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响应面法优化苦荞皮中总黄酮超声波提取工艺的研究



全 文 : 响应面法优化苦荞皮中总黄酮超声波提取工艺的研究
赵 强1,索有瑞 1*,李天才 1,赵海福 2,董晓宁 3,王廷璞 3
(1.中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁 810001;2.甘肃农业大学 动物医学院,甘肃 兰州 730070;
3.天水师范学院 生命科学与化学学院,甘肃 天水 740001)
摘 要:以苦荞皮为研究对象,在单因素实验基础上,采用 Box-Behnken 响应面实验设计法,对苦荞皮中
总黄酮提取工艺条件进行了研究,并对提取物进行高效液相色谱法检测。结果表明,影响苦荞皮中总黄酮含量的
因素大小顺序为:乙醇浓度、液料比、回流时间、超声时间,响应面最佳提取工艺:乙醇浓度 65%、液料比 14 mL/g、
回流时间 1.6 h、超声时间 28 min,苦荞皮中总黄酮最高含量为 14.9520mg/g,高效液相色谱法检测检测重现性良
好。表明该工艺对苦荞皮中总黄酮的提取效果显著,为为苦荞资源的进一步开发利用提供了实验依据。
关键词:苦荞皮;总黄酮;响应面法;高效液相色谱法
The Optimization by Response Surface Method for Total Flavonoids
Ultrasonic Extraction Technology from Buckwheat Skin
ZHAO Qiang1, SUO You-rui1*, LI Tian-cai1, ZHAO Hai-fu2, DONG Xiao-ning3,WANG Ting-pu3
(1. Northwest Plateau Institute of Biology, The Chinese Academy of Sciences, Xining Qinghai 810001, China;
2.College of Vetetinary Medicine at Gansu Agricalture Univesity, Lanzhou Gansu,730070, China;
3.College of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui Gansu, 741001, China)
Abstract:With buckwheat skin as the research object, on the basis of single factor level determination of screening,
designed with the Box-Behnken in the response surface analysis software,for extracting flavonoids from the buckwheat
skin process conditions were studied,and detect the extracts with HPLC detection.The results showed that the factors
affecting the flavonoids content from buckwheat skin is:ethanol concentration, liquid ratio, reflux time, ultrasonic time.
the best extraction technology of the response surface are: ethanol concentration is 65%, liquid ratio is 14 mL/g, reflux
time is 1.6 h, ultrasonic time is 28 min. Under the condition of the technology, the highest total content of flavonoids in
buckwheat skin is 14.9520 mg/g, HPLC detection good repeatability. Show that the process of extraction of total
flavonoids in buckwheat skin effect is remarkable, have provided the certain experimental basis for deep research of
buckwheat resources .
Key words:buckwheat skin; total flavonoids; response surface method; high performance liquid chromatography
苦荞,又称鞑靼荞麦,是一种适合于在冷凉气候下生长的短季蓼科荞麦属双子
叶药食兼用植物,在我国主要分布于甘肃、四川、云南、贵州等地。苦荞的性味甘
