全 文 ：分子植物育种，2013年，第 11卷，第 5期，第 600-604页
Molecular Plant Breeding, 2013, Vol.11, No.5, 600-604
研究报告
Research Report
东方百合‘Sorbonne’原生质体培养初步研究
秦晓杰 1* 段华金 1* 朱永平 2 王小巧 1 李琼洁 1 赵兴富 1 和凤美 1**
1云南农业大学园林园艺学院,昆明, 650201; 2云南农业大学农学与生物技术学院,昆明, 650201
*同等贡献作者
**通讯作者, hefengmei918@126.com
摘 要 百合原生质体培养对百合远源杂交育种具有重要意义。本研究以东方百合‘Sorbonne’花托为外植
体，诱导胚性愈伤组织，并对其原生质体提取和培养进行初步研究。结果表明：MS+Picloram 3 mg/L为胚性愈
伤组织诱导最佳培养基；胚性愈伤组织在酶解液为 2%纤维素酶 R-10+0.5%离析酶 R-10+0.05%果胶酶
Y23+147 mg/L二水合氯化钙+976 mg/L 2-吗啉乙磺酸+0.6 mol/L甘露醇，酶解 12 h，制备的原生质体产量
最高达 4×105个 /mL，活性达 52%；在胚性愈伤组织诱导培养基中进行原生质体的悬滴培养、液体培养、固体
培养、固液结合培养和看护培养。结果表明，看护培养是最佳培养方法，并在改良MS+Picloram 2 mg/L的培
养基中培养 2~3 d观察到长细胞壁的原生质体，培养 4~6 d，可见原生质体的第一次分裂，培养 40~45 d，观
察到原生质体分化成的细胞团。
关键词 Sorbonne,原生质体,再生细胞,分裂
Preliminary Study on Protoplast Culture of Lilium oriental Hybrids‘Sor-
bonne’
Qin Xiaojie 1* Duan Huajin 1* Zhu Yongping 2 Wang Xiaoqiao 1 Li Qiongjie 1 Zhao Xinfu 1 He Fengmei 1**
1 College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 2 College of Agriculture and Biotechnology, Yunnan
Agricultural University, Kunming, 650201
* These authors contributed equally to this paper
** Corresponding author, hefengmei918@126.com
DOI: 10.3969/mpb.011.000600
Abstract It is significant to culture the protoplast for wide cross breeding of Lily. In this study, the embryonic
callus of receptacle of lilium oriental hybrids‘Sorbonne’were induced and protoplasts were isolated and cultiv-
ated. The results showed that feasible culture medium of inductive embryonic callus was MS+Picloram 3 mg/L;
The optimal enzyme solution used for protoplasts isolation with 12 hours enzymolysis was 2% Cellulase R-10+
0.5% Macerozyme R-10+0.05% Pectolyase Y23+147 mg/L CaCl2·2H2O+976 mg/L MES+6 mol/L Sorbitol, and
yield reached its highest, which was up to 4×105 /mL, and the activity was up to 52%. Comparing with the hanging
drop culture, liquid culture, solid culture, liquid and solid culture, the nurse culture was the best way to cultivate
protoplast in feasible culture medium of inductive embryonic callus. Some changes can be observed in the process
of protoplast culture with improved medium that is MS+Picloram 2 mg/L by the nurse culture, such as cell wall for
2~3 days, the first division of protoplast for 4~6 days, cell mass for 40~45 days.
