全 文 ：书·研究报告·
收稿日期:2013 － 11 － 11
基金项目:国家自然科学基金(编号:30860161) ;云南省教育厅科学研
究基金(编号:2013 Z 040)。
作者简介:陈名红(1974 －) ，男(土家族) ，在读博士研究生，副教授，研
究方向:植物分子生物学;E-mail:cmhkm99@ 163． com。
通讯作者:李成云(1964 －) ，男，博士，教授，研究方向:植物分子生物
学;E-mail:li． chengyun@ gmail． com。
适于百合遗传多样性分析的 ＲAPD引物筛选
陈名红1，2， 刘 多1， 熊华斌1， 杜 刚1， 熊 勇1， 李成云2
(1．云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室， 昆明 650031;
2．云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室， 昆明 650201)
摘要:为筛选出适于百合遗传多样性分析的 ＲAPD有效引物，利用 48 个 ＲAPD随机引物，对百合属的黄天霸、西伯利亚、
兰州百合和川百合进行 PCＲ扩增，共筛选出 8 条多态性丰富、条带清晰且可重复性好的有效引物，8 条引物在 4 个样品
中共扩增出 112 条 DNA带，其中 78 条为多态性带，占总扩增带数的 69． 6%，平均每个引物扩增出 14 条带。该研究为应
用 ＲAPD标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了基础。
关键词: 百合属;ＲAPD标记;引物;筛选
中图分类号: S 644． 1 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2014)03-0001-03
ＲAPD Primers Screening Suitable for Genetic Diversity Analysis in Lilium
CHEN Ming-hong1，2，LIU Duo1，XIONG Hua-bin1，DU Gang1，XIONG Yong1，LI Cheng-yun2
(1． Key Laboratory of Ethnic Medicine Ｒesource Chemistry，State Ethnic Affairs Commission ＆
Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031，China;
2． Key Laboratory of the Ministry of Educational for Agro-biodiversity and Pests Control，
Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract:The aim was to provide effective primers suitable for genetic diversity analysis in Lilium with ＲAPD
markers． 48 ＲAPD primers were used in the ＲAPD-PCＲ amplification for Manissa，Siberia，L． davidii var．
unicolor and L． davidii，and 8 effective primers with characteristics of rich polymorphism，clear bands and good
repeatability were screened． 112 DNA bands were obtained，of which 78 bands were polymorphic，accounting
for 69． 6% of the total amplified bands． And 14 bands could be amplified with a primer，averagely． The
research results will lay the foundation for the study on genetic diversity analysis，cultivar identification of
Lilium at the molecular level．
Key words: Lilium;ＲAPD markers;primer;screening
广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的
遗传信息的总和，而一般所指的遗传多样性是指种内
不同种群之间或一个种群内不同个体之间的遗传变异
总和。遗传多样性研究是植物种质资源保护及开发利
用的重要基础［1］。百合(Lilium spp．)是单子叶植物亚
纲百合科(Liliaccae)百合属(Lilium)植物的总称，为多
年生鳞茎草本植物，是一种集药用、食用、观赏于一体
的重要花卉［2］。百合属植物种类多、分布广，其遗传
多样性大多与其地域起源及分布有关，目前，国内外学
者已在表型、染色体、蛋白质及 DNA 分子水平对百合
属间、属内、种间及种内的遗传多样性进行了较为系统
的研究，揭示了百合属植物丰富的遗传多样性，为进一
步研究、保护、开发及利用宝贵的百合属植物种质资源
提供了重要的科学依据［3］。但从百合属植物丰富的
种质资源及其不可估量的生态和经济价值等角度来分
析，其遗传多样性研究，尤其是利用分子标记技术进行
