果
2.1 　小叶榕叶总黄酮成分提取 研究小叶榕叶中黄酮类化合物
提取方法时 ,一般采用溶剂直接提取后浓缩。而笔者在实验过程
中发现 , 小叶榕叶中所含的脂溶性色素等物质会使显色法测定总
黄酮时产生浑浊现象 , 造成很大误差。因此 ,本实验采用石油醚
脱脂 , 冷却静置后过滤除去叶绿素后再测定总黄酮的工艺。准确
称取落地金钱干燥品 200 g, 70% 乙醇回流提取 , 过滤 , 回收乙
醇 , 蒸至约 100 ml, 用 100ml石油醚萃取 3次 ,萃取液低温冷却静
置 48h,过滤沉淀 ,萃取液蒸干得到粗提物。
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2.2　总黄酮的测定
2.2.1　测定方法依据 以芦丁为对照品测定榕树叶中总黄酮的
含量 , 加入铝离子试剂 ,同时控制适宜 pH值 ,使黄酮化合物与铝
盐形成络合物 , 在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。
2.2.2　对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品 0.008 0 g, 60%
乙醇定容至 200 ml,制成 40 μg· ml-1贮备液备用。
2.2.3　供试品溶液制备 将各正交实验所得提取液合并 , 回收滤
液 , 每个样品液中取 0.5 ml加显色剂 60%乙醇定容至 25 ml量
瓶中 , 精密移取 0.5ml定容至 10 ml量瓶中备用。
2.2.4　最大吸收波长的选择 芦丁标样显色后扫描曲线如图 1
所示;小叶榕黄酮提取物显色后扫描曲线如图 2所示。小叶榕黄
酮提取物显色后扫描曲线和芦丁标样显色后扫描曲线峰形相似 ,
在 500 nm处吸收最大 ,且峰形对称 , 故选择 K= 500 nm为测定
波长。
图 1　芦丁标样显色后扫描曲线
图 2　小叶榕黄酮提取物显色后扫描曲线
2.2.5　标准曲线的制备 分别精密移取芦丁对照品储备液 0,
1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ml,于 25 ml溶量瓶中 , 入 0.50
mol· L-1NaNO2溶液 1.00 ml, 摇匀 , 5 min后 , 加入 0.30 mol·
L-1AlCl3溶液 1.00 ml, 摇匀 , 加入 1.00 mol· L-1NaOH溶液 5.
00 ml, 60%乙醇水溶液定容至刻度 ,配制成系列芦丁乙醇标准
溶液。以芦丁做参比 , 用 1cm比色皿在波长 500 nm处测其吸光
度。以 吸光度值为纵坐标 , 质量浓度为横坐标进行回归 , 得方程
A=0.013 6C-0.003 1,相关系数为 0.999 7如图 3。
图 3　芦丁浓度 -吸光度标准曲线
2.2.6　线性范围的确定 在相同体积下不同浓度的芦丁标准液
在显色稀释后测定其吸光度见表 1。从表 1的数据可知当显色
液中芦丁乙醇标准浓度超过 360 μg· ml-1时 , 再增加芦丁浓度 ,
显色液的吸光度几乎无变化 ,故本方法选用较佳的线性范围是显
色液中芦丁标准浓度在 40 ～ 360 μg· ml-1之间 。
表 1　芦丁显色液的测定数据
芦丁标准浓度
C/μg·ml-1
显色稀释后芦丁浓度
C/μg· ml-1 吸光度
40 1.6 0.018 2
80 3.2 0.039 2
120 4.8 0.061 8
160 6.4 0.083 3
200 8.0 0.105 3
240 9.6 0.128 7
280 11.2 0.148 1
320 12.8 0.178 2
360 14.4 0.195 2
400 16 0.195 3
2.2.7　显色液的稳定性 本实验对经铝盐显色后的提取液进行
了稳定性的实验 ,结果如图 4:显色后显色液在 20 min内相对稳
定 , 20 min后显色液吸光度开始下降 , 在空气中 , 且强碱性条件
下 , 黄酮类化合物很易被氧化 , 随时间延长吸光度下降 , 虽然从
下降的绝对数值而言并不是很大 , 但相对的变化率已不可忽略 ,
故最佳测定时间应该显色后 20 min内完成。
图 4　显色液的稳定性曲线
2.2.8　回收率实验 准确移取配制的地钱黄酮提取物待测溶液
