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藏药短管兔耳草质量控制方法研究



全 文 :收稿日期:2016-03-22; 修订日期:2016-08-01
基金项目:国家自然科学基金(No. 11372162;No. 11432008)
作者简介:王海霞(1992-),女(汉族),青海平安人,青海大学与清华大
学联合培养硕士研究生,学士学位,主要从事天然药物的提取与药理药效
研究工作.
* 通讯作者简介:赵红平(1974-),男(汉族),重庆人,清华大学生物力
学与医学工程研究所副教授,博士学位,主要从事生物力学与医学工程研
究研究工作.
* 通讯作者简介:曹长年(1960-),男(东乡族),天津人,青海大学化工
学院教授,学士学位,主要从事天然产物提取与分离工作.
藏药短管兔耳草质量控制方法研究
王海霞1,3,苑 祥2,邢书银1,曹长年1* ,赵红平3*
(1. 青海大学化工学院,青海 西宁 810016;2. 中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁 810000;
3. 清华大学生物力学与医学工程研究所,北京 100084)
摘要:目的 建立短管兔耳草的质量控制方法,为短管兔耳草的合理开发提供科学依据。方法 参照《中国药典》2010 年
版附录相关方法,对短管兔耳草的水分、酸不溶性灰分、浸出物进行测定;以梓醇作为对照品建立短管兔耳草药材的薄层
鉴别方法;以松果菊苷、大车前苷和毛蕊花糖苷作为指标性成分建立高效液相色谱含量测定方法。结果 薄层色谱斑点
清晰,特征性强,重复性好;高效液相色谱定量分析中,松果菊苷、大车前苷和毛蕊花糖苷线性范围分别为 0. 11 ~ 37. 67
μg /μl、0. 12 ~ 31. 33 μg /μl、0. 15 ~ 28. 65 μg /μl;平均加样回收率分别为 99. 7%、98. 9%、98. 5%。结论 该文建立的实验
检测方法科学合理,操作简便,稳定可靠,重复性好,可作为藏药短管兔耳草的质量控制方法。
关键词:短管兔耳草; 质量控制; 薄层色谱鉴定法; 高效液相色谱法
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2016. 10. 016
中图分类号:R291. 408 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)10-2353-03
藏药短管兔耳草为玄参科兔耳草属短管兔耳草 Lagotis brevi-
tuba Maxim.的干燥全草,产于西藏、青海、甘肃南部及四川等海
拔 3900 ~ 4800 m 的高山阴坡碎石地带[1],其主要化学成分有挥
发油类、黄酮类、苯丙素苷类、环烯迷萜类与脂溶性物质等[2,3],
具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等药理作用[4 ~ 6],在临床上常用于全身发
热、肾炎、肺病、高血压、动脉粥样硬化与月经不调等的治疗,收载
于《藏药志》(1991 年版)[7,8]。为了进一步科学、合理、规范地开
发和利用该资源,本实验对青海地区 11 个不同产地短管兔耳草
药材的性状、水分、总灰分、酸不溶性灰分与浸出物等进行测
定[9],以指标性成分梓醇作为对照品建立短管兔耳草药材的薄
层鉴别方法(TLC)和以松果菊苷、大车前苷和毛蕊花糖苷作为指
标性成分建立了高效液相色谱含量测定方法(HPLC),规定其含
量限度,以期为制定藏药短管兔耳草的质量控制提供科学依据。
1 仪器和试药
1. 1 仪器 1200 型 HPLC(含 DAD 二极管阵列检测器,ChemSta-
tion 工作站);C18Unitury色谱柱 (250 × 4. 6 mm,5 μm),BP211D
电子天平(Sartorius公司);KQ - 500DB型数控超声波清洗器(昆
山市超声仪器有限公司);薄层硅胶预制板(青岛海洋化工厂)。
