全 文 ：中国农学通报 2013,29(04):118-122
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家自然科学基金“云南水稻地方品种稻瘟病菌信号分子关键受体及其在互作中的作用”(30860161)；云南省教育厅科学研究基金“不同
功能百合种质资源遗传多样性研究”(2011Y212)。
第一作者简介：陈名红，男，1974年出生，副教授，在读博士生，研究方向为植物分子生物学。通信地址：650031云南省昆明市一二一大街134号云南
民族大学招生就业处，Tel：0871-5134923，E-mail：cmhkm@yahoo.com.cn。
通讯作者：李成云，男，1964年出生，教授，博士，研究方向为植物分子生物学。通信地址：650201云南省昆明市黑龙潭云南农业大学植物保护学院，
Tel：0871-5227552，E-mail：li.chengyun@gmail.com。
收稿日期：2012-08-21，修回日期：2012-10-19。
百合属 ISSR反应条件优化的研究
陈名红 1,2，李 玉 1，刘 多 1，熊华斌 1，李成云 2
（1云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，昆明 650031；
2云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明 650201）
摘 要：建立一个稳定性高、重现性好，适合百合 ISSR遗传差异分析的PCR反应体系。设定反应体系中
各因子的不同浓度并进行PCR扩增，依据稳定性高、重现性好的原则，对该反应体系进行调整与优化，
最终建立稳定可靠的 ISSR反应体系。适于百合 ISSR-PCR反应的最佳体系(25 μL)为：40 ng模板DNA，
2.0 mmol/L Mg2+，1.5 U TaqDNA聚合酶，0.8 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs；扩增程序为：94℃预变性5
min；94℃变性1 min，51.8℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35个循环；最后72℃延伸8 min。所建立的百
合 ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、检测多态性能力强等特点，为应用 ISSR标记技术进行百合
属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。
关键词：百合属；简单重复间隔序列；反应体系；优化
中图分类号：S682.2+9 文献标志码：A 论文编号：2012-2888
The Optimization of ISSR Reaction Conditions of Lilium
Chen Minghong1,2, Li Yu1, Liu Duo1, Xiong Huabin1, Li Chengyun2
(1Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education,
Yunnan University of Nationalities, Kunming 650031;
2Key Laboratory of the Ministry of Educational for Agro-biodiversity and Pests Control,
Yunnan Agricultural University, Kunming 650201)
Abstract: The aim was to establish a stable, reproducible, and suitable reaction system of Lilium for ISSR
analysis of genetic differences. PCR amplifications were carried out until the different concentrations of the
factors in the ISSR reaction system were designed, and based on the principle of high stability and
reproducibility, the stable and reliable ISSR reaction system was eventually established after a series of
adjustment and optimization of the reaction system. The optimum ISSR-PCR reaction system (25 μL)
contained 40 ng DNA template, 2.0 mmol/L Mg2 + , 1.5 U TaqDNA polymerase, 0.8 μmol/L ISSR primer and
200 μmol/L dNTPs. The reaction mixtures were pre-denatured at 94℃ for 5 min and subjected to 35 cycles of
1 min at 94℃ , 1 min at 51.8℃ , 2 min at 72℃ , and a final extension step of 8 min at 72℃ . The ISSR-PCR
systems showed stable reaction system, better repeatability, and reliable abundant polymorphisms. This
reaction system could provide a technological base for the study on genetic polymorphism analysis, cultivar
identification of Lilium at the molecular level.