1.00 ml, 7份 ,加对照品 40μg· ml-1芦丁乙醇标准溶液 1.00ml,
按 “ 2.2.5”项下的方法操作 , 测定总黄酮含量 ,计算加标回收率。
结果见表 2。 从表 2 可以看出 , 总黄酮的平均回收率达到
98.86%, 说明所采用的测定方法是可行的。
表 2　回收率实验
序
号
加入量
C/μg· ml-1
测得量
C/μg· ml-1
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 9.60 9.44 98.3
2 9.60 9.33 97.2
3 9.60 9.54 99.4
4 9.60 9.75 101.6 98.86 1.44
5 9.60 9.46 98.5
6 9.60 9.57 99.7
7 9.60 9.34 97.3
2.3　总黄酮的鉴别 [ 16]
2.3.1　三氯化铝反应 取样品溶液点在滤纸上 ,滴加 1%三氯化
铝乙醇溶液 ,吹干。在可见光下呈淡黄色 , 在紫外光下有明显黄
色荧光斑点。
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2.3.2　乙酸镁反应 取样品溶液点在滤纸上 , 滴加 1%乙酸镁甲
醇溶液 , 加热干燥 ,紫外光下呈黄褐色斑点。
2.3.3　盐酸一锌粉反应 取乙醇提取液 1 ml于试管中加入少许
锌粉振摇 , 加入几滴浓盐酸 (1次加入), 微热 , 1min后即呈紫
红色。
2.4　小叶榕树叶总黄酮提取物对羟自由基清除作用 黄酮类化
合物(Flavonoids)是多酚类物质 , 是许多中草药的有效成分。黄
酮化合物由于结构上的特点 , 是一类天然的抗氧化活性的物
质 [ 17 , 18] , 对超氧阴离子自由基(O-2 · )、羟自由基(· OH)和单线
态氧(1O2)有良好的清除作用。羟自由基(· OH)非常活泼 , 在
含氧自由基中其氧化活性最强。但· OH存在时间短 ,除了电子
自旋共振法(ESR)外 , 一般难于直接测定 , 故常用间接法测
定 [ 19 , 20] 。最常用的间接测定方法是利用 Fenton反应产生羟自
由基 [ 21]:
H2O2 +Fe2+※ OH· +OH-+Fe3+
OH·具有很高的反应活性 , 存活时间短。但在反应体系中
加入水杨酸 , 能有效地捕捉 OH·并产生有色产物。
该产物在 510 nm处有强吸收 , 若在此反应体系中加入具有
清除羟自由基功能的被测物 , 便会与水杨酸竞争羟自由基 , 从而
使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法 ,在相同体积的反
应体系中 , 液)中加入一系列不同浓度的小叶榕榕树叶总黄酮提
取液 , 并以蒸馏水为参比 ,与试剂空白液比较。在 510 nm处测量
含被测物反应液的吸光度 ,并与空白液比较 , 便能测定被测物对
OH·的清除作用。其清除率计算式为:
清除率(%)=100(A0 -Ax)/A0 ×100%
以实验的提取液总黄酮作为样品 ,分别取不同体积的样品定
容到 25ml, 分别测其对羟自由基的清除作用 , 结果见图 5, 可看
出 , 小叶榕榕树叶总黄酮提取液对由 Fenton产生的体系产生的
羟自由基有很好的清除作用 ,随着小叶榕榕树叶提取液总黄酮含
量的增加 , 对羟自由基自由基的清除能力也逐渐增强。
图 5　总黄酮的含量对清除羟自由基的影响
3　结论
实验结果表明 , 本实验所采用的测定小叶榕榕树叶总黄酮的
铝盐显色分光光度法 , 方法准确 ,可靠;小叶榕榕树叶中含有较为
丰富的黄酮类化合物 ,其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清
除作用 。
小叶榕在我国南方地区有极其丰富的资源 ,入药主用其叶 ,
然而 , 到现今为止 , 国内还没有任何有关小叶榕的单体化合物的
研究报道。国外报道 [ 1]从小叶榕中叶子中仅仅只是提取分离了
6个萜类化合物 , 因此 , 小叶榕榕树叶具有广泛的开发前景和利
用价值 。深入系统研究小叶的化学成分和药理活性并建立准确
的质量标准是一项迫切的任务。同时也将会为天然资源调查及
小叶榕的进一步开发利用提供科学依据。
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