全 文 ：大花序桉组织培养研究进展
姚瑞玲 ,王 胤 ,项东云 ,唐庆兰　(广西林业科学研究院 ,广西南宁 530001)
摘要　主要论述了我国大花序桉组培快繁技术中不同外植体 、基本培养基、外源激素及培养条件对大花序桉无菌芽诱导、继代增殖与再
生苗生根的影响 ,同时还指出了大花序桉组培过程中存在的一些问题 ,为今后大花序桉的组织培养研究提供重要参考。
关键词　大花序桉;组织培养;离体快繁
中图分类号　S722.3+7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)29-14030-02
ProgressinTissueCultureofEucalyptuscloeziana
YAORui-lingetal　(GuangxiForestryResearchInstitute, Nanning, Guangxi530001)
Abstract　Theefectsofdiferentexplants, basicmedium, exogenoushormonesandcultureconditionsontheinducement, subcultureand
rootingofEucalyptuscloezianaweremainlydiscussed, furthermore, somequestionsexistinginthecourseoftissuecultureE.cloezianawere
pointedout, whichprovidedimportantreferencesforthefuturestudyontissuecultureofE.cloeziana.
Keywords　Eucalyptuscloeziana;Tissueculture;Invitrorapidpropagation
基金项目　广西林科院业务费资助项目(林科 200902);世界银行贷款
广西综合林业发展和保护项目(KT8-1-1)。
作者简介　姚瑞玲(1979-),女 ,贵州施秉人 ,博士 ,工程师 ,从事林木
定向培育技术及遗传改良研究。
鸣　　谢　广西钦州林科所何贵整总工及广西东门林场邓海群在资料
搜集中所给予的帮助 ,在此表示最诚挚的谢意 !
收稿日期　2009-06-22
　　近年来 ,桉树在华南地区发展较快 ,尤其是以纸浆材 、纤
维材为主的短轮伐期工业原料林发展最为迅猛 ,而大径材的
研究和发展却滞后。大花序桉树种耐干旱瘠薄 、抗病虫害能
力较强 ,干形通直 ,生长较快 ,后期生长优势非常明显 ,是优
良的大径材培育树种 [ 1-3] 。但由于大花序桉的种源和开花
结实量较少 ,造成苗木紧缺 ,加之实生苗造林遗传分化明显 ,
进而制约了大花序桉大规模的推广种植。而采用离体组织
培养不仅能实现工厂化生产优良大花序桉苗 ,而且能够保持
母本的优良特性。目前 ,国内对大花序桉的组织培养进行了
较多探索 ,并取得一定成效 。笔者概述了近年来大花序桉组
培快繁技术的研究进展 ,以期为大花序桉的产业化生产提供
理论依据 。
1　外植体的选择
1.1　外植体类型　目前 ,用于桉树组织培养的外植体有嫩
芽 、带芽茎段 、幼叶 、幼胚 、根 、木瘤 、花芽及原生质体 [ 4-5] 。
其中 ,以嫩芽和带芽茎段最为常用。从文献资料看 ,大花序
桉主要采用带潜伏芽的茎段作为外植体 [ 6-7] 。
1.2　外植体的灭菌　大花序桉多采用浓度 0.1%HgCl2配
合 75%酒精进行一次性消毒灭菌的常规方法 。但广西钦州
林科所认为 ,采用重复消毒法 ,其灭菌效果更理想 。研究表
明 ,采用常规消毒法 ,污染率为 20.1%[ 6-7] ,而采用重复消毒
法 ,污染率为 30.0%。这说明采用一次性的常规消毒法就能
达到理想的灭菌效果。
1.3　无菌外植体的选择　研究发现 ,大花序桉外植体来源
