全 文 ：广西农业科学 2009年第 40卷第 7期
荸荠 ［Eleocharis dulcis （Burm．f．）Trin．ex Hen-
schel］是莎草科多年生浅水经济作物，其球茎亦果
亦蔬，还可入药。广西常年荸荠种植面积13334ha左
右，总产球茎30万～40万t。 为调节市场周年均衡供
应和增加收益， 广西荸荠年贮藏量21万～28万t，贮
藏时间有的长达半年以上。 据作者对农户的调查，
广西各个荸荠产区荸荠贮藏期腐烂病常年普遍发
生，贮藏时间从30～150d，由病菌所致的球茎腐烂从
5．2％剧升至73．2％，损失巨大。目前关于荸荠贮藏期
腐烂病病原菌种类国内外文献鲜见报道 ［1］，为研究
其发病规律与防控技术，解决荸荠贮藏期腐烂病害
问题，作者对广西荸荠贮藏期腐烂病病原菌类别和
种类进行了较广泛和系统的调查研究， 同时对主要
的病原菌进行了rDNA－ITS序列分析，结果报道如下。
1 材料与方法
1． 1 病害调查和症状观察
2003年12月～2004年7月，对广西南宁市，合浦
县，贺州市沙田镇、莲塘镇，平乐县同安镇、二塘镇，
荔浦县青山镇等5个荸荠产区贮藏期荸荠腐烂病的
发生和危害情况进行调查， 对发病症状进行观察、
描述和拍照。
广西荸荠贮藏期腐烂病病原菌鉴定
颜梅新1，2，廖旺姣3，袁高庆1，韦继光1，赖传雅1 *
（1 广西大学农学院， 南宁 530005；2 广西甘蔗研究所， 南宁 530007；3 广西林业科学研究院， 南宁 530001）
摘要：对广西荸荠贮藏期腐烂病的发生危害和症状特点进行了调查和描述，并对825份标样进行分离、纯化，结果
从中获得菌株431个，根据菌株病原菌的形态特征、致病性及rDNA－ITS序列分析，鉴定出广西荸荠贮藏期腐烂病的主
病原菌是棘孢木霉（Trichoderma asperellum）及其他16种病原菌，从而明确了荸荠贮藏期病害发病规律及药剂筛选和
防控技术的研究重点。
关键词：荸荠；贮藏期；植物病原菌；鉴定
中图分类号：S436．45 文献标识码：A 文章编号：1002－8161（2009）07－0840－04
收稿日期：2009－04－21
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻0537002－1－3）
作者简介：颜梅新（1978－），男，广西横县人，硕士，助理研究员，主要从事植物病害及防治研究工作。*为通讯作者，E－mail：ygqtdc＠sina．
com。
Identification of pathogens causing rot disease in Chinese water
chestnut during storage period
YAN Mei－xin1，2，LIAO Wang－jiao3，YUAN Gao－qing1，WEI Ji－guang1，LAI Chuan－ya1 *
（1 Agricultural College， Guangxi University， Nanning 530005， China； 2 Guangxi Sugarcane Research Institute， Nanning
530007， China； 3 Guangxi Academy of Forestry Sciences， Nanning 530001， China）
Abstract: The occurrence and characteristic symptom of rot disease in Chinese water chestnut during storage period
has been investigated. A total of 431 strains have been isolated and purified out of 825 samples. According to the morpho-
logical characteristics, pathogenicity and sequence analysis of internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA (rD-
NA-ITS), the main pathogens causing rot disease in Chinese water chestnut during storage period was identified as Tricho-
derma asperellum. Sixteen other pathogens have also been identified and characterized on the basis of their morphological
features. Therefore, the research priorities should be given to regulation, fungicide screening and control technique of rot
disease in Chinese water chestnut during storage period.