苦、平、寒、有益气力,有利耳目,降气宽肠健胃的作用[1-3]。现代医学表明,苦荞
中富含蛋白质、维生素、矿物元素等,具有抗氧化、降三高、抗肿瘤等多种药理活
性,其含有极为丰富的生物活性成分—黄酮类化合物,总黄酮含量为普通荞麦的 10~

基金项目:2013 年甘肃省自然科学基金项目(2060203314)。
作者介绍:赵强(1982,11-),男,甘肃天水人,博士,副教授,中国科学院西北高原生物研究所博士后,研究
方向:天然药物化学与高原生态学研究。
*通讯作者:索有瑞(1960,07-),男,青海大通人,中国科学院西北高原生物研究所研究员,博导。研究方向:
天然药物化学。
2014-01-03
1
网络出版时间:2014-01-06 16:52
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20140106.1652.049.html
100 倍[3-5]。黄酮类化合物(Flavonoids)主要是指结构为 2-苯基色原酮的一类天然
有机化合物,在植物体内通常与糖结合成苷类,小部分以游离态(苷元)的形式存
在。近年来,有研究表明食用富含黄酮类的食物还可以降低癌症的发病率,增强人
体免疫力,对糖尿病、高血压、冠心病、中风等疾病有辅助疗效[6]。我国苦荞常年播
种面积约 30 万公顷,总产量约 30 万吨,资源丰富。苦荞皮作为苦荞制粉过程中的
副产物,产率约为 224g/kg,亦富含黄酮类化合物,可作为一种廉价而丰富的总黄酮
提取材料,具有较好的市场前景[7、8]。
目前,提取总黄酮的方法有恒温水浴振荡提取、有机溶剂浸提、碱性水或碱性
稀醇提取以及酶法提取等,但这些方法提取时间较长,提取率较低[9]。而超声波辅助
提取则是利用超声波在液体中的空化作用,加速植物有效成分迅速进入溶剂,从而
提高提取效率,缩短提取时间 [10,11]。本实验以苦荞皮为原料,采用统计软件
Design-Expert 中响应面法的 Box-Behnken 模式,对苦荞皮中总黄酮的超声波辅助提
取工艺进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药材
苦荞皮(采集于甘肃省天水市农业高新科技园区规范化种植的苦荞),自然风干。
1.1.2 试剂
芦丁标准品(批号:F20051222,国药集团);95%乙醇、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2
等,均为分析纯试剂。
1.1.3 仪器
RE52-99 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、KQ-500DE 型数控超声波清洗
器(昆山市超声仪器有限公司产品)、UV751GD 型紫外-可见分光光度计(上海精密
科学仪器有限公司)、Aglent 1100 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)、FA22048
型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、索氏提取器等。
1.2 方法
1.2.1 芦丁标准工作曲线的绘制
准确称取 0.2008g 芦丁标准品,用三重水溶解,移入 100mL 容量瓶中定容、摇
匀。再次稀释,得到浓度为 1.34mg/L 芦丁标准溶液。分别移取芦丁标准溶液 0.50、
1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 和 5.00mL,置于 50 mL 容量瓶中,
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分别加入 10.00mL 蒸馏水、3.00mL 5% NaNO2 溶液,6min 后加入 6.00 mL 1%Al(NO3)3
溶液,6min 后加入 20.00mL 4%NaOH 溶液,15min 后定容、摇匀、静置。以三重水
做空白对照,在 510nm 处,测其吸光度值。以浓度 c(mg/mL)为横坐标,吸光值 A
为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。
1.2.2 苦荞皮中总黄酮的制备
准确称取 6.00g 干燥的苦荞皮,按设计的时间浸泡,在不同的温度与功率下超声
振荡处理;采用索氏回流法提取苦荞皮中的总黄酮,将提取液转入旋转蒸发仪,减
压浓缩至无醇味,转入 100 mL 锥形瓶,加入少许活性炭脱色,静置过夜,抽滤,将
滤液按编号装入容量瓶,并定容至 50 mL,静置待测定[12]。
1.2.3 苦荞皮中总黄酮含量的测定
以芦丁为标准品,用亚硝酸钠-硝酸铝显色法处理后,在 510nm 处测其吸光度值,
计算苦荞皮中总黄酮的含量[12-15]。即将待测液 2.00mL 于 50mL 容量瓶内,分别加入
10.00mL 蒸馏水、3.00mL 5% NaNO2 溶液,6min 后加入 6.00 mL 1%Al(NO3)3 溶液,
6min 后加入 20.00mL 4%NaOH 溶液,15min 后定容、摇匀。以三重水做空白对照,