直接影响无菌活体的获取率。其中 ,外植体来源于优树伐桩
萌条时 ,无菌活体的获取率最高 ,达 92.4%[ 7] ;而来源于成年
优树上的枝条时 ,无菌活体的获取率相对较低 ,为 72.4%[ 6] 。
2　培养基配方选用
2.1 　基本培养基　在大花序桉组织培养过程中 ,根据培养
目的的不同 ,通常使用的基本培养基有 MS、改良 MS、改良
MS1 、B1、改良 B1 。研究表明 [ 6] ,以改良 MS1为基本培养基的
组合 ,由于降低了无机盐的浓度 ,大花序桉芽苗生长旺盛 ,增
殖正常 ,丛芽多 ,平均苗高约为 1.8 cm,无叶愈伤组织出现 ,
且基本看不到褐变现象;而以高浓度无机盐 MS为基本培养
基的组合不利于大花序桉的继代增殖 ,虽然丛芽较多 ,增殖
正常 ,但叶愈伤组织较多 、叶尖稍卷 ,且苗木硬化 、老化严重 ,
平均苗高仅为 1.0cm,且基部褐变现象较为明显。而广西东
门林场研究表明 , MS与 B1培养基均适宜其生长 ,且表现良
好 ,但经几代培养后 , MS培养基继代苗开始出现水肿 ,叶墨
绿 ,有徒长之势 ,茎节间拉长 ,而 B1培养基继代苗叶偏黄 ,茎
节短 ,生长势差。其原因可能与 2种培养基中大量元素硝酸
铵的量有关。所以 ,在大花序桉继代苗培养中 ,交替使用这 2
种培养基配方 ,能培养出生长旺 、木质化程度较好 、节间距中
等 ,且有一定苗高的继代苗。广西钦州林科所在此基础之上
进行了进一步的探索 ,研究表明 ,以改良 B1为基本培养基的
组合 ,增殖系数达 4.7,苗木生长旺盛 ,生根率达 80%,且使用
该培养基培养的生根苗 ,根系发达 ,苗木粗壮 ,移栽成活
率高。
2.2　外源激素
2.2.1　外植体的诱导。目前 ,多数研究者认为 ,大花序桉外
植体诱导过程中添加的细胞分裂素一般选用 6-BA,生长素
选用 NAA。但对于所使用激素的浓度 ,不同研究者得出的试
验结果差异较大。有关研究表明 ,大花序桉茎段在改良 MS
+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L培养基上可诱导分化出无
菌芽 ,且其灭菌材料的萌芽率较高 ,达 53%[ 7] 。而有研究指
出 ,以低浓度 6-BA与低浓度 NAA配合使用的效果更好 ,当
6-BA与 NAA都为 0.2mg/L时 ,腋芽诱导率最高 [ 6] 。广西钦
州林科所经进一步试验证明 ,使用 6-BA0.4mg/L+NAA0.2
mg/L的组合腋芽诱导效果最好 ,其萌芽率高达 70%以上。
2.2.2　继代增殖 。已有研究报道中常用的细胞分裂素有 6-
BA、KT,生长素有 NAA、IBA。有关研究表明 , KT与 NAA、
IBA配合使用时 ,侧芽生长受到严重抑制 ,丛芽分化较少 ,甚
至不能正常生长发育 ,苗高生长也受到抑制;且当 KT与 IBA
配合使用时 ,叶片还出现失绿现象 ,叶色偏黄 ,芽苗细弱;
6-BA与 IBA配合使用时 ,芽苗正常 ,但丛芽分化效果差 ,增殖
责任编辑　李占东　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(29):14030-14031, 14110
倍数只为 1.93;但当 6-BA与 NAA配合使用时 ,芽苗生长旺
盛 ,增殖倍数最高(3.21倍),叶大 、嫩绿 ,有效苗数量最多 ,
且无玻璃化现象 [ 6] 。这说明 6-BA与 NAA配合使用优于其
他 3种组合 。相关研究表明 ,大花序桉对生长调节物质较敏
感 ,低浓度的 6-BA和 NAA就能促进大花序桉芽苗的增殖生
长和高生长 [ 6] 。因此 , 6-BA与 NAA必须以一定比例 ,将其
浓度控制在一定范围之内 ,即 6-BA在 0.2 ～ 0.7 mg/L, NAA