Key words: Chinese water chestnut; storage period; plant pathogen; identification
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颜梅新等：广西荸荠贮藏期腐烂病病原菌鉴定
1． 2 病原菌的鉴定
1． 2． 1 病原菌的分离和纯化 病原菌的分离采用
常规的组织分离方法，菌种用琼脂表面单孢挑取法
纯化，或直接从标本上挑取孢子作单孢分离，获得
纯菌株，移入马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面
上，培养5d后置4～8℃冰箱中保存备用。
1． 2． 2 致病性测定 将活化的菌种移至PDA平皿
中央25℃下培养至菌落长满大半皿； 取直径3cm左
右的健康、新鲜荸荠进行表面清毒，再用灭菌小刀
横切球茎；用内径为8mm的灭菌打孔器切割菌落边
缘菌块接种到荸荠表面，设无菌琼脂块作对照。 将
已接菌荸荠置室温20～29℃、相对湿度100％的干燥
器内培养，重复5次［2］。 球茎发病后再分离病菌镜检
其形态结构。
1． 2． 3 病原菌形态学鉴定 用载玻片培养法，在
平皿培养菌落边缘切下1cm2的小菌块置于载玻片
上，盖上盖玻片，于25℃恒温箱中培养，在光学显微
镜下连续观察各病原菌的形态特征。
1． 2． 4 病原菌rDNA-ITS序列的扩增与分析 先
提取病原菌菌株总DNA。将单孢纯化的菌株移植于
PDA平板培养基上，25℃黑暗培养3～4d， 待菌落直
径长至5～6㎝时停止培养， 从PDA平板上刮取约50mg
的新鲜菌丝，经冷冻干燥后置－30℃冰箱保存［3］。
接着进行真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA－
ITS）序列的扩增及测定。 采用其通用引物ITS4（5′－
TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）和ITS5（5′－GGAA
GTAAAAGTCGTAACAAGG－3′）扩增病原菌的rDNA－
ITS序列［4］。 PCR反应采用50μl反应体系，包括模板
DNA 1.0μl（约10ng）、10×PCR buffer 5．0μl、2mmol ／ L
dNTP 5．0μl、5mmol ／ L的 ITS4和 ITS5引物各 4．0μl、
5U ／μl Taq酶（含MgCl2）0．5μl、加ddH2O至50.0μl。 扩
增反应程序为95℃预变性5min；94℃变性40s、51℃
退火1min、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸
10min。 PCR产物委托宝生物工程（大连）有限公司
负责纯化回收后测序，序列采用双向测定。 对测定
的结果，采用NCBI网站（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）
中的Blast程序进行序列比对和同源性分析。
1． 2． 5 病原菌的分离频率 待所有分离纯化的菌
株鉴定后，计算每种病原菌的分离频率。
病原菌的分离频率＝（该种病原菌的分离菌株
数 ／总菌株数）×100％
2 结果与分析
2． 1 荸荠球茎腐烂病症状特点
荸荠贮藏期腐烂病在广西各个荸荠产区均有
发生。因病原及发病条件不同，病害症状比较复杂。
通常从荠皮任一部位凹陷、皱缩，表面有霉状物或
无，霉状物多为绿色，也有白色、黄色、红色等，球茎
变软。 剖开球茎，荠肉多呈黄褐色，也有浅绿色、灰
褐色、红褐色、黑褐色等，后期有时发展为空心，内
部有白色或黑色霉状物。 发病后期球茎干腐或湿
腐，湿腐时常散发臭味。 不同种类的分离菌经接种
引致的症状，除齐整小核菌后期长出菌核，砖红镰
孢的病征砖红色、尖孢镰孢的淡紫色、青霉及棘孢
木霉致病后期分别为青绿色和深绿色霉层等有别
可资辨识外，其他腐烂病害仅从病部症状难以区分
是何种病原所致。
2． 2 病原菌鉴定
2． 2． 1 病原菌的分离和纯化 从广西各主要荸荠
产区共采集了825份腐烂病标样， 分离、 纯化获得
431个菌株， 然后将形态相同的菌株逐一归并成17
个菌株类群，编号分别为ED01～ED17，其中ED01为
主要病原菌，其分离频率达67．98％。
2． 2． 2 病原菌的致病性 从纯化后的17个菌株类