1. 2 试药 松果菊苷、大车前苷和毛蕊花糖苷对照品(均购自中
国药品生物制品检定所);短管兔耳草对照药材(购自西宁市藏
医院);水为超纯水,甲醇与乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯;
短管兔耳草药材采自青海省海北州、玉树州、果洛州等地区,经中
国科学院西北高原生物研究所梅丽娟研究员鉴定为短管兔耳草。
2 方法与结果
2. 1 性状 全草长 5 ~ 15 cm;根茎圆柱状且略弯曲,节间紧缩,
形似蚕,其表面灰褐色或浅紫褐色,质脆易折,断面呈棕褐色或灰
黄色,有 3 ~ 4 个白点排列成环(维管束);根茎上端有芽,包被有
数层黑褐色鳞片,微具光泽;根茎周围和下端有数 10 条细长的
根,圆柱形,扭曲状,表面浅黄褐色或灰褐色,有纵皱纹,质脆易折
断,断面略平坦;有的根茎上有叶 1 ~ 2 片,多皱缩,润展后完整叶
成圆形或卵圆形,先端钝圆,中部边缘具圆齿,基部宽楔形;花序
穗状;核果长圆形,黑褐色;气微;味微苦。
2. 2 薄层色谱鉴定
2. 2. 1 对照品的制备 取梓醇对照品,加甲醇制成每毫升含 1
mg的溶液,作为对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 分别取短管兔耳草全草,去泥后自
然条件下阴干,粉碎并过 60 目筛,备用。分别取粉碎过筛的短管
兔耳草 2. 0 g,加甲醇 25 ml,超声处理 40 min后滤过,滤液浓缩至
干,残渣加甲醇 2 ml溶解,作为供试品溶液。
2. 2. 3 对照药材溶液的制备 取短管兔耳草药材粗粉 1. 0 g,同
法制成对照药材溶液。
2. 2. 4 薄层色谱图 参照薄层色谱法进行试验[《中国药典》
(2010 年版)一部附录Ⅵ B]。吸取样品溶液 5 ~ 10 μl,对照品溶
液 5 μl,对照药材溶液 10 μl,分别点于用 1%氢氧化钠制备的同
一硅胶 G 薄层板上,以三氯甲烷 -甲醇 -水(5∶ 5 ∶ 2)为展开
剂,预饱和 15 min,展开后取出晾干,喷以 10%硫酸乙醇试液,在
105℃加热至斑点显色清晰,结果如图 1 所示。由图 1 可知,在供
试品色谱中,与对照药材及对照品色谱相应的位置上,显现了相
同颜色且清晰的斑点。
1 ~ 7 和 9 ~ 12 为供试药材,8 为梓醇对照品,13 为对照药材
图 1 短管兔耳草全草薄层色谱图
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 10 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 10 期
2. 3 水分测定 取本品,参照水分测定法[《中国药典》(2010 年
版)一部附录Ⅸ H 第一法]进行测定。11 批药材的测定结果见
表 1。根据表 1 的测定结果,建议药材标准中水分不得过
12. 0%。
2. 4 总灰分 取本品,参照总灰分测定法[《中国药典》(2010 年
版)一部附录Ⅸ K]进行测定。11 批药材的测定结果见表 1,据
此建议药材标准中总灰分不得过 9. 0%。
2. 5 酸不溶性灰分 取本品,参照酸不溶性灰分测定法[《中国
药典》(2010 年版)一部附录Ⅸ K]进行测定。11 批药材测定结
果见表 1。根据测定结果,建议药材标准中酸不溶性灰分不得过
4. 0%。
表 1 短管兔耳草各地点水分、灰分和酸不溶性灰分测定结果
编号 地点 经纬度 海拔 /m 水分 /% 灰分 /% 酸不溶灰分 /%
ELS 青海省清根河 N 35°2929. 9″ E 99°3031. 7″ 4426 11. 8 7. 8 2. 9
JLL 青海省降路岭 N 35°2341. 8″ E 99°1828. 7″ 4456 11. 6 8. 0 2. 8
QLSYC 青海省祁连山垭口 N 38°723. 8″ E 100°196. 8″ 3900 11. 5 8. 2 3. 1