Keywords Sorbonne, Protoplast, Regenerative cells, Cell division
收稿日期：2013-01-22 接受日期：2013-04-05 网络出版日期：2013-05-27
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1349-mpbopa
基金项目：本研究由云南省教育厅研究生项目(2011J093)、云南省教育厅项目(2011J093)和学生创新基金项目(NKZX2011CX023)
共同资助
‘Sorbonne’(Lilium oriental‘Sorbonne’)是东方
百合的一个主栽品种，为百合科百合属多年生球根
花卉，是重要的观赏花卉，然而其种球依靠进口，生
产成本高，病虫害严重，耐阴性差，花朵数少(蔡宣梅
等, 2006)。随着人们生活水平的提高，百合花卉市场
的需求不断增长，并逐渐多样化，人们迫切需要更多
更好的百合新品种来代替原有品种，因此，百合的遗
传改良是百合花卉产业发展的重要内容(赵祥云等,
2000,中国农业出版社, pp.1-80)。
云南野生大百合为百合科大百合属球根花卉，
其抗性强，花型和株型好，花朵数多，花色单一(关文
灵等, 2003,北方园艺, (4): 33)。东方百合‘Sorbonne’
与云南野生大百合的杂交品种培育，不仅可以综合
它们间的优缺点，而且可培育出具有中国特色的，有
自主知识产权百合新品种。东方百合与云南大百合
杂交为属间远源杂交，导致杂交不亲和或杂种不育，
给杂交育种新品种培育带来极大障碍，然而，植物原
生质体融合技术可以克服远源杂交障碍，同时，植物
原生质体分离、培养及植株再生技术是进行植物育
种、基因工程、遗传理论及细胞生理生化特性研究的
平台，具有重要的研究意义(张颖等, 2010)。
本研究以‘Sorbonne’花托诱导的愈伤组织为材
料，制备原生质体、对其活性及再生细胞分裂进行研
究，为下一步远源杂交新品种的培育奠定基础。
1结果与分析
1.1胚性愈伤组织的诱导
以花托为外植体，培养基为 MS+0.2 mg/L 6-
BA+1.0 mg/L NAA，成功诱导出丛生芽，增殖培养基
为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，成功诱导出
叶片和小鳞茎。以叶柄和小鳞片为外植体，优化激
素6-BA和 Picloram的配方，诱导胚性愈伤组织。从
表 1 可见，以鳞片为外植体，所有处理均未获得愈
伤组织；以叶柄为外植体，接种 7 d后，处理 1、2和 3
叶柄没有膨大，而处理 4、5、6、7、8和 9叶柄基部膨
大；接种 30 d后，处理 1、2和 3叶柄长出愈伤组织
(图 1A)，处理 4、5、6、7、8和 9叶柄基部继续膨大，但
不具备愈伤组织的特征。接种 50 d后，处理 1、2和 3
叶柄均诱导出愈伤组织(图 1A)，并拥有大量丛生芽
(图 1B)；处理 2愈伤组织中含有少量丛生芽；处理 3
的愈伤组织呈黄白色，紧实，易碎、活性强，符合胚性
愈伤组织的特点(王杰等, 2008)并且无丛生芽产生
(图 1C)。处理 4、5和 6的叶柄外植体均长为丛生芽，
无愈伤组织，处理 7、8和 9的叶柄分化差。因此，为
获得高质量胚性愈伤组织，MS+Picloram 3 mg/L 为
最优培养基。
1.2 裂解酶的裂解时间对胚性愈伤组织原生质体分
离的影响
由表 2可见，‘Sorbonne’胚性愈伤组织在裂解酶
(孙晓梅等, 2007)作用下，黑暗中酶解 4 h，原生质体
产量为 0；酶解 12 h时，原生质体产量达到最大，为
4×105个 /mL，活性达 52%；在酶解时间为 14 h时，原
生质体产量降低，活性增强。在酶解时间为 16 h，原
生质体产量和活性都降低。因此，在产量和活性都兼
顾的情况下，最好的酶解时间为 12 h。
1.3胚性愈伤组织原生质体培养
以诱导胚性愈伤组织的培养基 MS*+Picloram
3 mg/L为原生质体培养的培养基，分别利用悬滴培
养、液体培养、固体培养、固液结合培养和看护培养 5
表 1不同激素组配对诱导胚性愈伤组织的影响
Table 1 Effects of different hormone combination on induction of embryonic callus
处理
Treatment
1
2
3
4
5
6
7
8
9
毒莠定(mg/L)
Picloram (mg/L)
1
2
3
1
2
3
1
2
3
6-苄基嘌呤(mg/L)
6-BA (mg/L)
0
0
0
2
2
2
5
5
5
愈伤组织诱导率+芽诱导率(%)
Rate of callus and bud induction (%)
幼嫩叶柄
Young petiole
40+60
60+30
100+0
20+90
10+90
10+90
0+30
0+10
0+10
小鳞片
Small scale
0+0
0+0
0+0
0+0
0+0
0+0
0+0
0+0
0+0
东方百合‘Sorbonne’原生质体培养初步研究
Preliminary Study on Protoplast Culture of Lilium oriental Hybrids‘Sorbonne’
601