群中各选1株分别接种到荸荠球茎表面， 均引起荸
荠球茎腐烂，对照不发病。 对发病球茎进行常规分
离，所获分离菌与原接种菌一致，证明接种菌是荸
荠球茎腐烂病的病原菌。
2． 2． 3 病原菌ED01的鉴定 病原菌ED01的培养
性状和形态特征：菌落深绿色，轻度毛发状；分生孢
子梗丛束状长出，分枝众多，主分枝上又以2～3个为
一组长出次级分枝 ； 瓶梗 6．20～16．25μm×1．60～
5．00μm，基部比中间窄，瓶梗上部变细；分生孢子
2．50～5．00μm×1．90～2．50μm，青绿色，椭圆形或倒卵
形， 具细微而不甚明显的棘状突起。 根据病原菌
ED01的形态特征，初步鉴定其属于木霉属（Tricho-
derma．sp．）［5，6］。
木霉属真菌分布广泛，由于形态特征差异微小
且不稳定，该属的分类一直较为混乱。 为进一步确
定ED01的种名，本研究扩增并分析了该菌的rDNA－
ITS序列。 菌株ED01的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶
电泳检测，得到1个大小约550bp的片段，经序列测
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广西农业科学 2009年第 40卷第 7期
菌株号及种名
Strain No． and species
形态特征
Morphological characteristic
分离频率（％）
Isolation frequency
ED02 Aspergillus niger
V．Tiegh．
菌落黑色。分生孢子头直径 85．00～320．00μm，球形，辐射状，或边缘裂开呈辐射状的圆柱体，灰黑
色、碳黑色。分生孢子梗 265．00～1855．00μm×7．50～60．00μm，无色或顶部黄色至褐色，直立，具隔
膜，大型者长数毫米。顶囊 25．00～53．75μm，球形、近球形，无色或黄褐色。产孢结构两层排列，常
呈褐色。顶层孢梗 5．00～10．00μm×1．90～3．75μm，长瓶形。分生孢子 3．75～5．00μm，成链状串生，球
形，褐色，初光滑后变粗糙或具细刺，有色物质沉积成瘤状、条状或环状。
2.55
ED03 Aspergillus
flavus LinK．
菌落呈黄绿色。分生孢子梗 275．00～810．00μm×5．00～15．00μm，无色，壁粗糙。分生孢子头直径
25．00～120．00μm，辐射状，半球形、近球形；顶囊 11．25～36．25μm，球形、近球形，无色或黄褐色。有
的菌株产生淡红色至深红色或褐色菌核。
0.70
ED04 Thielaviopsis
paradoxa（de Seynes）Scorch．
菌落平展，灰色，榄青色或黑色，绒状或粉状。大型分生孢子梗 17．25～67．25μm×3．75～8．75μm，不
规则分枝，无色或淡褐色，光滑；产孢细胞全壁体生式。大型分生孢子 17．50～22．50μm×10．00～
17．25μm，褐色或暗褐色，壁厚，桶形、椭圆形、倒卵形或长圆形。小型分生孢子梗长 55．00～
82．50μm，最粗处 6．25～10．63μm，细处 2．50～5．00μm，无色或淡褐色，瓶形；小型分生孢子 6．25～
10．00μm×2．50～7．50μm，成串内生，初无色，圆柱状，后变椭圆形，淡黄至金黄色。该致病菌未发现
有性世代。
5.10
ED05 Fusarium solani
（Mart．）Sacc．
在 PDA平板上于 25℃黑暗培养 4d后菌落直径为 5．50～6．00cm，气生菌丝多，亦有极少者，呈白
色至淡黄色。培养基质深部可形成有土黄色、黄褐色等色素。小型分生孢子梗 6．30～43．80μm×
1．90～4．40μm，长且少有分枝；小型分生孢子 3．10～21．30μm×1．80～4．40μm，数量多，假头状着生或
散生，卵形、肾形。大型分生孢子 27．50～36．30μm×2．50～4．40μm，较胖，马特形，许多孢子具有圆形
足细胞；大型分生孢子梗分枝多，成簇。厚垣孢子 3．80～10．00μm×2．50～10．00μm，球形至卵圆形，
孢壁光滑至粗糙，在侧生分枝，单生或链状着生。
2.32
ED06 Fusarium lateritium
Nees
在 PDA平板上于 25℃黑暗培养 4d后菌落直径为 3．80～4．30cm，具有白色至粉红色的气生菌丝，
能形成洋红色或粉红色色素，但仅局限在培养基的表面。大型分生孢子 25．00～52．50μm×2．50～
