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响应面法优化水黄芹总黄酮提取工艺
及其抗氧化研究
甘秀海1，梁志远1，代 雄1，赵 超2，周 欣2，*
(1.贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018;
2.贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳 550001)
收稿日期:2014－10－28
作者简介:甘秀海(1976－) ，男，硕士，副教授，从事天然药物化学研究。
* 通讯作者:周欣(1962－) ，女，博士，教授，研究方向:中药质量控制及新药开发。
基金项目:贵州省应用化学特色重点学科(黔教科研发［2012］442 号) ;贵州省教育厅特色重点实验室项目(黔科合 KY［2012］005 号) ;贵州师范
学院科学研究项目(201209)。
摘 要:目的:确定水黄芹中总黄酮的最佳提取工艺，并评价其抗氧化活性。方法:在单因素实验基础上，利用响应面
法优化水黄芹总黄酮的提取条件;通过总黄酮对 DPPH·和 ABTS·的清除作用来研究其抗氧化活性。结果:水黄芹总黄
酮最佳提取工艺为乙醇浓度 74%、料液比 1 ∶30(g /mL)、提取温度 72℃、提取时间 115min，此条件下，总黄酮得率为
1.59%，与预测值 1.60%接近，其偏差为 0.63%。水黄芹总黄酮对 DPPH·和 ABTS·具有较好的清除能力，其 IC50值分别
为 7.67、12.88μg /mL。
关键词:水黄芹，总黄酮，响应面法，抗氧化
Optimization of extracting total flavonoids from Phyla nodiflora(L.)
by response surface methodology and its antioxidant activity
GAN Xiu－hai1，LIANG Zhi－yuan1，DAI Xiong1，ZHAO Chao2，ZHOU Xin2，*
(1.The School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal College，Guiyang 550018，China;
2.The Ｒesearch Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)
Abstract:Objective:To explore the optimum extraction process of total flavonoids from Phyla nodiflora(L.)and
evaluate the antioxidant activity. Methods:Based on the single － factor tests，the extraction conditions of total
flavonoids from Phyla nodiflora(L.)were optimized by response surface methodology.Meanwhile，the antioxidant
activity of total flavonoids was assessed by scavenging assays of DPPH· and ABTS· Ｒesults:The optimum
extraction conditions were as follows:ethanol concentration 74%，liquid － solid ratio 1 ∶ 30，extraction temperature
72℃ and extraction time 115min.Under the optimal conditions，the extraction rate of total flavonoids was 1.59%，
which was close to the predicted value 1.60% with 0.63% bias.In addition，DPPH·and ABTS· radical scavenging
capacity of total flavonoids was better，and IC50of it was 7.67μg /mL and 12.88μg /mL，respectively.