在 510nm 处,测其吸光度值 A。对照芦丁标准曲线,得出提取液中总黄酮浓度,最
后计算出苦荞皮提取液中总黄酮含量,其计算公式为:
总黄酮含量%= 100
m
NVc
式中:c:苦荞中总黄酮含量(mg/mL);V:待测液的体积(mL);N:稀释倍数;m:苦
荞皮的质量(g)。
1.2.4 苦荞皮中总黄酮的提取工艺
选取乙醇浓度、液料比、超声时间、回流时间、浸泡时间、超声温度、超声功
率、浸提液 pH 值 8 个因素依次进行单因素轮换提取实验[10,15]。各因素的水平梯度
设置分别为:乙醇浓度 35、50、65、80、95%,液料比 5、10、15、20、25mL/g,
超声时间 15、30、45、60、70min,回流时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h,浸泡时间 6、
12、18、24、30h,超声温度 35、40、45、50、55℃,超声功率 200、250、300、350、
400W,浸提液 pH 值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。根据单因素水平实验结果,采用极差
分析法筛选出 4 个主要影响因素。然后按照响应面法实验设计进行苦荞皮中总黄酮
提取工艺优化,最后建立苦荞皮中总黄酮提取工艺。
1.2.5 HPLC 检测
以芦丁为标准品,将最佳工艺下提取的苦荞皮中的总黄酮进行高效液相色谱法
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测定,并且进行回收率的测定。
1.2.5.1 色谱条件
色谱柱:Zorbax eclipse XDB C18 柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相:甲醇-0.2%
磷酸溶液(65:35);流速:1.0mL/min;检测波长:254 nm;柱箱温度 30(±1)℃;
进样量:20μL。
1.2.5.2 HPLC 测定的工作曲线的绘制
准确配制浓度为 0.0250mg/mL 的芦丁标准液,静置备用。将其依次配成浓度为
0.1875,0.3750,0.7500,1.5000,3.0000μg/mL 的梯度溶液,进行 HPLC 检测。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线
根据系列浓度梯度的芦丁标准品在 510nm 处测得的吸光值,以浓度 c(mg/mL)
为横坐标,吸光值 A 为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=7.1214X+0.0291,
R2=0.9998(n=8);在 0.01~0.15mg/mL 范围内呈良好的线性关系。
2.2 单因素筛选实验结果
将单因素的实验结果绘制成表格(表 1)。以芦丁含量为指标,选出每个因素的
最优水平,即对应的芦丁含量也最高。
表.1 单因素实验结果
Table. 1 The result of single factor experiment
因素
Factors
水平
Level
总黄酮含量/ mg/g
Total flavonoids content
显著水平
significance levels
因素
Factors
水平
Level
总黄酮含量/ mg/g
Total flavonoids content
显著水平
significance levels
乙醇浓度/ %
Ethanol
concentration
35 2.3220
浸泡时间/ h
Macerating
time
6 1.6140
50 2.1410 12 1.5890
65 2.4150 * 18 1.7150
80 2.2750 24 1.6890
95 2.1130 30 1.8720 *
液料比/ mL/g
Liquid to
solid ratio
5 2.1320
超声温度/ ℃
Ultrasonic
temperature
35 1.4030
10 2.2130 40 1.4190
15 2.3960 * 45 1.4820
20 1.9670 50 1.5030 *
25 1.9620 55 1.4760
超声时间/ min
Ultrasonic
Time
15 2.1590
超声功率/ W
Ultrasonic
Power
200 1.3760
30 2.3820 * 250 1.4090
45 2.0360 300 1.4660 *
60 2.0520 350 1.4150
75 1.5690 400 1.3190
回流时间/ h
Reflux
0.5 1.9340
pH 值
4.0 1.2240
1.0 2.3110 5.0 1.2670
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Time 1.5 2.8740 * 6.0 1.3090
2.0 2.7130 7.0 1.3230
2.5 2.1020 8.0 1.3410 *
注:*表示最优水平。
Note: * indicates the optimum levels.