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1‘Sorbonne’愈伤组织与原生质体
注: A:叶柄诱导的愈伤组织; B:愈伤组织与芽混生; C:胚性愈
伤组织; D: FDA染色鉴定原生质体活性(发荧光的为活力旺
盛的原生质体); E:原生质体显微图; F:原生质体再生细胞壁;
G:第一次分裂的细胞; H:再生细胞团
Figure 1 The callus and protoplasts of‘Sorbonne’
Note: A: Callus induction from petiole; B: Callus with shoot tip;
C: Embryonic callus; D: FDA identification of protoplast vitality
(fluorescigenic cell means protoplast with hearty vitality); E: Pro-
toplast micrograph; F: Protoplast regenerating cell wall; G: The
first division of cells; H: Regenerative cell mass
种方法，进行原生质体培养，筛选最佳培养基；结果
表明，在悬滴培养、液体培养、固体培养、固液结合培
养 4种方法中均未在显微镜下观察到原生质体的分
裂，但在看护培养中观察到长细胞壁的原生质体；以
看护培养为原生质体的培养方法，在不同培养基中
进行培养，筛选最佳培养基配方。从表 3可见，在
MS*+Picloram 2 mg/L的培养基中培养 2~3 d时，可
在显微镜下观察到长细胞壁的原生质体(图 1F)，培养
4~6 d，可见原生质体的第一次分裂(图 1G)，培养 40~
45 d，观察到原生质体分化成的细胞团(图 1H)。其它
培养基培养后均未见到原生质体形成的细胞团。
2讨论
原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重
要环节。目前，游离植物原生质体的常规方法是酶解
法，用酶解法游离原生质体时，选择适宜材料是分离
培养原生质体成功与否的关键因素。大多数植物从
愈伤组织中分离得到的原生质体产量和活性远远高
于从其它组织器官中获得的原生质体，而且分离的
原生质体较易培养(王娟等, 2010;王杰等, 2008; Pro-
fumo et al., 1987)。因此，本研究建立了‘Sorbonne’愈
伤组织培养的再生系统，并以愈伤组织为材料成功
分离了东方百合‘Sorbonne’的原生质体。其次，要选
择合适的水解酶种类、组合及浓度。此外，还必须控
制好酶解条件，影响酶解过程的主要因素有温度、pH
值、渗透压、离子浓度和振荡及预处理等，孙晓梅等
(2007)获得了‘Sorbonne’原生质体，但对原生质体的
活性没有报导，而且所采用的培养基和液体浅层培
养法培养原生质体未得到好的效果。经过实验研究，
本研究在孙晓梅等(2007)的酶的组合及浓度的基础
上，认为分离原生质体时酶的裂解时间为 12 h，对原
生质体的产量和活性最好，与孙晓梅研究结果不一
致。另外，本研究在胚性愈伤组织诱导时发现选用
picloram代替 2,4-D做为外源激素，可以很容易获得
高质量胚性愈伤组织，而且水渍化减少，利于原生质
体的分离。
原生质体培养再生植株是细胞融合、体细胞杂
交的基础，受到很多因素的影响(Pan et al., 2003;
2006)。原生质体的植株再生途径通常有 3条：①经
细胞团发育形成愈伤组织, 再分化成芽长成植株；②
直接形成胚状体，再发育成植株；③先形成愈伤组
织，再由愈伤组织分化形成胚状体，最后发育成植
株。而且，分化和再生所需培养基的营养成分一般与
同种植物正常离体组织培养的要求相似(李杰等 ,
2003)，因此，百合‘Sorbonne’原生质体培养时本研究
表 2裂解酶的裂解时间对提取原生质体的产量和活性的影响
Table 2 Effect of enzymolysis time on yield and activity of protoplasts
酶液配方
Mixed enzyme formula
2%纤维素酶 R-10+0.5%离析酶 R-10+0.05%果胶酶 Y23+147 mg/L二水合氯
化钙+976 mg/L 2-吗啉乙磺酸+0.6 mol/L甘露醇
2% Cellulase R-10+0.5% Macerozyme R-10+0.05% Pectolyase Y23+147 mg/L
CaCl2·2H2O+976 mg/L MES+solution of 6 mol/L Sorbitol
时间处理(h)
Treating time (h)
4
12
14
16
活性(%)
Activity (%)
0
52
56
40
产量(个 /mL)
Yield (/mL)
0
4.0×105
3.5×105
1.5×105
602
东方百合‘Sorbonne’原生质体培养初步研究
Preliminary Study on Protoplast Culture of Lilium oriental Hybrids‘Sorbonne’
采用诱导胚性愈伤组织的培养基，经过悬滴培养、液
体培养、固体培养、固液结合培养和看护培养 5种培
养方法的筛选，最后发现看护培养效果较好，再在看