Key words:Phyla nodiflora(L.) ;total flavonoids;response surface analysis;antioxidant
中图分类号:TS201.2 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)13－0238－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 13． 042
水黄芹为马鞭草科植物过江藤(Phyla nodiflora
(L.)Greene)的全草，我国主要分布于西南及江苏、江
西、福建等地。水黄芹又名苦舌草、番梨仔草等，全
草入药，能清热解毒。主治咽喉肿痛、牙疳、泄泻、痢
疾;外用治痈疽疮毒、带状疱疹、湿疹、疥癣等，民间
用全草和肉炖食治黄肿病［1］。目前有关化学成分的
研究报道主要集中在印度产的过江藤，其中含有较
多的黄酮类、黄酮醇类及多酚类成分，其总黄酮含量
为 60.88mg /g［2－5］。黄酮类化合物具有广泛的药理作
用，如:抗菌、抗肿瘤、抗氧化等作用，已被应用于食
品、药品、保健品及化妆品等领域［6－8］。但目前对于国
内产的水黄芹化学成分及抗氧化作用研究均未见
报道。
因此，本实验以总黄酮提取率为指标，采用乙醇
回流法对水黄芹总黄酮的提取工艺进行研究，在单
因素实验的基础上通过响应面法优化了乙醇体积分
数、料液比、提取温度、提取时间，同时测定了水黄芹
总黄酮对 DPPH·和 ABTS·的清除能力，以期为水黄
芹资源综合开发与利用提供科学依据。
1 材料与方法
239
1.1 材料与仪器
水黄芹全株 购于贵州省贵阳市万东桥药材市
场，经贵州师范学院朱富寿教授鉴定为过江藤(Phyla
nodiflora(L.)Greene)的全草;芦丁标准品 购于中国
药品生物制品检定所，批号 111521－200303，供含量
测定用;1，1 －二苯基苦基苯肼(DPPH)，2，2 －联
氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐(ABTS) ，
购于 Sigma公司;维生素 C，购于北京市金诺欣成化
工有限公司;其它试剂均为分析纯。
Cary－100 紫外－可见分光光度计 美国瓦里安
公司;Spectra Max Plus 384 光吸收酶标仪 美国
Molecular Devices公司;BSC－150 恒温恒湿箱 上海
博讯实业有限公司;XFB－200 型中药粉碎机 长沙
市中南制药机械厂;AL204 型电子分析天平 瑞士
梅特勒－托利多公司;KQ－50B 型超声波清洗器 昆
山市超声波仪器有限公司;Direct－Q3 型超纯水制备
系统 密理博有限公司;HH－ 8 型电热恒温水浴
锅 上海梅香仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 水黄芹总黄酮的提取 水黄芹全草，粉碎，过
60 目筛，称取 1.0g于锥形瓶中，用一定体积分数的乙
醇按一定料液比、提取温度、提取时间加热提取，趁
热抽滤，取滤液定容至 50mL，即得水黄芹总黄酮提
取液。
1.2.2 单因素实验 以乙醇浓度、料液比、提取温度
及提取时间 4 个因素进行单因素实验，平行 3 次，确
定影响水黄芹总黄酮得率的适宜单因素条件。
1.2.2.1 乙醇浓度的确定 在料液比 1∶20、提取温度
70℃、提取时间 120min 的条件下，分别考察 40%、
50%、60%、70%、80%及 90%的乙醇溶液对水黄芹
总黄酮得率的影响。
1.2.2.2 料液比的确定 在乙醇浓度 70%、提取温度
70℃、提取时间 120min 的条件下，分别测定 1 ∶ 10、
1∶20、1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60(g /mL)料液比条件下水
黄芹总黄酮的得率。
1.2.2.3 提取温度的确定 在乙醇浓度 70%、料液比
1∶20、提取时间 120min 的条件下，分别考察 40、50、
60、70、80、90℃不同提取温度对水黄芹总黄酮得率
的影响。
1.2.2.4 提取时间的确定 在乙醇浓度 70%、料液比
1∶30、提取温度 70℃的条件下，考察 30、60、90、120、
150 及 180mim不同提取时间对水黄芹总黄酮得率的
影响。
1.2.3 响应面实验 在单因素实验的基础上，选择
乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间
(D)，利用 Design － Expert 8.0.6 软件中的 Box －
Behnken功能，以总黄酮提取率为响应值，采用四因
素三水平的响应面分析法优化水黄芹总黄酮的提取
条件，各因素水平设计见表 1。
1.2.4 标准曲线的绘制 以芦丁标准品为对照品，
按 NaNO2－Al(NO3)3 －NaOH 法
［9－10］绘制吸光度值 A
与芦丁浓度 C(mg /mL)的标准曲线。
1.2.5 总黄酮提取率的计算 采用以上方法测定样
品溶液的吸光度，由回归方程求出黄酮质量浓度，并
按下式计算总黄酮得率。
总黄酮得率(%)=
C × V0 × V1 × 100
V2 ×m × 1000
式中:C 为测量液的总黄酮浓度，mg /mL;V0 为
提取液的定容体积，50mL;V1 为测量液的定容体积，
10mL;V2 为测量时量取的体积，1.0mL;m为水黄芹干
粉的质量，1.0g。
表 1 Box－Behnken实验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels used
in the Box－Behnken design
水平
因素
A乙醇浓度
(%)
B料液比
(g /mL)
C提取温度
(℃)
D提取时间
(min)
－ 1 60 1∶20 60 60
0 70 1∶30 70 120
1 80 1∶40 80 180
1.2.6 总黄酮对 DPPH·清除能力测定 参照文献［11］
的方法，将样品及阳性对照品 VC 用甲醇配制成一系
列浓度，测定不同浓度样品及阳性对照品在 515nm
处的吸光度，每份样品和阳性对照品平行操作 3 次，
取平均值，计算出清除率，并计算出半数抑制率
IC50值。
1.2.7 总黄酮对 ABTS·清除能力测定 依据文献［12］
方法，将样品用甲醇配制成一系列浓度，测定不同浓
度样品及阳性对照品在 734nm处吸光度。每份样品
平行操作 3 次，取平均值，计算清除率，并计算出半
数抑制率 IC50值。
1.3 数据处理
所有数据均为 3 次重复实验的平均值，运用
Excel数据处理软件和 Design－Expert 8.0.6 统计软件
进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
回归方程为:A = 11.811C－0.0159，Ｒ2 = 0.9998，
表明芦丁质量浓度(C)在 0.002～0.064mg /mL内与吸
光度(A)有良好线性关系。
2.2 单因素实验结果与分析
2.2.1 乙醇浓度对水黄芹总黄酮得率的影响 如图
1 所示，水黄芹总黄酮得率随乙醇浓度的增大先增大
后减小。当乙醇浓度在 70%时，其得率最高;乙醇浓
度大于 70%后，总黄酮得率随乙醇浓度的增大而逐
渐降低。这可能是因为乙醇浓度过低时，提取液中
含有较多的糖类、蛋白质等水溶性物质;而乙醇浓度
过高，脂溶性物质溶出较多，影响总黄酮的溶出，因
此确定 70%乙醇浓度为最佳条件。
2.2.2 料液比对水黄芹总黄酮得率的影响 由图 2
可知，随料液比的增大，水黄芹总黄酮得率增大，当
料液比达到 1∶30(g /mL)后，得率增大减缓。这说明
此时总黄酮已基本溶出，增加溶剂的量并不能明显
提高总黄酮的提取量，因此确定最佳料液比为 1 ∶30
(g /mL)。
240
图 1 乙醇浓度对黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration flavonoids extraction
图 2 料液比对黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of material－to－liquid ratio
on flavonoids extraction
2.2.3 提取温度对水黄芹总黄酮得率的影响 如图
3 所示，水黄芹总黄酮得率随提取温度的升高先增大
后减小。当温度为 70℃时，总黄酮的得率达最高值;
当温度高于 70℃后，总黄酮的得率随温度的升高反
而降低。这可能是因为温度过高，黄酮的稳定性降
低，进而含量降低。因此，选择提取温度为 70℃。
图 3 提取温度对黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction
2.2.4 提取时间对水黄芹总黄酮得率的影响 由图