由表 1 可知,所选 8 个单因素的最佳值分别是:乙醇浓度 65%、液料比 15mL/g、
超声时间 300min、回流时间 1.5h、浸泡时间 30h、超声温度 50℃、超声功率 300W、
浸提液 pH 值为 8.0。
2.3 苦荞皮中总黄酮的响应面法提取工艺设计
2.3.1 响应面实验因素水平的选择
采用极差分析对 8 组单因素水平进行筛选,最终选用乙醇浓度、回流时间、超
声时间、液料比 4 个因素为主要考察因素,进行响应面实验,按响应面实验设计进
行总黄酮提取,设计的因素水平见表 2 所示。
表.2 响应面实验因素水平
Tab.2 The response surface of level of factor
水平
Level
A 乙醇浓度/ % B 回流时间/ h C 超声时间/ min D 液料比/ mL/g
Ethanol concentration Reflux time Ultrasonic time Liquid to solid ratio
-1 50 1.0 15 15
0 65 1.5 30 20
1 80 2.0 45 25

2.3.2 响应面实验方案设计及结果
采用 Design-Expert 7.0 分析软件,利用 Box-Behnken 中心设计原理[16-17],以芦
丁的含量为响应值,,以 A(乙醇浓度)、B(回流时间)、C(超声时间)、D(液料
比)4 个因素为自变量,进行响应面实验。设计 4 因素 3 水平(共 29 个实验点,5
个中心点)的响应面实验,其设计及结果见表 3 所示。
表.3 响应面实验设计与结果
Tab.3 Designs and results for extraction of response surface experiments
序号
No
A 乙醇浓度/ %
Ethanol concentration
B 回流时间/ h
Reflux time
C 超声时间/ min
Ultrasonic Time
D 液料比/ mL/g
Liquid to solid ratio
Y 总黄酮含量/ mg/g
Total flavonoids content
1 65 1.5 45 10 10.8510
2 80 1.5 45 15 11.9910
3 50 1.5 30 10 12.1820
4 50 2.0 30 15 11.1720
5 80 1.5 15 15 11.6840
6 80 2.0 30 15 12.2110
7 50 1.5 45 15 13.0590
8 80 1.0 30 15 9.7390
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9 50 1.0 30 15 11.8310
10 65 2.0 30 20 11.6260
11 65 1.5 30 15 14.0250
12 65 1.0 15 15 11.3620
13 65 1.5 15 20 12.6790
14 65 2.0 15 15 11.1140
15 50 1.5 15 15 12.8840
16 65 1.5 30 15 14.6390
17 65 1.5 30 15 14.9020
18 65 2.0 30 10 13.3520
19 65 1.5 30 15 15.1090
20 65 1.5 30 15 14.9170
21 65 1.5 15 10 12.6200
22 80 1.5 30 20 8.9490
23 65 2.0 45 15 9.6620
24 65 1.0 45 15 12.7810
25 80 1.5 30 10 11.3480
26 50 1.5 30 20 9.5490
27 65 1.5 45 20 12.3420
28 65 1.0 30 20 13.9810
29 65 1.0 30 10 12.2290
注:表中数据为 3 次重复实验的平均值。
Note: The data in table is the mean of three repeated experiments.