5．00μm，直筒状，两端稍弯，顶孢鸟嘴形，基胞足跟明显，3～5个隔膜。未发现小型分生孢子。
0.23
ED07 Fusarium oxysporum
Schlecht．
在 PDA平板上生长速率为中等，于 25℃黑暗生长 4d的菌落直径为 2．20～2．80cm，气生菌丝绒
状，白或灰白色；基物表面青莲色，基物无色，个别菌株长蓝绿色小菌核，移植次数增加，有退化
现象，菌丝束生紧贴管壁。小型分生孢子产孢细胞短，单瓶梗，大小 5．00～28．75μm×2．50～3．75μm，
在菌丝上分散生长。小型分生孢子 5．00～18．75μm×1．25～3．75μm，无色，卵圆形或肾形，假头状着
生在产孢细胞上。大型分生孢子 1～6 个隔膜，多为 3 个隔膜，前者大小 20～52．5μm×3．75～
5．00μm，后者为 27．50～47．50μm×3．75～6．25μm，无色，月牙形，稍弯，向两端比较均匀地逐渐变尖，
基胞足跟明显。厚垣孢子很容易产生，球形，直径 12．50～21．25μm，单生，成对着生或串生。
1.86
ED08 Fusarium moniliforme
Sheldon
在 PDA平板上于 25℃黑暗培养 4d后菌落直径为 3．00～3．50cm，具有白色或淡紫色的气生菌丝，
菌落背面为无色到深紫色。瓶状小梗在气生菌丝上形成，大小为 20．00～30．00μm×1．50～3．00μm。
小型分生孢子 3．70～17．50μm×1．87～5．00μm，单生，假头状着生或呈链状排列，纺锤形至棍棒形。
在菌丝和分生孢子中均不生成厚垣孢子。未发现大型分生孢子。
0.23
ED09 Alternania alternata
（Fr．：Fr．）Keissler
菌落灰色至暗青褐色，基内菌丝均发达，初无色或淡色，后变为程度不同的褐色，有隔膜，多分
枝。分生孢子梗3．00～40．00μm×1．00～4．00μm，单生或数根簇生，直立，直或弯曲，有隔膜，罕分枝，
淡褐色至褐色，随着连续产孢作合轴式延伸。分生孢子5．00～48．70μm×3．70～13．70μm，单生或短
链生，倒棒形、卵形、倒梨形、椭圆形或近圆柱形，淡褐色至褐色，表面光滑或具微刺，具3～8个横
隔膜和1～4个纵、斜隔膜，分隔处不隘缩或略隘缩。喙3．10～18．70μm×2．50～3．75μm，短柱状或锥
状，淡褐色，较孢身淡，0～1个横隔膜，柱状、锥状，部分转变为产孢细胞（假喙）。
0.47
ED10 Sclerotium rolfsii Sacc． 菌丝初白色后变褐色，菌核直径6.6～11.9μm，球状，初为白色，后变褐色。病菌不产生无性孢子。 1.62
定，确定该片段全长514bp。
将菌株ED01的rDNA－ITS序列（GenBank登录号
为FJ469976）与GenBank中已有的序列进行同源性
比较， 发现与其同源的菌株均属于木霉属（Tricho-
derma）或木霉菌的有性态子囊真菌，ED01与它们
的同源性为98％～100％。 利用软件DNA Star建立菌
株ED01的系统发育树， 结果菌株ED01的序列与
GenBank中T． asperellum 3DC、T． asperellum 3DQ、T．
asperellum 3DV1、T．asperellum 3DX （GenBank登录号
分别为AY266648、AY266664、AY266669、AY266673）
等14个T． asperellum菌株的遗传距离最近， 同源性
为100％，位于系统发育树的同一分支。
根据病原菌的致病性、形态和rDNA－ITS序列同
源性比较结果，确定荸荠贮藏期腐烂病的主要病原
菌ED01为棘孢木霉（Trichoderma asperellum Samuels，
Lieckfeldt﹠Nirenberg）。
2． 2． 4 其他16种病原菌的形态特征和分离频率 根
据形态特征，并参考文献［5~9］，其他16种病原菌ED02～
ED17的鉴定结果见表1。
表 1 16种病原菌的形态特征和分离频率
Table 1 Morphological characteristics and isolation frequency of 16 pathogen species
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ED11 Oospora sp．