控制在 0.2mg/L较理想 [ 6-7] 。否则浓度过高会导致水肿 ,继
代苗的木质化程度低 ,不利于根的诱导;而浓度过低则导致
继代苗生长差 ,苗矮 ,增殖系数低 ,有效苗少。但由于激素在
植物体内有累积效应 ,因此在多次继代后 ,应降低其使用浓
度 ,或高低浓度激素交替使用能达到较好效果。研究认为 ,
大花序桉继代培养初期 ,在 6-BA、NAA浓度都为 0.2 mg/L
的条件下 ,生长 、增殖效果最好;但由于 6-BA有累积效应 ,在
继代 1年后 ,细小芽苗逐渐增多 ,有效苗减少。而适当降低
6-BA与 NAA的比值(6-BA0.2 mg/L+NAA0.25 mg/L)后 ,
有效苗增多 ,同时芽苗的增殖生长和高生长也不受影响 ,且
无玻璃化现象 [ 6] 。
2.2.3　生根培养。对于大花序桉再生苗的生根 ,广西钦州
林科所认为 ,用改良 B1基本培养基无需附加任何激素即可 ,
生根率达 80%。而另一些研究人员认为 ,添加合适的激素生
根效果更佳 ,更有利于后期的移栽 [ 6-7] 。目前 ,常用的激素
有 NAA、IBA、ABT。有研究表明 ,配合使用 NAA和 IBA,大
花序桉再生苗的正常根较单独使用 NAA或 IBA时多 ,且在
NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L和 NAA0.5 mg/L+IBA0.2
mg/L处理下的生根率最高 [ 6] 。研究表明 ,单独使用 ABT1生
根粉 ,大花序桉再生苗的根质量明显改善 [ 6] 。广西东门林场
进一步研究了 ABT与其他激素配合使用对大花序桉再生苗
生根的影响 ,结果表明 ,当 IBA与 ABT1 或 ABT6配合使用
时 ,多数再生苗有根样愈伤组织 ,部分无愈伤组织者已死亡 ,
整体上出根率极低或几乎没有 ,并多数从愈伤团出根 ,且根
系多为不定根。这说明 ABT与 IBA配合使用后 ,大花序桉
再生苗的生根率较低 ,生根效果不佳 。
3　培养条件
所有培养基均附加 2% ～ 3%蔗糖 , 0.51% ～ 0.54%琼
脂 , pH值 5.8 ～ 6.2。培养温度(25±2)℃,光照:外植体诱导
成无菌芽 ,采用全暗培养 10 ～ 20 d,侧芽萌动后转移至有光
条件下培养 ,光照由弱逐渐增强;继代培养光照 10 ～ 12 h/d,
光照强度为 1 400 ～ 2 000 lx的自然光 ,自然光不够时用人工
光源补足;生根培养采用弱光培养 10 ～ 15d,光照由弱而强 ,
刚接种时置弱光条件下培养 ,当有短根出现时 ,至自然光下
培养 ,光照度 2 000 ～3 000lx[ 6-7] 。
4　炼苗 、移栽
生根苗经过 4 ～ 5周培养后 ,当苗木茎部木质化程度较
高 ,叶片舒展 ,叶色浓绿时 ,将其移到光线充足又不遭直射的
室外进行培养。在自然条件下生长 8 ～ 10 d后 ,打开盖子进
行 3 ～ 5d的适应性生长 ,让苗木充分木质化 ,逐步适应外界
环境 ,以提高苗木质量。移栽基质为黄心土和蛭石(V∶V=
5∶1),移栽前先用 0.15% ～ 0.30%的高锰酸钾溶液进行基质
消毒 ,然后将苗木从瓶内取出 ,先用清水轻轻洗净附着在基
部和根部的培养基 ,再用 0.1%的杀菌剂进行小苗消毒处理 ,
最后用生根激素溶液处理根部后移入基质中。基质用塑料
育苗杯装好 ,置于室内育苗架上培养 ,温度 20 ～ 25 ℃,相对
湿度 80%,成活率 85%以上。培育 25 d左右 ,待小苗生长稳
定时 ,即可进行露天炼苗 ,当小苗长至 15 ～ 20 cm时即可出
圃造林 [ 6-7] 。
5　存在的问题与建议
大花序桉组织培养是解决大花序桉种苗来源的一个重
要途径 ,是实现大花序桉种苗产业化生产的基础。近年来 ,
我国在大花序桉组织培养方面的研究取得了一定进展 ,但由