4 可知，水黄芹总黄酮得率随提取时间的延长而增
大，当时间为 120min时，总黄酮的得率达较高值;继
续延长提取时间，对总黄酮的得率影响较小，这说明
120min总黄酮已基本溶出。因此，为了节约时间，降
低能耗，选择提取时间为 120min。
2.3 响应面法优化总黄酮提取工艺
2.3.1 实验设计及结果 以单因素实验结果为基
础，利用 Design－Expert 8.0.6 软件优化水黄芹总黄酮
的提取条件，其设计方案及结果见表 2。
利用 Design－Expert 8.0.6 统计软件对表 2 数据
图 4 提取时间对黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of time on flavonoids extraction
进行二次多项式回归分析［13－14］，得到总黄酮提取率
(Y)对因素 A、B、C 及 D 相应的二次方程模型:Y =
1.588 + 0.109A－0.003B－0.017C + 0.021D－0.003AB +
0.023AC－ 0.016AD － 0.017BC － 0.011BD + 0.010CD －
0.160A2－0.082B2 －0.065C2 －0.089D2。同时对表 2 中
的数据进行多元回归分析，其结果见表 3。
表 2 响应面实验设计及结果
Table 2 Experiment design and result of ＲSM
实验号 A B C D
Y得率
(%)
1 1 0 0 － 1 1.431
2 1 － 1 0 0 1.457
3 － 1 1 0 0 1.235
4 － 1 0 1 0 1.216
5 0 0 0 0 1.578
6 0 － 1 0 1 1.467
7 1 0 0 1 1.456
8 0 0 1 1 1.452
9 0 1 － 1 0 1.471
10 0 0 － 1 1 1.435
11 1 0 － 1 0 1.482
12 0 1 0 1 1.425
13 1 0 1 0 1.472
14 － 1 0 0 1 1.276
15 － 1 0 0 － 1 1.189
16 0 － 1 0 － 1 1.403
17 0 0 0 0 1.593
18 － 1 － 1 0 0 1.217
19 － 1 0 － 1 0 1.319
20 0 － 1 － 1 0 1.443
21 0 1 0 － 1 1.404
22 0 0 － 1 － 1 1.428
23 0 0 0 0 1.585
24 1 1 0 0 1.461
25 0 0 0 0 1.598
26 0 0 1 － 1 1.403
27 0 0 0 0 1.587
28 0 － 1 1 0 1.438
29 0 1 1 0 1.398
由表 3 可看出回归方程拟合检验 p ＜ 0.0001，差
异极显著，说明模型的预测值和实际值非常吻合，模
型可靠。回归方程相关系数 Ｒ2 = 0.9900，显示响应值
241
表 3 回归模型参数检验
Table 3 Parameter estimate of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F p 显著性
模型 0.36 14 0.026 98.58 ＜ 0.0001 ＊＊＊
A 0.14 1 0.14 548.65 ＜ 0.0001 ＊＊＊
B 8.008E－005 1 8.008E－005 0.31 0.5873
C 3.300E－003 1 3.300E－003 12.72 0.0031 ＊＊
D 5.334E－003 1 5.334E－003 20.56 0.0005 ＊＊＊
AB 4.900E－005 1 4.900E－005 0.19 0.6705
AC 2.162E－003 1 2.162E－003 8.33 0.0119 *
AD 9.610E－004 1 9.610E－004 3.70 0.0749
BC 1.156E－003 1 1.156E－003 4.46 0.0533
BD 4.622E－004 1 4.622E－004 1.78 0.2033
CD 4.410E－004 1 4.410E－004 1.70 0.2134
A2 0.16 1 0.16 627.85 ＜ 0.0001 ＊＊＊
B2 0.044 1 0.044 170.05 ＜ 0.0001 ＊＊＊
C2 0.028 1 0.028 106.36 ＜ 0.0001 ＊＊＊