遗传多样性分析还较有限。
ＲAPD是美国的 Williams 与 Welsh 2 个研究小组
于 1990 年同时提出的 1 种 DNA 分子标记技术［4，5］。
ＲAPD 技术建立在 PCＲ 技术基础上，用一系列(通常
数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链
(一般为 8 ～ 10 bp)作为引物，对所研究的基因组 DNA
进行单引物扩增，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染
色来显示扩增 DNA片段的多态性，扩增片段多态性反
·1·
研究报告 陈名红 等:适于百合遗传多样性分析的 ＲAPD引物筛选
表 1 实验所用的引物及其序列
引物 序列(5 ～ 3) 引物 序列(5 ～ 3) 引物 序列(5 ～ 3)
SBSD 01 ACCGCGAAGG SBSE 12 TTATCGCCCC SBSH 08 GAAACACCCC
SBSD 02 GGACCCAACC SBSE 13 CCCGATTCGG SBSH 09 TGTAGCTGGG
SBSD 03 GTCGCCGTCA SBSE 14 TGCGGCTGAG SBSH 10 CCTACGTCAG
SBSD 04 TCTGGTGAGG SBSG 01 CTACGGAGGA SBSH 14 ACCAGGTTGG
SBSD 05 TGAGCGGACA SBSG 04 AGCGTGTCTG SBSH 15 AATGGCGCAG
SBSD 07 TTGGCACGGG SBSG 05 CTGAGACGGA SBSH 18 GAATCGGCCA
SBSD 09 CTCTGGAGAC SBSG 09 CTGACGTCAC SBSM 10 TCTGGCGCAC
SBSD 13 GGGGTGACGA SBSG 10 AGGGCCGTCT SBSM 11 GTCCACTGTG
SBSD 16 AGGGCGTAAG SBSG 11 TGCCCGTCGT SBSM 13 GGTGGTCAAG
SBSD 17 TTTCCCACGG SBSG 12 CAGCTCACGA SBSM 14 AGGGTCGTTC
SBSE 01 CCCAAGGTCC SBSG 13 CTCTCCGCCA SBSM 15 GACCTACCAC
SBSE 02 GGTGCGGGAA SBSG 17 ACGACCGACA SBSM 16 GTAACCAGCC
SBSE 03 CCAGATGCAC SBSH 01 GGTCGGAGAA SBSM 17 TCAGTCCGGG
SBSE 06 AAGACCCCTC SBSH 02 TCGGACGTGA SBSM 18 CACCATCCGT
SBSE 07 AGATGCAGCC SBSH 06 ACGCATCGCA SBSM 19 CCTTCAGGCA
SBSE 09 CTTCACCCGA SBSH 07 CTGCATCGTG SBSM 20 AGGTCTTGGG
映了基因组相应区域的 DNA 多态性［3］。相对于传统
的酶学、ＲFLP 等方法，ＲAPD 标记具有操作快速、简
便、多态性丰富、适应性广等诸多优点，现已广泛应用
于遗传图谱构建、基因定位，特别是遗传多样性的检
测［6］。由于 ＲAPD标记技术应用随机引物，当对大量
实验材料进行研究时，往往首先要对引物进行筛
选［7］。本实验以百合属黄天霸、西伯利亚、兰州百合
和川百合为材料，通过 ＲAPD 标记技术对 48 个 10 碱
基的随机引物进行筛选，以期为应用 ＲAPD 标记技术
进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研
究奠定良好基础。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
本实验所用的材料为黄天霸、西伯利亚、兰州百合
和川百合。采取新鲜幼嫩无病虫害的叶片，放入塑料
封口袋，硅胶干燥后备用。
1． 2 基因组 DNA的提取
采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA，具体步骤
为:取 0． 2 g硅胶干燥的叶片，在液氮中迅速研磨成细
粉末后转入 1． 5 mL 离心管中;加入 600 μL 65 ℃预热
的 2 × CTAB 提取缓冲液(2% CTAB，W/V，1． 4 mol /L
NaCl，20 mmol /L EDTA，pH = 8． 0，100 mmol /L Tris-
HCl，pH = 8． 0，2% β-巯基乙醇 V /V) ，迅速混匀，置于
65 ℃水浴 1 h，期间每隔几分钟摇动 1 次;冷却，4 ℃
12 000 r /min 离心 10 min;取上清液，加入等体积的氯
仿 ∶异戊醇(24 ∶ 1) ，振荡混匀 10 min;12 000 r /min 离
心 10 min;取上清液，加入 3 /4 体积的异丙醇，混匀后
－ 20 ℃静置 30 min;10 000 r /min离心 5 min，70%乙醇
洗 3 次;自然风干后加 30 ～ 50 μL 1 × TE(10 mmol /L
Tris-HCl，1 mmol /L EDTA) ，室温静置 2 h，使
DNA充分溶解;每管内加 1 mg /mL 的 ＲNA
酶 1 μL，37 ℃下消化 30 min，65 ℃水浴处理
10 min使酶失活，－ 20 ℃保存备用。
1． 3 PCＲ反应与电泳检测
反应体系为:1 × PCＲ buffer、40 ng 模板