DBS 青海省达坂山 N 37°2050. 5″ E 101°242. 8″ 3983 11. 2 7. 8 2. 9
MQX 青海省大武镇 N 34°2958. 3″ E 100°458. 2″ 4305 11. 2 7. 2 3. 2
QZS 青海省青珍乡垭口 N 34°1354. 6″ E 100°149. 7″ 4390 11. 3 7. 5 2. 7
ZQX 青海省知钦乡 N 32°4750. 9″E100°3354. 5″ 4599 11. 3 8. 0 3. 3
GLSBT 青海省巴塘镇 N 32°5136. 6″ E 96°5839. 6″ 395m 11. 7 8. 1 2. 7
HXSYC 青海省哈秀山垭口 N 33°1648. 9″ E 95°1737. 8″ 4622 11. 5 7. 8 3. 3
DJC 青海省当江乡 N 33°385. 1″ E95°5047. 7″ 4618 11. 3 7. 6 2. 8
CSTS 青海省长石头山 N 35°256. 1″ E98°96. 5″ 4211 8. 5 8. 5 2. 1
2. 6 浸出物 按《中国药典》(2010 年版)一部醇溶性浸出物测
定法(附录Ⅹ A)进行测定。用稀乙醇作溶剂时 11 批样品的测定
结果见表 2,据此建议药材标准中醇溶性浸出物不得少于 9. 0%;
用纯水作溶剂时对 11 批样品的测定结果见表 2,据此建议药材
标准中水溶性浸出物不得少于 8. 0%。
表 2 短管兔耳草各地点浸出物测定结果
编号 地点 经纬度 海拔 /m 醇溶性浸出物 /% 水溶性浸出物 /%
ELS 青海省清根河 N 35°2929. 9″ E 99°3031. 7″ 4426 10. 7 9. 3
JLL 青海省降路岭 N 35°2341. 8″ E 99°1828. 7″ 4456 10. 5 10. 9
QLSYC 青海省祁连山垭口 N 38°723. 8″ E 100°196. 8″ 3900 10. 5 10. 3
DBS 青海省达坂山 N 37°2050. 5″ E 101°242. 8″ 3983 11. 0 8. 3
MQX 青海省大武镇 N 34°2958. 3″ E 100°458. 2″ 4305 10. 4 10. 5
QZS 青海省青珍乡垭口 N 34°1354. 6″ E 100°149. 7″ 4390 10. 7 10. 4
ZQX 青海省知钦乡 N 32°4750. 9″E100°3354. 5″ 4599 10. 6 10. 6
GLSBT 青海省巴塘镇 N 32°5136. 6″ E 96°5839. 6″ 3958 13. 3 13. 3
HXSYC 青海省哈秀山垭口 N 33°1648. 9″ E 95°1737. 8″ 4622 9. 9 8. 3
DJC 青海省当江乡 N 33°385. 1″ E95°5047. 7″ 4618 10. 4 10. 1
CSTS 青海省长石头山 N 35°256. 1″ E98°96. 5″ 4211 10. 8 10. 2
2. 7 含量测定
2. 7. 1 色谱条件 色谱柱:C18 Unitury 250mm × 4. 6 mm,5 μm;
流动相:乙腈 - 0. 4%甲酸水,0 min ~ 40min,25% ~70%乙腈梯度
洗脱,流速 1. 0 ml /min,进样量 10 μl,检测波长 254 nm。
2. 7. 2 对照品溶液和供试液的制备 称取毛蕊花糖苷、大车前苷
和松果菊苷对照品适量,加乙腈分别制成每毫升含毛蕊花糖苷
1. 82 mg、大车前苷 1. 70 mg和松果菊苷 1. 68 mg的对照品溶液。
取本品 2. 0 g,加 25 ml 无水乙醇,超声提取 40 min 后过滤,
滤液转移至 25 ml 容量瓶中,补充溶剂至刻度摇匀,制备供试品
溶液。
2. 7. 3 方法学考察
2. 7. 3. 1 线性关系考察 量取 1、3、5、7、9 与 11 μl 的毛蕊花糖
苷、大车前苷和松果菊苷对照品溶液(其浓度分别为 1. 82 mg /