于各学者研究结果不同 ,许多问题都有待进一步研究。
(1)外植体的选择是组培微繁中一个重要的问题。研究
结果表明 ,不同来源外植体 ,其腋芽诱导 、继代增殖和生根效
果差异显著 。其中 ,来源于扦插生根幼苗的效果最好 ,而来
源于成年优树上的最差。大花序桉属于组培和扦插生根比
较困难的桉属树种 [ 6] ,这除了受自身的解剖特征 、酶活性及
内源激素的影响外 ,还与其体内的抑制物质有关。众所周
知 ,树龄越大 ,植株体内的抑制物质含量越高 ,即扦插生根幼
苗中的抑制物质含量低于成年优树。这可能是导致外植体
源于扦插生根幼苗时 ,其萌动率 、增殖系数和生根率远高于
源自成年优树的一个重要原因 ,其有待进一步的深入研究。
(2)从理论上说 ,植物细胞具有 “全能性 ”。但研究表
明 ,一株林木的不同组织和不同部位在器官发生的能力上有
相当大的差别。郭军战等认为 ,在进行四倍体刺槐的组培
时 ,采用茎段中下部明显优于茎端 [ 8] 。从有关大花序桉组织
培养的试验研究结果来看 ,不同来源外植体材料的生根效果
差异较大。桉树无性繁殖能力具有明显的位置效应 ,这除了
与外植体来源中的抑制物质有关外 ,还与作为外植体的茎段
部位有关。但目前关于茎段位置对大花序桉组培生根影响
的研究尚未见报道 ,建议进一步完善。
(3)大花序桉在繁殖速度上已达到一定水平 ,增殖倍数
高达 4.7,但平均苗高明显比一些桉属树种矮 [ 9-10] 。通常提
高生长素的比例有利于芽苗节间的伸长 ,但在继代增殖过程
中发现 ,提高 NAA的比例 ,芽苗玻璃化严重 ,不利于大花序
桉的继代增殖。因此 ,要提高大花序桉芽苗的高生长 ,从激
素入手可能很难取得明显的效果 ,建议从基本培养基中的大
量和微量元素入手 ,进行进一步的调整 ,可能会取得较好的
效果。
(4)以往试验研究结果表明 ,大花序桉不同优树间生根
差异明显 [ 6] ,生根性状有较大的基因依赖性 。因此 ,优树的
选择非常关键 ,在优树选择上还需进行大量试验。此外 ,在
以往试验过程中还发现 ,继代数 <10时 ,大花序桉增殖系数
和生根率较低 ,苗木木质化程度不高;而继代数≥10时 ,情况
明显改善 ,进而导致继代周期偏长 ,而这主要受继代培养基
中激素的影响 ,其最适激素浓度配比是多少 ,也有待进一步
研究。
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(下转第 14110页)
1403137卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　　姚瑞玲等　大花序桉组织培养研究进展
1.3.1　氨基酸的测定。准确称取 0.100 0 g(精确到 0.000 1
g)样品置于水解管中 ,在水解管内加 6mol/L盐酸 10ml, 1%
巯基乙醇 1ml,盖上胶塞 ,用真空泵抽至真空 ,将此水解管封
口后置于(110 ±1)℃的恒温干燥箱内水解 22 h,水解结束后
将水解液过滤并转移至 50ml容量瓶中定容。吸取滤液 1ml
于 25 ml烧杯内 ,在真空干燥机内蒸干 ,再用 1 ～ 2ml水溶解
后蒸干 ,重复 2次 ,残留物用 0.02 mol/L盐酸 1 ml溶解 ,经
0.22μm滤膜过滤后上机测定。
1.3.2　微量元素的测定。准确称取 1.000 0 g(精确到
0.000 1g)左右样品置于消化管内 ,加入 4∶1的 HNO3 ∶HClO4
混酸 15ml左右 ,用远红外消化器加热至沸腾 ,有大量棕色气
体产生时再继续加热 ,温度控制在 200 ℃左右 ,直至冒白烟
近干为止 ,取下冷却 ,转移至 50ml容量瓶并定容。
2　结果与分析
2.1　野生刺儿菜和刻叶刺儿菜氨基酸含量比较　氨基酸测
定结果(表 2)。野生刺儿菜和刻叶刺儿菜中均含有 16种氨