Key words: Lilium; ISSR; reaction system; optimization
陈名红等：百合属 ISSR反应条件优化的研究
0 引言
百合 (Lilium spp.)是单子叶植物亚纲百合科
(Liliaccae)百合属(Lilium)植物的总称，为多年生鳞茎
草本植物，具有很高的药用、食用和观赏价值，主要分
布于北半球的温带和寒带地区，中国、日本及朝鲜分布
甚广。中国境内百合属种质资源极为丰富，且特有种
很多，据调查，中国约有47个种18个变种，占世界百合
总数的50%以上，其中有36个种15个变种为中国所特
有；中国也是世界百合起源的中心，具有十分悠久的栽
培历史，早在 1400多年以前就有人工栽培的记载 [1]。
虽然百合作为药用、食用及观赏用的重要花卉利用的
历史已十分悠久，但其分子遗传学方面的基础研究还
较为滞后，目前针对百合开展遗传分子标记研究的报
道甚少，主要也以RAPD标记技术研究野生百合居群
遗传多样性为主 [2-4]。ISSR是由加拿大蒙特利大学
Ziekiewicz等[5]于 1994年基于SSR标记创建来的一种
新型分子标记技术，其基本原理就是在 SSR的 3′或
5′端加锚1~4个随机核苷酸作为引物，对两侧具有反
向排列 SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电
泳、染色，根据所读取的谱带有无及相对位置差异，来
分析不同样品间 ISSR标记的多态性。由于 ISSR标记
技术结合了RAPD和SSR技术的优点，实验操作简便
快捷、重复性高、稳定性好、成本较低、所揭示的遗传多
态性十分丰富，因此，ISSR技术已被广泛应用于植物
遗传多样性、系统发育、品种鉴定、基因定位、遗传作图
等研究中[6-10]。本研究利用单因素实验方法，对影响百
合 ISSR-PCR反应体系中的6个主要因素（模板DNA、
Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、退火温度）进行了
优化筛选，建立了适于百合 ISSR-PCR扩增反应的最
佳体系，为应用 ISSR标记技术进行百合属植物遗传多
样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以栽培于云南民族大学民族药资源化学国家民
委-教育部重点实验室的卷丹百合为实验材料，共8个
个体。采取新鲜幼嫩无病虫害的叶片，放入塑料封口
袋，硅胶干燥后备用。
1.2 基因组DNA提取与检测
采用改良的CTAB法提取基因组DNA，具体步骤
为：取 0.2 g硅胶干燥的叶片，在液氮中迅速研磨成细
粉末后转入1.5 mL离心管中；加入600 μL 65℃预热的
2×CTAB提取缓冲液（2% CTAB，W/V，1.4 mol/L NaCl，
20 mmol/L EDTA，pH 8.0，100 mmol/L Tris-HCl，pH
8.0，2% β-巯基乙醇 V/V），迅速混匀，置于 65℃水浴
1 h，期间每隔几分钟摇动一次；冷却，4℃12000 r/min
离心 10 min；取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇
(24:1)，振荡混匀 10 min；12000 r/min离心 10min；取上
清液，加入 3/4 体积的异丙醇，混匀后 -20℃静置
30 min；10000 r/min离心 5 min，70%乙醇洗 3次；自然
风干后加30~50 μL 1×TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L
EDTA)，室温静置 2 h，使 DNA充分溶解；每管内加
1 mg/mL的RNA酶1 μL，37℃下消化30 min，65℃水浴
处理10 min使酶失活，-20℃保存备用。
1.3 单因子实验确定 ISSR-PCR的最佳反应体系
以叶片基因组DNA为模板，单因子考察因素为模
板DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs的量。随
机选取一个个体的卷丹百合叶为样品，引物参照哥伦
比亚大学提供的序列(UBC 801-UBC 900)，由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成，经初步筛选，以引
物UBC 811（序列为 5GAGAGAGAGAGAGAGAC3）
作为实验引物，对影响PCR反应的因素进行最适条件
考察。对影响扩增的主要参数设置了不同梯度处理，
反应总体积为25 μL，其中DNA模板浓度设置20、40、
60、80、100 ng 5个梯度；Mg2 +浓度设置 0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0 mmol/L 6个梯度；TaqDNA聚合酶设置
0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U 5个梯度；引物浓度设置 0.2，
0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 μmol/L 6个梯度；dNTPs设 100、
150、200、250、300 μmol/L 5个梯度。根据Tm值设定
退火温度为 45.7~54.1℃，PCR仪自动生成 8个温度梯
度：45.7、46.6、47.7、49、50.4、51.8、53、54.1℃。每一合
适条件确定后将作为后续研究的一个条件。反应程序