D2 0.051 1 0.051 196.80 ＜ 0.0001 ＊＊＊
残差 3.632E－003 14 2.595E－004
失拟项 3.398E－003 10 3.398E－004 5.79 0.0526
绝对误差 2.348E－004 4 5.870E－005
总差离 0.36 28
注:＊＊＊差异极显著(p ＜ 0.001) ;＊＊差异高度显著(p ＜ 0.01) ;* 差异显著(p ＜ 0.05)。
的变化 99.00%来源于乙醇浓度(A)、料液比(B)、提
取温度(C)、提取时间(D)四个变量;同时失拟检验
p ＞ 0.05，说明未知因素对实验结果影响较小。因此，
建立的回归方程能准确地描述响应值与各因素之间
的真实关系。另外，各因素一次项 A、D 及二次项
A2、B2、C2、D2 对黄酮提取的影响极显著，C(提取温
度)对黄酮提取的影响高度显著。由 F 值可得出各
因素对总黄酮提取率的影响程度大小顺序为乙醇浓
度 ＞提取时间 ＞提取温度 ＞料液比。
2.3.2 各因子交互作用对黄酮得率影响的分析 利
用软件，在其它因素为零水平上，选择乙醇浓度、料
液比、提取温度、提取时间四个变量中的两个交互因
素对总黄酮得率的影响进行分析，回归优化得到相
应的响应面图及等高线图，等高线图的形状可反映
因素间交互作用的强弱，图形趋向椭圆且椭圆轴线
与坐标轴的角度越大，则交互作用越明显，反之则交
互作用越弱［15］。由此分析所有等高线图与相应曲
面，其中显著交互项的响应曲面见图 5，由图可知，在
一定范围内，总黄酮得率随乙醇浓度和提取温度的
提高而增大，在交互作用等高线中，等高线沿 A 轴方
向变化相对密集，说明乙醇浓度对响应值峰值的影
响大于提取温度，与回归分析结果相同。
2.4 最佳提取工艺及验证
结合回归模型的数学分析结果，水黄芹总黄酮
的最佳提取工艺为乙醇浓度 73.4%、料液比 1 ∶29.7
(g /mL)、提取温度 71.9℃、提取时间 115.2min，此条
件下的预测得率为 1.61%。考虑到实际操作的便
利，将水黄芹总黄酮的最佳提取工艺参数修正为:乙
醇浓度 74%、料液比 1∶30(g /mL)、提取温度 72℃、提
图 5 乙醇浓度和提取温度交互作用
对总黄酮得率的响应面图
Fig.5 Ｒesponse surface plots showing the effect of
ethanol concentration and extraction temperature
取时间 115min，此条件下总黄酮的理论得率为
1.60%。以最佳提取工艺条件，重复三次实验，得到
水黄芹总黄酮的得率为 1.59%。两者相比，相对误
差约为 0.63%，说明响应面法优化结果可靠。
2.5 抗氧化能力的测定
总黄酮样品及阳性对照品 VC 对两种自由基的
清除能力如图 6 及图 7。由图 6、图 7 可知，水黄芹总
黄酮对 DPPH·和 ABTS·的清除能力随浓度的增加而
增大，当清除率达到 50%时，所需的总黄酮浓度 IC50
分别为 7.67、12.88μg /mL，弱于阳性对照 VC(分别为
6.05、9.92μg /mL)。
3 结论
本实验在考察乙醇浓度、料液比、提取温度、提
取时间对总黄酮得率影响的基础上，采用 Design－
Expert 8.0.6 软件中的 Box－Behnken 方法设计响应面
实验优化水黄芹总黄酮的提取工艺。通过方差分析
242
图 6 VC 与水黄芹总黄酮对 DPPH·的清除能力
Fig.6 DPPH·radical scavenging activities of
VC and total flavonoids from Phyla
图7 VC 与水黄芹总黄酮对 ABTS·的清除能力
Fig.7 ABTS·radical scavenging activities of
VC and total flavonoids from Phyla
得到各因素对总黄酮得率的影响作用为:乙醇浓度 ＞
料液比 ＞提取时间 ＞提取温度。优化后总黄酮的最佳
提取工艺为:乙醇浓度 74%、料液比 1∶30(g /mL)、提取
温度 72℃、提取时间 115min，此条件下水黄芹总黄酮
的得率为 1.59%，与预测值基本相符。抗氧化活性表
明，水黄芹总黄酮对 DPPH·和 ABTS·具有较好的清除
作用，但均弱于阳性对照 VC。本研究为后续水黄芹的
研究与合理开发提供了一定的理论参考依据。
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