基酸 ,其中谷氨酸含量最高 ,达 0.19%人体必需氨基酸赖氨
酸较高为 0.13%,必需氨基酸占氨基酸总量的 42%。两者人
体必需氨基酸含量无明显差异 ,氨基酸总含量也无明显差
异。可以初步认为两者具有同等营养价值 。
2.2　野生刺儿菜和刻叶刺儿菜含量比较　野生刺儿菜和刻
叶刺儿菜中均含有丰富的常量元素钙 、镁 ,微量元素钾(表
3)。在常量元素中除镁元素以外刻叶刺儿菜的含量均稍高
　 表 2　刺儿菜和刻叶刺儿菜的氨基酸含量
Table2　ThecontentsofaminoacidsinCirsiumsetosumandCephan-
oplossetosum %
名称Name
刺儿菜Cirsiumsetosum
刻叶刺儿菜Cephanoplossetosum
名称Name
刺儿菜Cirsiumsetosum
刻叶刺儿菜Cephanoplossetosum天门冬氨 0.17 0.17 异亮氨酸＊ 0.07 0.07
苏氨酸＊ 0.09 0.08 酪氨酸 0.06 0.06
丝氨酸 0.08 0.08 苯丙氨酸＊ 0.10 0.10谷氨酸 0.19 0.18 赖氨酸＊ 0.13 0.13甘氨酸 0.10 0.09 组氨酸 0.04 0.04
丙氨酸 0.10 0.10 精氨酸 0.09 0.09
缬氨酸＊ 0.09 0.09 脯氨酸 0.07 0.06
蛋氨酸＊ 0.01 0.01 E 0.65 0.63
亮氨酸＊ 0.16 0.15 T 1.55 1.50
　注:E-必需氨基酸 , T-氨基酸总量;“＊”为必需氨基酸。
　Note:E, essentialaminoacids;T, Totalaminoacids;Aminoacidswith
＊ areessentialaminoacids.
表 3　刺儿菜和刻叶刺儿菜的微量元素含量
Table3　ThecontentsoftraceelementsinCirsiumsetosumandCepha-
noplossetosum mg/g
元素Element
刺儿菜Cirsiumsetosum
刻叶刺儿菜Cephanoplossetosum
元素Ele-ment
刺儿菜Cirsiumsetosum
刻叶刺儿菜Cephanoplossetosum
钾＊ 15.376 16.110 铜 0.016 0.020
钠＊ 0.509 1.141 锌 0.071 0.053钙＊ 142.265 144.834 铁 0.271 0.294
镁＊ 10.701 9.305 锰 0.045 0.050
　注:“＊”为常量元素。
　 Note:Elementswith＊aremajorelements.
于野生刺儿菜 ,但无明显差异。这表明栽培品种的营养与药
效将不会低于野生种。
3　小结
(1)两种刺儿菜的氨基酸总含量无明显差异 , 16种氨基
酸含量也无明显差异 ,但蛋白质总量不明(表 2)。
　　(2)两种刺儿菜的微量元素含量无明显差异 ,钾 、钠 、钙
刻叶刺儿菜稍高于野生刺儿菜 ,但无明显差异(表 3)。
Ca可以增加大脑皮层的抑制过程 ,调节兴奋的平衡失
调 ,具有消炎 、消肿 、抗过敏作用 [ 2] 。 Mg具有保护神经的作
用 ,是人体蛋白质 、核酸 、脂类 、糖类等物质代谢及神经肌肉
传导 、收缩不可缺乏的物质 ,同时是降低血液中胆固醇的主
要催化剂 [ 3] 。 K有利于降低血压 ,减少心血管疾病 ,促进糖
类代谢 。
植物中草药中的微量元素与有机有效成分在抗病治病
过程中的协同作用已引起人们的关注 ,刺儿菜和刻叶刺儿菜
中含有丰富的氨基酸和人体所需的多种微量元素 ,这些成分
与刺菜和刻叶刺儿菜的其他有效成分在临床运用中的内在
联系值得进一步探讨。
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