为：预变性 94℃ 5 min，变性 94℃ 1 min，复性 45.7~
54.1℃ 1 min，延伸 72℃ 2 min，35个循环，72℃延伸
8 min。ISSR-PCR扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上，于
3~5 V/cm的电场中电泳 1 h，在凝胶成像系统中观察、
照相。
2 结果与分析
2.1 百合叶片基因组DNA的提取
实验结果发现，采用改良CTAB法在提取过程中
未出现多酚类物质的褐化，获得的沉淀物呈无色透明
状，能迅速溶解于低盐 TE。所获得的叶片基因组
DNA质量好，在1%的琼脂糖胶电泳上主带清晰明亮，
RNA去除干净，无降解现象或降解很少，分子量大于
23 kb，且质量比较稳定，所有样品的带除浓度有所差
别外，带型基本整齐一致。用紫外分光比色法对所提
取的 8份卷丹百合基因组DNA纯度进行定量检测，
OD260/OD280的比值均介于1.7~2.0之间，DNA浓度均达
到 0.6 μg/μL以上，说明所获得的DNA质量和纯度均
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达到了 ISSR-PCR扩增的模板要求。
2.2 模板DNA浓度对 ISSR-PCR的影响
DNA模板的含量是制约PCR扩增产物得率及特
异性的一个重要因素，模板含量过低，分子碰撞的机率
低，偶然性大，扩增产物无或不稳定；模板浓度含量过
高，又会相应增加非特异性产物的扩增[11]。本研究从
20 ng开始，考察 5个不同浓度的模板量，在其他成分
不变的情况下，只改变模板DNA的量，进行相同条件
的 PCR扩增。不同浓度DNA模板的 ISSR-PCR扩增
结果见图 1。从图 1可知，模板量在 40~80 ng之间时，
PCR扩增主条带基本一致，模板量为 40 ng时所得到
的 ISSR指纹图谱最为清晰。当模板量大于 100 ng时
扩增出的带型开始变得模糊；当模板量低于20 ng时，
扩增结果表现为条带弱。因此基于相同带型下模板用
量最少的原则，最终采用的DNA模板量约为40 ng。
2.3 Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Mg2+作为 ISSR-PCR反应中的一个主要因素，其
浓度的大小对整个PCR反应中的Taq DNA聚合酶的
活性、引物的退火温度以及PCR扩增条带的特异性都
有一定的影响[12]。本实验分别以6个不同浓度的Mg2+
对引物UBC811进行了 PCR扩增。经 PCR扩增后电
泳条带见图 2。反应结果显示，在相同的反应条件下
进行 PCR扩增时，Mg2+浓度在 1.5~2.5 mmol/L时能产
生较清晰的 ISSR条带。当Mg2+浓度大于 3.0 mmol/L
时扩增条带变得不清晰，当Mg2+浓度低于 1.0 mmol/L
时无扩增条带或者条带不清晰。最佳反应用量为
2.0 mmol/L。
2.4 TaqDNA聚合酶对 ISSR-PCR的影响
在PCR扩增反应中，Taq DNA聚合酶的使用量及
质量直接关系到反应的稳定性与重现性。不同生产厂
家及不同生产批次的Taq DNA聚合酶在活性上可能
存在较大的差异，因此相关研究报道酶的使用量出入
较大。但总体来看，如果酶浓度过低则不能扩增，浓度
太高又会产生非特异性扩增且增加成本[13]。为确定最
佳酶浓度，本实验选择了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U 5个梯
度进行PCR扩增的考察。不同单位Taq DNA聚合酶
的 ISSR-PCR扩增结果见图 3。在 25 μL体系中，加入
1.5 U Taq DNA酶就可以获得重现性好而又清晰的条
带，而随着酶用量的不断加大，扩增的条带也逐渐变得
越来越模糊且会出现一些非特异性条带。鉴于 Taq
DNA酶的成本较高，所以在确保实验结果稳定可靠的
前提下，选择了1.5 U Taq DNA酶为最终的用量。
2.5 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
引物浓度大小对 PCR扩增的带型会产生明显的
影响，浓度过低时PCR产率会大大降低，甚至不能扩
增；浓度过高时会引起错配和非特异性产物的出现
M：Marker DL2000；泳道1~5：DNA模板分别为20、40、60、80、100 ng，
由UBC811扩增
图1 不同浓度DNA模板的 ISSR-PCR扩增结果
M：Marker DL2000；泳道1~6：Mg2+浓度分别为0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0 mmol/L，由UBC811扩增
图2 不同Mg2+浓度的 ISSR-PCR扩增结果
M：Marker DL2000；泳道1~5：Taq DNA聚合酶分别为0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5 U，由UBC811扩增
图3 不同单位Taq DNA聚合酶的 ISSR-PCR扩增结果
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6
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陈名红等：百合属 ISSR反应条件优化的研究
[12]。本实验共设置了6个引物浓度梯度，结果如图4所
示：当引物浓度小于 0.4 μmol/L时，无扩增条带出现；