护培养的基础上，调整培养基的配方和培养条件，获
得原生质体再生细胞团，但最终还是没能分化为愈
伤组织。植物分化和植株再生能力受供体植物的染
色体组型和基因型影响，甚至同一品种的不同个体
之间也表现出这样的差异(Horita et al., 2002)。为获
得百合‘Sorbonne’原生质体再生植物，培养基配方和
培养条件等因素还需进一步探索。
3材料与方法
3.1材料
以荷兰进口的东方百合品种‘Sorbonne’花托为
外植体，诱导丛生芽和小鳞片，再诱导胚性愈伤组织。
3.2方法
3.2.1胚性愈伤组织的诱导
首先，外植体用自来水冲洗 3次，然后用 75%的
酒精浸泡 30 s，再用 0.1%的升汞消毒 5 min，无菌水
冲洗 3~4次，将消毒后的花托接种在 MS+0.2 mg/L
6-BA+1.0 mg/L NAA培养基上，诱导丛生芽；增殖培
养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，诱导叶
片和小鳞茎(刘雅莉等, 2004)。再以诱导出的丛生芽
的细嫩叶柄和小鳞片为外植体，在 MS为基本培养
基，附加不同浓度的 6-BA、NAA和 picloram (mg/L)，
3%蔗糖，0.7%琼脂，pH为 5.8的诱导培养基上进行
胚性愈伤组织诱导，培养条件为温度 25℃，暗培养。
3.2.2原生质体的提取和活性鉴定
挑选上述继代后生长状态良好的愈伤组织 1 g，
置 10 mL酶液(孙晓梅等, 2007)中暗中酶解不同时
间，用 200目尼龙网过滤混合液，离心 5 min，依次加
入 21%的蔗糖和 10%的甘露醇溶液，在 1 000 rpm离
心 5 min，用吸管吸出原生质体。用血球计数器计算
产量，荧光素双醋酸酯(FDA)染色法鉴定活性。
3.2.3原生质体的培养
采用悬滴培养、液体培养、固体培养、固液双
层培养和看护培养 5 种培养方法，在胚性愈伤组
表 3看护培养不同激素对原生质体培养的影响
Table 3 Effect of the nurse cultures different culture medium on protoplast culture
处理
Treatment
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
基本培养基
Medium
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
MS*
毒莠定(mg/L)
Picloram (mg/L)
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
6-苄基嘌(mg/L)
6-BA (mg/L)
0
0
0.5
0.5
1.0
1.0
1.5
1.5
2.0
2.0
观察结果
Observed results
已在显微镜下观察到原生质体再生的细胞团
Protoplast division, and regenerated cell mass
只观察到原生质体的分裂,未见再生细胞团
Protoplast division, but no regenerated cell mass
只观察到原生质体的分裂,未见再生细胞团
Protoplast division, but no regenerated cell mass
只观察到原生质体的分裂,未见再生细胞团
No protoplast division
未见原生质体分裂
No protoplast division
未见原生质体分裂
No protoplast division
未见原生质体分裂
No protoplast division
未见原生质体分裂
No protoplast division
只观察到原生质体的分裂，未见再生细胞团
Protoplast division, but no regenerated cell mass
未见原生质体分裂
No protoplast division
注: MS*: MS中 NH4NO3的量降为原来的 1/8
Note: MS*: The amount of NH4NO3 in MS reduced to 1/8
603
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
织诱导培养基上进行原生质体培养，筛选最优培
养方法；在最优培养方法中，以 MS+不同浓度 Pic-
loram和 6-BA (mg/L)的培养基上培养原生质体，筛
选最优培养基，并在显微镜下观察原生质体的再生
情况，照像。
作者贡献
秦晓杰、段金华和和凤美是本研究的实验设计
和实验研究的执行人；秦晓杰和段华金是项目的构
思者；朱永平完成数据分析；王小巧、李琼洁和赵兴
富参与实验设计，试验结果分析；和凤美是项目的负
责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由云南省教育厅研究生项目(2011J093)、
云南省教育厅项目(2011J093)和学生创新基金项目
(NKZX2011CX023)共同资助。感谢云南农业大学国
家级实验教学示范中心和农科专业基础实验教学示
范中心提供资金支持。
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