ml、1. 70 mg /ml 和 1. 68 mg /ml),注入液相色谱仪,测定峰面积,
以进样量(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,作标准曲线,分别
得毛蕊花糖苷标准品溶液的回归方程:Y = 534. 51X - 4. 2667(R2
= 0. 9994),线性范围:0. 15 ~ 28. 65 μg /μl;大车前苷标准品溶液
的回归方程:Y = 417. 99X - 29. 89(R2 = 0. 9988),线性范围:0. 12
~ 31. 33 μg /μl;松果菊苷回归方程:Y = 520. 41X - 49. 706(R2 =
0. 9999),线性范围:0. 11 ~ 37. 67 μg /μl。上述三种标准品溶液
的进样量与峰面积均成良好的线性关系且标准曲线通过原点,
可采用外标一点法进行含量的测定。
2. 7. 3. 2 精密度试验 量取对照品溶液,按上述色谱条件下连续
进样 6 次,记录色谱峰面积,结果表明松果菊苷、大车前苷、毛蕊
花糖苷的峰面积 RSD 分别为 0. 11%、0. 21%、0. 38%,表明精密
度良好。
2. 7. 3. 3 重复性试验 称取短管兔耳草药材粉末(60 目)6 份,
按“供试品溶液的制备”条件进行操作,并按照上述色谱条件进
行测定,得到的松果菊苷峰、大车前苷与毛蕊花糖苷的峰面积
RSD分别为 0. 17%、0. 44%、0. 36%,结果如图 2 所示,表明重复
性良好。
2. 7. 3. 4 稳定性试验 称取“重复性试验”中同一批号的供试
品溶液,在上述色谱条件下,分别于 0、2、4、6 与 8 h 测定,记录色
谱峰面积,得到的松果菊苷、大车前苷与毛蕊花糖苷峰面积的
RSD为 0. 24%、0. 69%与 0. 54%,表明供试品溶液在 8 h 内稳定
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 10
性良好。
A:松果菊苷;B:大车前苷;C:毛蕊花糖苷
图 2 重复性实验的 HPLC图
2. 7. 3. 5 加样回收率试验 称取“重复性试验”中同一批号的
4. 0 g短管兔耳草药材粉末(60 目)6 份,分别等量加入松果菊苷、
大车前苷、毛蕊花糖苷对照品,按“供试品溶液的制备”的条件进
行操作,在上述色谱条件下进样测定并计算加样回收率,得到的
松果菊苷、大车前苷与毛蕊花糖苷的平均回收率分别为 99. 7%、
98. 9%与 98. 5%。结果见表 3 与图 3。
2. 7. 3. 6 样品测定 分别称取样品粉末 2 g,按“2. 2. 2”的条件制
成供试品溶液;分别吸取对照品溶液与供试品溶液 10 μl ,注入
液相色谱仪,测定并计算 11 批样品中松果菊苷、大车前苷与毛蕊
花糖苷的含量,结果见表 4 和图 4。基于 11 批不同样品的检测结
果,以本品干燥品计算,建议松果菊苷、大车前苷、毛蕊花糖苷的
总含量分别不得低于 0. 2%、0. 01%与 0. 1%。
表 3 加样回收率试验
药材中含量
/mg
加入量
/mg
测得总量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
松果菊苷 0. 83 0. 84 1. 64 99. 3 99. 7 ± 1. 230
0. 83 0. 84 1. 65 99. 6
0. 83 0. 84 1. 69 102. 1
0. 83 0. 84 1. 65 99. 5
0. 83 0. 84 1. 64 99. 3
0. 83 0. 84 1. 63 98. 5
大车前苷 0. 13 0. 85 0. 97 98. 9 98. 9 ± 1. 443
0. 13 0. 85 0. 99 101. 0
0. 13 0. 85 0. 95 96. 9
0. 13 0. 85 0. 97 98. 9
0. 13 0. 85 0. 96 98. 0
0. 13 0. 85 0. 98 100