表 3 中共有 29 组实验,其中 1~24 组是析因实验,25~29 组是中心实验。29
个实验点分别为析因点和零点;中心实验进行 3 次,中心实验用以估计实验的误差,
其中析因点为 A、B、C 和 D 所构成的三维空间的顶点,零点为区域的中心点。
2.4 不同因素对苦荞皮中总黄酮含量的影响
采用 SAS RSREG 程序对所得数据进行响应面分析,得到 4 个因子与苦荞皮中总
黄酮含量之间的模拟回归方程为:
Y= -48.1009+ 0.9570A + 18.1592B+ 0.3725C+ 1.9049D+ 0.1044AB+ 0.0001AC+
0.0008AD -0.0957BC -0.3478BD+0.0048CD-0.0089A2-5.7731B2-0.0053C2-0.0545D2
对该回归模型进行差异显著性检验及方差分析,其结果见表 4 所示。
表.4 响应面实验方差分析
Tab.4 The variance analysis of response surface
方差来源
Source
平方和
Sum of squares
自由度
Degree of freedom
均方
Mean Square
F 值
F-value
P 值
p-value
差异显著性
Significant
A-乙醇浓度 1.8842 1 1.8842 7.1376 0.0142 *
B-回流时间 0.6468 1 0.6468 8.3905 0.0321 *
C-超声时间 0.2288 1 0.2288 0.1381 0.7157
D-液料比 0.9953 1 0.9953 6.6009 0.0411 *
AB 2.4508 1 2.4508 7.4797 0.0439 *
AC 0.0044 1 0.0044 0.0026 0.9598
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6

AD 0.0137 1 0.0137 6.0083 0.0489 *
BC 2.0607 1 2.0607 1.2441 0.2835
BD 3.0241 1 3.0241 6.8258 0.0481 *
CD 0.5127 1 0.5127 0.3095 0.5868
A2 25.9695 1 25.9695 15.6790 0.0014 **
B2 13.5118 1 13.5118 8.1577 0.0127 *
C2 9.2964 1 9.2964 5.6126 0.0327 *
D2 12.0377 1 12.0377 7.8677 0.0094 **
模型-Model 52.0263 14 3.7162 2.2436 0.0413 *
回归值-Residual 23.1885 14 1.6563
失拟项-Lack of fit 22.4757 10 2.2476 12.6122 0.0131
残差-Pure error 0.7128 4 0.1782
总残差-Cor total 75.2148 28
注:*表示 P<0.05,**表示 P<0.01。
Note: * and **indicated significance at 0.05 and 0.01 levels, respectively.
由表 4 中方差分析结果可知模型(Model) P=0.0413(<0.05),表明回归模型
达到显著水平,即各因素自身交互作用影响显著。但是误差项不显著,其决定系数
r2=0.8534,说明该模型与实际情况接近,即实验误差小,能充分反映出各因素与响
应值之间的关系,因此,可以用该方程对实验结果进行分析。
由于各种因素之间存在着一定的交互作用,A、B、D 和 AB、AD、BD 呈显著
影响(P<0.05);而 C、AC、BC、CD 均呈不显著交互作用。从模型中回归方程系
数显著性检验可知:二次项 A2(P=0.0014),D2(P=0.0094),即 A2、D2 为极显
著影响(P<0.01)达到了极显著水平;B2(P=0.0127),C2(P=0.0327),P 值
均<0.05,达到显著水平。
2.5 苦荞皮中总黄酮提取的响应面图分析
根据响应方程绘制的响应面曲面图和等高线图,响应面图形能直观地反映各因
素和它们之间的交互作用对响应值的影响。响应面图形是响应值 Y 与实验因素 A、B、
C、D 相对应构成的三维空间曲线图,具体做法是将 2 个因素固定在零水平,然后将
剩下的 2 个因素交互作用绘制成响应面曲线图,其详细实验结果见图 1。

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图.1 各因素交互作用的等高线图和响应面图