DNA、1． 5 mmol /L Mg2 +、1． 0 U TaqDNA 聚合
酶、1． 0 μmol /L 随机引物(引物由北京赛百
盛基因技术有限公司合成，引物及其序列见
表 1)、200 μmol /L dNTPs，总体积为 25 μL;扩
增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
30 s，37． 3 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 90 s，共 40
个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。ＲAPD-PCＲ
扩增产物在 1． 2%琼脂糖凝胶上，于 3 ～ 5 V /
cm的电场中电泳 1 h，在凝胶成像系统中观
察、照相并记录。
2 结果与分析
2． 1 ＲAPD标记的引物筛选结果
本实验共利用 48 个 ＲAPD 引物分别对 4 个样品
即黄天霸、西伯利亚、兰州百合和川百合基因组 DNA
进行 PCＲ扩增，根据照相记录，在筛选出清晰且可重
复的 4 个样品中都有扩增带的引物，最终筛选出 8 条
多态性丰富、条带清晰、重复性好的有效引物即
SBSD 03、SBSD 16、SBSE 02、SBSE 13、SBSE 14、
SBSG 05、SBSG09 和 SBSH01。筛选出的 8 个引物在 4
个样品中的 PCＲ扩增图谱见图 1、2。
M:Marker DL 2000;1:黄天霸;2:西伯利亚;
3:兰州百合;4:川百合。下同。
图 1 引物 SBSD 03、SBSD 16、SBSE 02、
SBSE 13 的 ＲAPD-PCＲ扩增结果
2． 2 ＲAPD标记数据统计及扩增结果
分别读取筛选出来的 8 个引物的扩增产物 ＲAPD
条带，结果如表 2。由表 2 可知，8 个引物在 4 个百合
样品中共扩增出 112 条 DNA 条带，其中 78 条为多态
性条带，占扩增总条带数的 69． 6%，平均每个引物产
生 14 条带和 9． 8 条多态性带。不同引物扩增的总带
数和多态性带数差异较大，扩增条带数最多的引物为
·2·
第 33 卷 第 3 期 2014 年 3 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 3 Mar． 2014
图 2 引物 SBSE 14、SBSG 05、SBSG 09、
SBSH 01 的 ＲAPD-PCＲ扩增结果
SBSD 16，达到了 20 条，扩增条带最少的引物为
SBSD 03和 SBSG 09，扩增出的条带均为 11 条;而多态
性最高的引物为 SBSE 14 和 SBSH 01，均达到了
86． 7%，最低的为 SBSE 02，仅有 53． 8%。
表 2 8 个引物在 4 个样品中的扩增结果
引物 序列(5 ～ 3) 扩增带数 多态性
带数
多态率
(%)
SBSD 03 GTCGCCGTCA 11 9 81． 8
SBSD 16 AGGGCGTAAG 20 11 55
SBSE 02 GGTGCGGGAA 13 7 53． 8
SBSE 13 CCCGATTCGG 15 9 60
SBSE 14 TGCGGCTGAG 15 13 86． 7
SBSG 05 CTGAGACGGA 12 10 83． 3
SBSG 09 CTGACGTCAC 11 6 54． 5
SBSH 01 GGTCGGAGAA 15 13 86． 7
一般来说，在大部分样品中不能产生 DNA扩增带
的引物，说明与该类种质基因组 DNA 的同源性较低，
在对种质资源的 ＲAPD 研究中不宜用作合适的引物，
而通常筛选出能在所有样品中产生清晰、可重复的
DNA扩增带的引物用于正式的种质资源大规模材料
的 ＲAPD标记研究［8］。为验证本实验所筛选出的引
物的有效性，分别用这 8 个引物对 24 份百合种质材料
进行了 ＲAPD-PCＲ 扩增，扩增结果不仅多态性丰富，
而且条带清晰、重复性好，说明本研究筛选出的引物对
百合 ＲAPD-PCＲ扩增是有效的、可靠的。图 3 为引物
SBSE 13 对 24 份百合种质材料的 ＲAPD-PCＲ 扩增
图谱。
M:Marker DL 2000;1 ～ 24:24 份百合种质材料。
图 3 引物 SBSE 13 的 ＲAPD-PCＲ扩增结果
3 讨 论
ＲAPD标记技术是出现最早的分子标记技术之
一，其操作简便、成本较低及不需要 DNA 的序列材料
等特点是其他标记技术无法比拟的［9］。但 ＲAPD 标
记也存在某些不足，其中最主要的是其灵敏度高，受反
应条件影响较大，检测的重复性较差，因此，研究者在
利用 ＲAPD标记技术进行遗传多样性分析时一定要严
格控制实验条件，采用稳定优化的反应体系方能取得
理想的实验结果［10］。同时，在运用 ＲAPD 标记技术
时，由于每个随机引物并不适合于所有物种，因此对引
物的筛选是非常必要的，筛选出多态性丰富、稳定性好
的随机引物是整个实验成功的关键［11］。本实验以百
合属植物黄天霸、西伯利亚、兰州百合和川百合为供试
材料，从 48 个 ＲAPD引物中成功筛选出 8 条多态性丰
富、条带清晰且可重复性好的有效引物，8 条引物共扩
增出 112 条 DNA带，其中 69． 6%为多态性带。为应用
ＲAPD标记技术快速、准确地进行百合属植物遗传多
样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了良好基础。
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