毛蕊花糖苷 0. 53 0. 91 1. 45 100. 6 98. 5 ± 1. 169
0. 53 0. 91 1. 42 98. 6
0. 53 0. 91 1. 41 97. 9
0. 53 0. 91 1. 42 98. 6
0. 53 0. 91 1. 40 97. 2
0. 53 0. 91 1. 41 97. 9
A:松果菊苷;B:大车前苷;C:毛蕊花糖苷
图 3 回收率实验的 HPLC图
表 4 样品中毛蕊花糖苷、大车前苷与松果菊苷的含量
编号 地点 经纬度 海拔 /m 松果菊苷 /% 大车前苷 /% 毛蕊花糖苷 /%
ELS 青海省清根河 N 35°2929. 9″ E 99°3031. 7″ 4426 0. 29 0. 01 0. 31
JLL 青海省降路岭 N 35°2341. 8″ E 99°1828. 7″ 4456 0. 18 0. 02 0. 17
QLSYC 青海省祁连山垭口 N 38°723. 8″ E 100°196. 8″ 3900 0. 21 0. 03 0. 13
DBS 青海省达坂山 N 37°2050. 5″ E 101°242. 8″ 3983 0. 19 0. 01 0. 12
MQX 青海省大武镇 N 34°2958. 3″ E 100°458. 2″ 4305 0. 18 0. 02 0. 18
QZS 青海省青珍乡垭口 N 34°1354. 6″ E 100°149. 7″ 4390 0. 25 0. 01 0. 30
ZQX 青海省知钦乡 N 32°4750. 9″E100°3354. 5″ 4599 0. 20 0. 03 0. 16
GLSBT 青海省巴塘镇 N 32°5136. 6″ E 96°5839. 6″ 3958 0. 14 0. 04 0. 07
HXSYC 青海省哈秀山垭口 N 33°1648. 9″ E 95°1737. 8″ 4622 0. 21 0. 02 0. 13
DJX 青海省当江乡 N 33°385. 1″ E95°5047. 7″ 4618 0. 20 0. 02 0. 13
CSTS 青海省长石头山 N 35°256. 1″ E98°96. 5″ 4211 0. 23 0. 03 0. 14
A:松果菊苷;B:大车前苷;C:毛蕊花糖苷
图 4 含量测定实验的 HLPC图
4 结论
本文考察了青海地区 11 个不同产地短管兔耳草药材的性
状、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物等;以三氯甲烷 -
甲醇 -水(5∶ 5∶ 2)为展开剂,以梓醇为对照品,建立薄层鉴别
方法,展开显色后分离度较好,斑点清晰,重复性好,且方法简便、
快捷、可行,故该方法可作为短管兔耳草药材的定性鉴别依据;利
用高效液相色谱方法,以松果菊苷、大车前苷和毛蕊花糖苷作为
指标性成分建立了短管兔耳草药材的含量测定方法,建议松果菊
苷、大车前苷和毛蕊花糖苷的总含量分别不得低于 0. 2%、
0. 01%、0. 1%,为短管兔耳草药材质量控制进一步提供依据。
本文建立的短管兔耳草药材质量控制方法操作简便,具有较
好的实用性和可靠性,可用于短管兔耳草药材的质量控制。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 10 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 10 期
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收稿日期:2016-03-08; 修订日期:2016-07-25
基金项目:国家自然科学基金(No. 81274166)
作者简介:郑倩倩(1989 -),女(汉族),山东济宁人,三峡大学硕士研究
生,学士学位,主要从事中药药效评价与新药研究工作.
* 通讯作者简介:李世刚(1971 -),男(汉族),甘肃兰州人,三峡大学副教
授,博士学位,主要从事中药药效评价与新药研究工作.