Fig.1 The contour map and response surface graph between the various factors interaction effect
从各因素之间两两相互作用的响应面图形观察,各因素间有较为强的交互作用,
发现其中曲线走势越陡,其影响越显著;曲线走势越平滑,其影响越小。乙醇浓度
与回流时间、超声时间、液料比交互作用较为复杂,随着各因素的水平值增加,总
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黄酮含量会出现一个峰值;当再次持续升高各水平值时,总黄酮含量又会随之下降,
其坡度相对平缓,说明提取量可以忍受处理条件的变异,但是不经济,因此仍选取
最高点的提取条件为最佳;回流时间与超声时间和液料比的交互作用,超声时间和
液料比的交互作用同样较为复杂,但在随着各因素的水平值的变化,总黄酮含量同
样会出现一个峰值。每个因素及其之间的交互作用对总黄酮含量的影响也存在差异,
乙醇浓度、回流时间、液料比、乙醇浓度和回流时间、乙醇浓度和液料比、回流时
间和液料比对总黄酮含量的影响呈显著影响(P<0.05);而其余的均呈不显著交互作
用。
本实验中各因素显著程度依次为乙醇浓度(P=0.0142)>回流时间(P=0.0321)
>液料比(P=0.0411)>超声时间(P=0.7157)。使用 Design-Expert 软件分析优化
得到苦荞皮中总黄酮最佳模拟提取工艺为:乙醇浓度 64.72%、液料比 14.18mL/g、
回流时间 1.59h、超声时间 28.12min,在此工艺条件下,苦荞皮中总黄酮含量为
14.9700mg/g。考虑到实际操作过程中的局限性,对影响苦荞皮中总黄酮含量的的因
素加以修正,修正后的工艺条件为:乙醇浓度 65%、液料比 14mL/g、回流时间 1.6h、
超声时间 28min,在该工艺条件下,苦荞皮中总黄酮含量为 14.9270mg/g。在该工艺
条件下进行 3 次平行实验,结果分别为 14.9430、14.9850、14.9290mg/g,取其平均
值为 14.9520mg/g,与理论值误差为 0.0180%,说明响应面法优化模型能较好的预测
苦荞皮中总黄酮含量,所得工艺条件比较可靠。
2.5 HPLC 检测结果
在实验设定的色谱条件下,将芦丁标准品和在优化条件下提取的苦荞皮中总黄
酮进行 HPLC 检测,其结果见图 2 所示。

图.2 HPLC 检测结果
Fig.2 Result of HPLC
由图 2 可知,将芦丁标准系列得到的标准曲线为色谱峰面积 Y,对进样浓度进
行线性回归分析可得:Y=70.2990X-8.7099,R2=0.9997,0.375~25μg/mL;芦丁标准
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品保留时间 tR=9.625min,范围为 9.310~11.032min。优化条件下提取的苦荞皮中总黄
酮在 9.457min 时出峰,峰形对称,与标样接近。平均回收率为 99.58%、RSD 为 2.40%,
表明 HPLC 检测精密度良好、重现性较好。
3 结 论
我国富产苦荞,但其利于目前仍局限于苦荞粉、苦荞挂面、苦荞茶等食品加工,
苦荞皮主要作为枕心充填物和肥料使用,在对其总黄酮提取利用方面的研究还比较
欠缺,尤其是对苦荞皮中总黄酮的响应面法提取工艺研究不多,通过本实验的数据
分析,可以寻找到一种最有效的提取工艺,为苦荞皮资源的开发和研究奠定了实验
基础[18]。
在影响苦荞皮总黄酮提取工艺的各实验步骤中,采用乙醇一索氏抽提影响效果
最为显著。在总黄酮提取剂中,从操作难易程度和成本角度考虑,虽然甲醇极性
比乙醇大,沸点比乙醇低,但因甲醇有毒且不经济,丙酮挥发性较乙醇大,故选
用乙醇作为总黄酮提取剂,其提取效果理想且相对安全。采用超声波振荡辅助
索氏回流提取法,可使得植物细胞壁及整个植物体在瞬间被破碎,有效的加快了总
黄酮溶解度,缩短了提取时间,提高了总黄酮得率,且操作简单易行。通过响应面
法优化苦荞皮中总黄酮最佳提取工艺参数为:乙醇浓度 65%、液料比 14mL/g、回流
时间 1.6h、超声时间 28min,通过 HPLC 检测进一步验证了响应面法提取工艺的可靠
性,并对提取物含量做了进一步准确测定,在该工艺条件下,苦荞皮总黄酮含量为
14.9520mg/g。通过本研究,我国为苦荞资源今后的开发和利用提供了理论指导。

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