菌落平展，白色，菌丝匍匐。菌丝直径 2．00～2．30μm，无色，具隔膜，分生孢子梗 50．0～60．0μm×1．5～
2．0μm，与菌丝区别很小，分枝稀少，细长，无隔膜，无色。顶端以全壁体生式向基序列串生节孢
子，节孢子单胞 5．0～6．0μm×2．5～3．0μm，串生，球形、圆筒形，无色。
1.86
ED12 Rhizopus sp．
匍匐菌丝弓形弯曲，在与基质接触处产生假根，假根发达，分枝多，褐色，假根间距离1～3mm。孢
囊梗150．00～750．00μm×5．00～15．00μm，直立不分枝，1～10枝丛生于假根上方，淡褐色。孢子囊褐
色或黑色，球形或椭圆形，直径42～105μm；囊轴直径约70μm，高约90μm，淡褐色，球形、椭圆形、
卵形，膜薄平滑；中轴基存在，直径25～214μm，孢囊孢子3．75～8．75μm×25．00～6．25μm，黄褐色或
褐色，近球形，卵形或多角形，表面平滑。该致病菌未发现接合孢子。
2.78
ED13 Mucor sp．Ⅰ
菌丛灰白色；孢囊梗长达数厘米，分枝少，黄褐色。孢子囊黑色，球形，直径30～205μm，膜遇水溶
解；囊轴13．50～50．00μm×13．75～37．50μm，球形、椭圆形或卵圆形，无色；孢囊孢子2．50～11．25μm×
2．50～8．75μm，圆形或椭圆形。未见接合孢子。
4.18
ED14 Mucor sp．Ⅱ
菌丛黄灰色；孢囊梗长达数厘米，分枝少，黄褐色。孢子囊直径35～240μm，球形，黑色或褐色，膜
遇水溶解；囊轴高25～63．75μm，上部宽17．50～48．75μm，下部宽13．75～45．00μm，拳套形，无色；孢
囊孢子3．75～10．00μm×2．50～8．75μm，圆形或椭圆形；厚垣孢子直径5．00～12．50μm，无色至黄色，
在菌丝中大量形成，单生或串生。未见接合孢子。
3.25
ED15 Zygorhynchus sp．
菌丛灰白色；孢囊梗长达数厘米，分枝少，黄褐色。孢子囊黑色，球形，直径 30～205μm，膜遇水溶
解；囊轴 13．50～50．00μm×13．75～37．50μm，球形、椭圆形或卵圆形，无色；孢囊孢子 2．50～
11．25μm×2．50～8．75μm，圆形或椭圆形。有性世代，靠近菌丝顶部下方产生隔膜，隔膜下方产生对
称或不对称分枝，向上呈弓形相向弯曲，分枝先端与主菌丝上端相遇时膨大形成大型配子囊；在
相对应的主菌丝上的接触点产生小型配子囊，交配生接合孢子。
2.09
ED16 Penicillium sp．
菌落青绿色，背面黄褐色；分生孢子梗81．25～337．50μm×2．25～5．00μm，从菌丝生出，无足细胞，有
横膈膜，光滑，顶端生帚状分枝排列成2～3层，顶层为小梗，7．50～13．75μm×1．25～10．00μm，安瓶
状，对称或不对称排列；分生孢子3．75～12．50μm×2．50～5．00μm，椭圆形、球形、梨形，光滑，无色。
1.16
ED17 Gliocladium sp．
菌落黄色，分生孢子梗21．25～118．75μm×2．50～5．00μm，从菌丝生出，无足细胞，有横膈膜，光滑，
顶端生排列成帚状的分枝，分枝1~3次，对称或不对称，顶层为小梗，12．50～31．25μm×1．25～
3．13μm，瓶梗状；分生孢子3．75～12．50μm×2．50～5．00μm，单个椭圆形、卵圆形，光滑，无色，分生孢
子集结于由子实体所分泌的粘液中。
1.62
菌株号及种名
Strain No． and species
形态特征
Morphological characteristic
分离频率（％）
Isolation frequency
3 结论与讨论
荸荠在贮藏过程中球茎腐烂主要是由多种真
菌复合侵染所致。 经过对825份病荸荠球茎标样的
分离、纯化、鉴定及致病性测试，获得了17种病原
菌，分属12个属。对主病原菌ED01形态特征和rDNA－
ITS区域的序列分析，鉴定为棘孢木霉。 棘孢木霉是
为害荸荠球茎的优势种， 这在国内外是首次报道，
从而明确了荸荠贮藏期病害发病规律、药剂筛选和
防控技术的研究重点。除根霉、尖孢镰孢霉、奇异根
串珠霉外，其余毛霉等13种病原菌也是国内外首次
报道为害荸荠。
致谢：承蒙浙江大学章初龙博士协助鉴定棘孢
木霉菌，谨此衷心感谢！
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（责任编辑 麻小燕）
续表 1
颜梅新等：广西荸荠贮藏期腐烂病病原菌鉴定 843· ·