资木瓜乙酸乙酯萃取物对
RBL - 2H3 细胞脱颗粒的影响
郑倩倩,柳 蔚,喻玲玲,陈先勇,李世刚*
(三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002)
摘要:目的 研究资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原诱导的 RBL - 2H3 细胞脱颗粒的影响,并初步探讨其作用机制。方
法 采用 MTT法测定不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞活性的影响,采用底物法检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取
物对不同抗原引起的细胞内 β -氨基己糖苷酶释放的影响,采用流式细胞分析仪检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对
细胞表面受体 FcεRIα表达的影响。结果 在一定浓度范围内,对细胞活性没有显著性影响的资木瓜乙酸乙酯萃取物可
显著抑制细胞内 β -氨基己糖苷酶的释放和降低细胞表面受体 FcεRIα的表达,且呈量效关系。结论 资木瓜乙酸乙酯萃
取物对 RBL - 2H3 细胞脱颗粒具有显著的抑制作用,其作用可能与 RBL - 2H3 细胞表面受体 FcεRIα的表达降低有关。
关键词:资木瓜乙酸乙酯萃取物; RBL - 2H3 细胞; 细胞活性; β -氨基己糖苷酶; FcεRIα
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2016. 10. 017
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)10-2356-03
Effects of Chaenomeles speciosa ethyl acetate extract on the degranulation of RBL - 2H3
cells
ZHENG Qian-qian,LIU Wei,YU Ling-ling,CHEN Xian-yong,LI Shi-gang*
(Medical College of China Three Gorges University,Yichang Hubei 443002,China)
Abstract:Objective To investigate the influence of Chaenomeles speciosa ethyl acetate extract on the degranulation of rat baso-
philic leukemia cells (RBL - 2H3)and to research the possible mechanism. Methods The effect of different density of
Chaenomeles speciosa ethyl acetate on the cell viability of RBL - 2H3 cells by MTT assay;The effect of different density of
Chaenomeles speciosa ethyl acetate on the releasing rate of β - hexosaminidase enzyme of RBL - 2H3 cells by Substrated method;
The effect of different density of Chaenomeles speciosa ethyl acetate on the surface expression of receptor FcεRIα of RBL - 2H3
cells by Flow cytometry. Results Chaenomeles speciosa ethyl acetate extract has no significant effect on cell activity in some densi-
ty,but it can significantly decrease the release of β - hexosaminidase and the expression of cell surface receptor FcεRIα. Con-
clusion Chaenomeles speciosa ethyl acetate extract can inhibit the degranulation of RBL - 2H3 cells in a dose - dependent manner
and the mechanism may related to the down - regulated expression of cell surface receptor FcεRIα.
Key words:Chaenomeles speciosa ethyl acetate extract; RBL - 2H3cells; Cell viability; β - hexosaminidase; FcεRI
肥大细胞作为一种天然免疫效应细胞,参与机体多种免疫疾
病的发生如过敏性疾病、皮肤炎症等,其脱颗粒反应在此发生发
展过程中发挥重要作用[1,2]。因此,抑制肥大细胞脱颗粒可能是
治疗相关疾病的关键所在。易于体外培养的大鼠嗜碱性粒细胞
性白血病细胞(RBL - 2H3)具有与肥大细胞相似的脱颗粒功能
和脱颗粒途径,被认为是体外研究肥大细胞脱颗粒的最佳替代模
型[3,4]。β -氨基己糖苷酶是 RBL - 2H3 细胞脱颗粒的重要标志
物,通过检测 β -氨基己糖苷酶的释放来反应细胞脱颗粒程度,
以此评价药物的药效[5]。现代药理学研究证实[6],木瓜提取物
具有抗炎镇痛、免疫调节等功效。本研究旨在细胞水平上,以抗
原 A23187、DNP - BSA 为脱颗粒工具,以 β -氨基己糖苷酶为评
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 10