引物浓度为0.6 μmol/L时，扩增条带较弱；引物浓度为
1.2 μmol/L时，扩增条带逐渐变得模糊且非特异性扩
增明显增强。相对而言，引物浓度为0.8 μmol/L时，扩
增条带清晰，亮度适宜，重现性好，是较为理想的浓度。
2.6 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
dNTPs是 PCR扩增的原料，其浓度过高会导致
PCR错配，从而出现非特异性扩增，浓度过低又会影
响扩增效果，甚至会因为dNTPs过早消耗使产物单链
化[14]。为了确定最适 dNTPs的用量，本实验设置了从
100~300 μmol/L共 5个 dNTPs梯度进行梯度筛选，结
果见图 5。当 dNTPs浓度低于 100 μmol/L时，无任何
扩增条带；当 dNTPs浓度为 150 μmol/L时，虽然有扩
增，但条带少且相对较弱，产物不稳定；当dNTPs浓度
高于 250 μmol/L时，扩增条带越来越变得不清晰。从
整体效果来看，dNTPs浓度为 200 μmol/L时，条带清
晰，背景干净，因此百合 ISSR-PCR反应中最佳 dNTPs
浓度为200 μmol/L。
2.7 退火温度对 ISSR-PCR的影响
ISSR-PCR反应中，退火温度直接影响到引物与模
板的特异性结合，退火温度过低易导致非特异性扩增，
重复性降低；温度过高又使条带减少，导致一些可能反
应多态性的条带消失[15]。本实验在综合上述各因素最
佳水平的基础上，设置最低温度为45.7℃，最高温度为
54.1℃，在 PCR扩增仪上自动生成 8个梯度温度。如
图6所示，当温度为45.7、46.6、53.0、54.1℃时扩增条带
较少且亮度较弱；当温度为47.7、49.0、50.4℃时扩增条
带明显增多，但呈弥散状态，模糊难以辨认；当温度为
51.8℃时，条带较为清晰，无非特异性扩增，并且在重
复实验中也得到了比较稳定的结果。因此，百合
ISSR-PCR反应体系的退火温度选用51.8℃较为合适。
3 结论与讨论
本研究通过对 ISSR-PCR扩增反应体系的调整与
优化，筛选出了适于百合 ISSR遗传差异分析的 PCR
反应体系：1×PCR buffer、40 ng模板DNA、2.0 mmol/L
Mg2 +、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.8 μmol/L引物、200
μmol/L dNTPs，总体积为25 μL；扩增程序为：94℃预变
性 5 min；94℃变性 1 min，51.8℃退火 1 min，72℃延伸
2 min，共35个循环；最后72℃延伸8 min。
ISSR分子标记技术基于PCR扩增反应，其扩增结
果容易受到诸多因素的影响，如DNA模板的浓度与纯
度、Mg2+的浓度、引物与 dNTPs的使用量、扩增程序与
循环周期等[16]，因此需要优化固定PCR反应的各项条
件，以期实验结果稳定性和可重复性均较好。本实验
结果表明，ISSR-PCR扩增反应对模板DNA的用量不
是特别敏感，在25 μL的反应体系中模板DNA用量在
40~60 ng都可以获得比较一致的扩增结果；而Mg2+浓
M：Marker DL2000；泳道1~6：引物浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/L
图4 引物(UBC811)不同浓度的 ISSR-PCR扩增结果
M：Marker DL2000；泳道1~5：dNTPs的浓度分别为100、150、200、250、
300 μmol/L，由UBC811扩增
图5 不同浓度dNTPs的 ISSR-PCR扩增结果
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5
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度对PCR产率和产物多态性水平均有着关键影响，当
Mg2+浓度低于1.0 mmol/L时，无扩增产物出现，当浓度
高于 3.0 mmol/L时扩增条带变得不清晰；Taq DNA聚
合酶的质量直接决定着PCR扩增的稳定性与重现性，
因此选择优质的Taq DNA聚合酶是实验成功的重要
保证；引物浓度同样也影响 ISSR-PCR扩增结果，浓度
低于 0.4 μmol/L时无扩增条带出现，浓度高于 1.2
μmol/L时，扩增条带逐渐变得模糊且非特异性扩增明
显增强；在 ISSR-PCR扩增反应中，退火温度明显影响
扩增条带的式样，本研究也证实了这一点。本研究通
过对上述 ISSR-PCR反应体系及反应参数的调整与优
化，建立了适合百合进行 ISSR-PCR扩增的反应体系
和扩增程序，该体系的建立为今后利用 ISSR标记技术
进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研
究奠定了技术基础。
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M：Marker DL2000；泳道1~8：退火温度分别为45.7、46.6、47.7、49.0、50.4、51.8、53.0、54.1℃，由UBC811扩增
图6 不同退火温度下的 ISSR-PCR扩增结果
2000 bp
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100 bp
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